• 한국수정란이식학회지
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• 제20권2호
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• pp.163-168
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• 2005

혈통이 등록된 우수한 한우 공란우로부터 회수한 수정란을 간편한 방법으로 성 판별하여 우수한 암송아지를 생산하고자 실시한 결과는 다음과 같다. 회수한 수정란을 punching 또는 bisection 방법으로 biopsy하여 Loop-mediated isothermal amplification법으로 성 판별하였으며, 암컷으로 예측되는 성 판별 수정란을 6두의 수란우에 이식하여 2두가 임신되었고, 수정란 이식 후 278일과 285일에 정상적인 암컷 송아지를 각각 분만하였다. 분만된 송아지 바란이와 보란이의 생시체중은 각각 18kg 및 25kg이었으며, 90일령 보정체중은 각각 61.1kg 및 88.8kg으로 일당증체량은 0.48kg 및 0.71kg이었다.

• 한국수정란이식학회지
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• 제22권3호
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• pp.173-178
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• 2007

돼지 정자의 성 선별에는 일반적으로 유속 세포 분석기를 이용한다. 유속 세포 분석은 DNA량의 차이에 기초하여 정자를 분리하는 기술로써 X 정자와 Y 정자를 90% 정확도로 분리할 수 있다. 그러나 이러한 유속 세포분석 기술은 정자의 손상을 야기해 정자의 기능과 수정능에 영향을 미치므로, 본 연구에서는 특정한 핵산 서열을 탐지할 수 있는 Chromogenic in situ hybridization(CISH)을 그와 비교하여 평가하였다. 유속 세포 분석을 수행하기 위해 정자를 SYBR 14와 PI로 염색하였고, histogram, dotplot, density, contour를 측정하였다. Y 염색체 특이적인 primer를 이용한 PCR로 유속 세포 분석의 정확도를 검사하였다. HRP/DAB 시스템에 기초한 CISH 분석에는 X 또는 Y 염색체에 상보적으로 결합하는 probe가 사용되었다. CISH 분석은 기존의 방법들보다 빠르고 쉬우며 비용이 적게 든다는 장점이 있다. 또한, CISH는 보다 정화한 정자의 선별을 가능하게 하는 것으로 나타났다. 본 연구에 따르면 CISH가 기존의 선별 방법들을 평가하는 기술로서만이 아니라 특정한 성별을 가진 포유동물의 생산에도 사용될 수 있을 것이다.

• 한국동물번식학회:학술대회논문집
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• 한국동물번식학회 2001년도 춘계학술발표대회
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• pp.40-40
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• 2001

Heat stress to bovine oocytes and embryos has suggested a potential role of retardation of their development. Limited study has reported on the effect of heat shock on sperm before using it for IVF. Caudal epididymal sperm cultured in 42$^{\circ}C$ incubator for 0.5, 1 and 2 h compared on sperm viability and oocyte development after its use for IVF to those of control. Oocytes were matured for 22 h and then inseminated with treated or control sperm for 16 h. Embryos were cultured in CRlaa medium, transferred to TCM199＋10% FBS on day 4, and maintained on day 9. A higher proportion (84.1%, 0.5 h; 72%, 1 h: 65%, 2 h) in treated sperm was observed dead and abnormal pattern as 100% of consider as control. In control the rates of cleavage and development into blastocyst were 76% and 22%, respectively, and did not differ the rates between 1 h and 2 h of culture. Significant differences were appeared in the rates between treated for an hour and control (32% and 5% vs. 54% and 10%, respectively). Moreover increased time of culture is more retardation to be cleaved the oocytes. However, the rates of blastocyst from cleaved embryos in treated group similar to control (25% vs. 29%, respectively). The reason for this remains unclear, but male sperm, from preliminary experiment(data un-shown) for sexing of resulting embryos, would be more fragility on heat stress.

• 한국가축번식학회지
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• 제20권2호
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• pp.89-99
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• 1996

The purpose of this study was to develop the diagnosis techniques for sex determination of rabbit embryos at preimplantation stage. To detect male specific sequences using polymerase chain reaction, two genes functional on sex determination including SRY and ZFX/Y genes were targeted using multiple oligonucleotide primer sets. Three of them for conserved SRY gene were used for appropriate amplification pattern, and then only one primer set #3 proved to be most efficient, showing male-specific strong signal ofamplified sequences. Using this male specific bandsfrom human, cattle, pig and mouse, the gender of rabbit was determined. As an another system for sex determination system, amplified 910bp fragment from ZFX/Y was digested with several restriction endonuclease and showed gender specific restriction fragments only by Hinf I. Using two different system for sex identification of rabbit in this study, blind tests for 17 samples was conducted and showed identical results from two different methods. And then, amplification limit of PCR reaction for template DNA was estimated using various amounts of DNA for both SRY and ZFX/Y systems, resulted as 20pg and 800pg, respectively. With this results, test for gender identification of rabbit embryos were performed using SRY derived amplification system. From total 22 embryos selected for its developmental state 18 were identified as male embryos, showing significant difference from expected sex ratio 1:1. This biased sex ratio was interpreted as to have been caused by the fact, reported by the fact, reported by several researchers, that male embryos develop more rapidly and are more resistant against the in vitro manipulation than female embryos.

• 한국가축번식학회지
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• 제20권3호
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• pp.323-331
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• 1996

포유동물에 있어서 조기 성 판정기술은 축산에 있어서의 성별 육종프로그램이나 인간의 X-염색체 관련 열성유전병의 산전진단 등 여러 분야에 응용될 수 있다. 초기배에 대한 성 판정은 성염색체에 존재하는 특이한 염기서열을 증폭시키는 polymerase chain reaction (PCR)과 X와 Y 염색체에 대한 특이적 probe를 이용하는 fluorescent in situ hybridization (FISH)에 의하여 수행될 수 있다. 1992년과 93년, 2개년도에 걸쳐 본 연구실에서 돼지의 3.3 kb 웅성특이 DNA 절편(pEM39)을 cloning하였다. 본 연구는 pEM39가 성특이 DNA-probe로 이용될 수 있는지를 조사하기 위해 PCR과 FISH를 이용하였다. 돼지 난자는 도축장에서 구입한 돼지 난소로부터 채취되었고, 체외배양후 체외수정되었다. 한편 처녀발생나자를 negative control로 이용하였다. 2 세포기의 수정란을 선발한 후 PCR을 통하여 DNA를 분석한 결과, 10개의 수정란 중 6개는 자성, 다른 4개는 웅성으로 판정되었으며, FISH를 수행한 결과, done된 웅성특이 DNA 단편은 돼지 간조직과 초기배에서 웅성특이성을 보였다. 또한 FISH와 karyotyping을 수행한 결과 clone된 웅성특이 DNA 단편이 Y 염색체 q-arm의 heterochromatic region에 위치함을 알 수 있었다. 이러한 결과로 보아 clone된 웅성특이 DNA 단편이 초기배의 성을 조기판정하는데 있어 유용하리라 사료되며, PCR에 의한 초기배의 성 판정에 있어 신뢰할만할 지표가 될 수 있을 것이다.

• 한국가축번식학회지
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• 제20권4호
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• pp.443-451
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• 1997

These studies were conducted to determine the sex of preimplantation Hanwoo embryos produced in vitro using polymerase chain reaction(PCR). Y chromosome specific and bovine speicific DNA primers were synthesized and tested for embryo sexing. Bovine IVF embryos were produced in TCM 199 and CR1aa medium, and classified by developmental stages on Day 7 to 9. The effects of developmental rates to bovine IVF blastocysts on sex ratio were also investigated using PCR methods. The results obtained in this study were as follows; 1. Developmental rates to blastocyst from IVM/IVF embryos in TCM 199 and CR1aa medium for 9 days were 23.5 and 30.2%, respectively, and there was significant difference between the media(P<0.05). 2. Male to female ratio of early, mid, expanded and hatching balstocyst produced on Day 7 were 0.7:1, 1.4:1, 2.2:1, and 2.5:1, respectively, and male embryos was significantly higher proportion in expanding and hatching blastocysts(P<0.01). 3. On Day 8, male to female ratio of early, mid, expanded and hatching blastocysts were 0.6:1, 1:1, 2.5:1, and 2.7:1, respectively. Both expanded and hatching blastocysts obtained a significantly higher proportion of males(P<0.01). 4. The male : female ratio of early, mid, expanded and hatching blastocyst produced on Day 9 was 0.6:1, 0.8:1, 1:1, and 2.2:1, respectively. Hatching blastocysts had a significantly higher ratio of males(P<0.01). The developmental rate of IVM/IVF embryos to blastocyst for 9 day culture was higher in CR1aa than that in TCM 199 medium. For the sex ratio by developmental stages of IVF embryos, male ratio was higher in expanded blastocyst but female in early blastocysts.

• 한국가축번식학회지
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• 제15권3호
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• pp.179-187
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• 1991

This experiment was carried out to develop a new technique of identifying XX of XY-bearing bisected embryos prior to implantation by immunological method. H-Y antiserum prepared in inbred Wastar female rats by repeated immunization with spleen cells from males of the same strain. The reactivity of H-Y antibody was confirmed by culturing mouse embryos in the medium containing H-Y antiserum and complement obtained from the guinea pig. The optimal condition for the activity of H-Y antibody was also investigated by culturing embryos under the concentraton or affected H-Y antibody was also investigated by culturing embryos under the concentration or affected H-Y antibody and culture rate. However, production of live young or sex rates of male and female from embryos transferred with psudopregnant. The biological test with the morula stage embryos showed that H-Y antibody was formed in all female rats immunized with spleen cell, but it was formed only in 80% female rats immunized with the antigen. When the bisected mouse embryos were cultured in vitro for 5~6 hours in morula stage, of 457 bisected embryos 81.4% of then were developed to the blastocyst stage. When the concentration rate of complement to H-Y antiserum varied from 1.0~5.0${mu}ell$, the lysis-rate of embryo was 19.5 to 67.3%. The concentration rate of complement did not influence the lysis-rate of embryos(P<0.05). The morphology embryos of bisected, zona-free and intact embryos showed the embryos lysis rate of 58.6, 42.7 and 48.5% respectively(P<0.05). Pregnancy rate were 50.0, 45.5 and 57.1% in psudopregnant recipient transferred with bisected, zona-free and intact blastocyst embryos. However, production of live youngs, sexual rate of male or female was 24(50.0:50.0), 22(45.5:55.5) and 36(58.3:41.7)mice, but affected and non affected half embryos with H-Y antiserum treatment was 23.1 and 26.7%. Also production of live youngs and sexual rate was 14(92.9:7.1) and 17(17.6:82.4)mice in affected and non affected half embryos in H-Y antiserum treatment(P<0.05).

• Clinical and Experimental Reproductive Medicine
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• 제23권3호
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• pp.341-349
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• 1996

초기배의 성판정은 대상가축의 성을 선발하는 수단으로써 뿐만아니라 인간의 유전적 질병의 조기진단법으로서 매우 가치가 크다. 체외수정 소 초기배의 성을 결정하기 위해 PCR과 PRINS를 이용하였으며 성판정에 이용된 8 세포${\sim)$배반포기 초기배는 체외수정후 난관상피세포와의 공배양에 의해 생산되었다. 초기배 의 DNA는 $200{\mu}g/ml$ proteinase K가 함유된 PCR lysis buffer에 하나의 초기배를 부유한 후 $50^{\circ}C$에서 1시간동안 처리하여 준비하였다. 중기 염색체 spreads는 초기배를 nocodazole로 처리한 후 air-drying 방법을 이용하여 준비하였다. 가능한 false positive signals을 배제하기 위해 소특이 및 Y 염색체 특이 primers를 이용하여 PCR을 수행한 결과, 웅성 초기배에서는 두 개의 증폭산물 (소특이 및 Y 염색체 특이)이 합성된 반면 자성 초기배에서는 하나의 증폭산물만 합성되었다. 한편 중기염색체상의 Y 염색체를 동정하기 위해 FISH와 PRINS를 수행한 결과, FISH에서보다 PRINS에서 더 강한 Y 염색체 특이 형광 signals이 탐지되었다. 이러한 결과는 PCR에 의한 체외생산 소 초기배의 신속정확하고 효율적인 성판정이 가능함을 보여주었다. 또한 PRINS를 통해 PCR 에 이용된 Y 특이 probe의 신뢰성이 염색체 수준에서 확인되었다.

• 한국수정란이식학회지
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• 제23권1호
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• pp.43-49
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• 2008

본 연구는 한우 체외 수정란의 성 감별과 신선란, 동결란 및 성 감별 수정란을 이식한 후 수태율, 분만율과 유산율, 생시 체중, 임신 기간을 조사하기 위하여 수행하였다 Aspiration과 punching법으로 biopsied한 수정을 24시간 배양 후 생존율은 각각 80.0%와 90.0%로 유의적인(p>0.05) 차이는 없었다. 수정란을 성 감별한 결과, 웅성 수정란과 자성 수정란의 비율은 각각 42.1%와 52.6%였으며, 5.3%는 수정란의 성을 판정하지 못하였다. hCG를 처리한 수란우의 수태율은 46.4%로서 무처리구(38.5%)에 비하여 높은 경향이었으나, 처리구간의 유의적인 차이는 없었다. 신선란과 동결란을 수정란 이식 후 수태율은 각각 41.3와 35.0%로서 유의적인 차이는 없었다. 성 감별된 수정란과 성 감별하지 않은 체외 수정란 이식 후 수태율은 각각 27.5와 42.1%로 유의적인 차이는 나타나지 않았다. 성 감별 된 수정란과 성 감별하지 않은 체외 수정란 유래 송아지의 분만율은 각각 85.0와 87.0%이었으며, 유산율은 각각 15.2와 13.3%로서 분만율과 유산율은 유의적인 차이는 없었다. 성 감별된 수정란과 성 감별하지 않은 체외 수정란 유래 송아지의 임신 기간은 각각 281.3일(female), 283.0일(male)과 288.2일(female), 282.3일(male)이었으며, 생시 체중은 각각 23.6(female), 24.6(남)과 25.0(female), 23.8 kg(male)로 유의적인 차이는 없었다. hCG 처리한 수란우는 한우 수정란 이식 후 수태율 개선 효과는 있는 것으로 판단된다. 성 감별 수정란 이식에 의해 송아지는 생산되었으나, 수정란의 biopsy 방법, 수정란 이식 후 수태율 개선과 같은 송아지 생산 효율을 개선해야 할 것으로 사료된다. 수정란 이식의 산업화가 정착하기 위해서는 동결란과 신선란 이식 후 수태율의 개선에 대한 노력이 필요할 것으로 사료된다.

• 한국수정란이식학회지
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• 제26권3호
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• pp.181-186
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• 2011

Spermatozoa sorted by flow cytometry have been successfully used to produce offspring in domestic animals and are commercially available for cattle. Also sheath fluid is the important environment for viability of sex-sorted sperm in flow cytometry. The aim of this study was to investigate whether or not HEPES (N-2-hydroxyethylpiperazine-N'-2-Ethanesulfonic acid) has any effect on the viability in sex-sorted Hanwoo (Korean native cattle) sperm. In this study, the semen was collected from Hanwoo of Hoengseong Livestock Cooperation by artificial vagina method then pooled and subjected to cryopreservation in straws. Sperm were cultured for 0, 30, 60 and 120 min with 0, 2.5, 5, 7.5 and 10 mM of HEPES added to the sheath fluid and incubated at 4, 20 and 38$^{\circ}C$, respectively. For the cytometric analysis the frozen-thawed semen was extended with 5 mM HEPES extender to final concentration ($2{\times}10^7$ spermatozoa) at 4, 20 and 37$^{\circ}C$. Sperm viability was assessed with SYBR-14 and propidium iodide (PI) staining. This study shows that the viability of sperm was decreased with prolongation of incubation time in all of test. But the viability of sperm which were treated with 38$^{\circ}C$ was gently decreased than that of treated with other temperature. The viability of the control was sharply decreased (p<0.05) than all of the HEPES treatment group at 60 to 120 min in 38$^{\circ}C$. X-sexed sperm was more sensitive than Y-sexed sperm to temperature during f10w cytometry (p<0.05). In conclusion, the results of this study suggest that the sheath fluid with 5 mM HEPES has effect on maintenance of viability after sperm sexing at 37$^{\circ}C$ in Hanwoo.