• 한국동물번식학회:학술대회논문집
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• 한국동물번식학회 2001년도 춘계학술발표대회
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• pp.57-57
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• 2001

Erythropoietin(EPO)는 혈액의 구성성분 중에서 적혈구 세포 증식에 중요한 기능을 한다고 알려져 있으며, 최근에는 암, 에이즈의 치료 등에도 효과가 있는 것으로 확인되고 있다. 따라서 본 연구팀은 지금까지 hEPO 유전자를 이용하여, 형질전환 돼지 "새롬이"의 생산에 성공한바 있다. 새롬이의 정액을 활용하여 인공수정을 실시 새롬이의 Fl를 24두 생산하였다. 이에 대하여 "형질전환 돼지의 계대번식시 유전자 전이효율에 관한 연구"라는 제목으로 발표 할 예정이며, 형질전환에 사용된 promoter가 WAP이므로, Fl이 임신, 분만을 하여야만 유즙을 통하여 hEPO물질을 생산할 수 있다. 따라서, Fl(♂)$\times$Fl(♀)의 교배에 의하여 5두가 임신, 분만을 하였으며, 이들 중 1두는 분만 후 21일에 폐사하였으며, 나머지는 현재 정상적으로 사육되고 있다. 이들 5두에 대하여 분만 후 유즙을 채취하여 유즙속에 EPO의 발현여부를 검토하였다. EPO-ELISA kit(medac)를 사용하여 분석결과, 유즙을 8,000배로 희석을 하여야만 Standard curve(1.25~160 mIU/$m\ell$)안에서 EPO의 단백질 발현을 검출할 수 있었다. 5두의 각각 농도는 28, 58, 17, 37, 27 IU/${\mu}\ell$ 였다. 또한 cDNA EPO와 genome EPO를 CHO 동물세포에서 생산하여 10배로 농축한 결과 5.5와 11 IU/${\mu}\ell$의 농도로 유즙과 비교하면 약 20~30배의 낮은 발현양을 나타내었으며, 또한 이러한 결과는 소변에서의 결과(1.1 IU/$m\ell$)보다는 약 30,000배 이상 높은 발현량을 화인 할 수 있었다. 현재, 이들 유즙 물질을 활용 빈혈 질환실험동물을 이용하여 생리활성을 검정, 체내에서 metabolic clearance rate(MCR)를 검토 중에 있다. 또한 F2의 자돈생산은 모돈 5두에서 총 25두가 생산되었는데, 이중 20두 약 80%가 EPO 유전자의 전환율을 나타내었다. 이상을 종합하면, 1) 돼지이용 생리활성물질(EPO)을 유즙에서 대량으로 생산할 수 있는 system의 활용가능성을 국내에서 처음으로 확인하였으며, 2) EPO에 있어서는 국제적으로도 형질전환 가축생산은 최초로 성공하였으며, 현재로서는 생산되어진 물질의 정제수준에 따라 활용가치가 결정되어 질 것으로 사료된다. 생리활성 물질을 생산할 수 있는 형질전환 돼지 생산의 성공은, 앞으로 형질전환 가축생산 뿐 만 아니라, 장기이식 및 복제돼지 생산의 활용 면에서의 응용가능성이 기대된다.

• 한국동물번식학회:학술대회논문집
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• 한국동물번식학회 2001년도 춘계학술발표대회
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• pp.55-55
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• 2001

Erythropoietin(EPO)는 적혈구 세포 증식, 분화 및 생존에 있어서 가장 중요한 요인이다. 또한, 빈혈성저산소증에 있어서도 EPO가 중요한 역할을 한다고 알려져 있다. 태아에서 EPO 생산부위는 간이라고 알려져 있으나, 임신 120-140일에 신장으로 이동하기 시작하여 출생 후 약 40일경 이후에는 완전히 신장에서만 분비한다 EPO단백질의 분비는 오전 8시에 가장 낮고 오후 8시에 가장 높은 2중 리듬의 형태로 발현되어진다. EPO는 27개의 leader sequence와 165개의 아미노산으로 총 193개의 아미노산으로부터 분비된다. EPO단백질의 분자량은 18 kDa이나, 약 40%의 당쇄가 첨가되어있는 당단백질으로서 분자량은 30 kDa이다 N-linked 당쇄 3개(Asn-24, 38 및 83)와 O-linked 당쇄 1개(Ser 126)의 첨가부위가 존재하며, 2개의 disulfide bridges(7-161번, 29-33번)를 형성하고 있다. 이러한 당쇄의 수식은 EPO의 대사에 있어서 매우 중요하다. EPO를 가축의 소변으로부터 생산하기 위하여 생쥐의 3.6 kb UII promoter 하류에 genome hEPO와 SV 40 poly A를 연결하여 형질전환용 발현 벡터를 구축하였으며, 과배란 유기로 채란되어진 돼지의 1-세포기 수정란의 웅성전핵에 유전자를 미세주입기로 주입 후 즉시 대리모에 이식하였다. 66두에 미세주입된 1572개의 수정란을 외과적 방법으로 이식, 평균 23개의 수정란을 이식하였다. 생산된 자돈 112두중 2두(3-5, 3-15번)에서 PCR양성반응(304, 567bp)을 나타내어, 2두의 돼지로부터 소변을 회수하였다. 회수된 소변을 이용 Elisa방법으로 EPO를 분석한 결과 3-5번 돼지에서만 분만 후 지속적으로 EPO농도가 증가되었다. EPO의 최고농도는 1.1 IU/$m\ell$였으며, 이러한 결과는 CHO 세포에서의 500-1000 IU/$m\ell$의 생산량보다도 약 500-1000배정도 낮은 수준이었다. 이상을 종합하여 보면, 1) 가축에서도 생리활성물질을 소변에서 생산할 수 있는 UII promoter의 활용가능성을 제시하였으며, 2) 현재로서는 EPO의 발현량이 너무 낮아, 사용된 생쥐의 promoter를 보완할 필요성이 있다고 사료된다. 그러나, UII promoter를 이용하여 생리활성 물질을 생산할 수 있는 형질전환 돼지 생산의 성공은, 앞으로 형질전환 가축을 이용하는 활용 면에서도 더욱 더 활발할 것으로 기대된다.

• 한국동물번식학회:학술대회논문집
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• 한국동물번식학회 2002년도 춘계학술발표대회 발표논문초록집
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• pp.21-21
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• 2002

사람의 erythropoietin (hEPO) 는 산성 당단백질 호르몬이며 적혈구 생산의 주요조절인자로서 적혈구의 분화와 hemoglobin (Hb) 형성을 촉진하여 빈혈치료제로 이용된다. 사람 EPO 는 166개 아미노산으로 구성되어 있으며, 24, 38, 83 번 아미노산은 N-glycosylation에 의해, 126 번 아미노산은 O-glycosylation에 의해 변형되며, 특히 N-glycosylation은 hEPO 의 세포외 분비 및 활성에 관여한다고 보고된 바 있다. (중략)

• 한국동물번식학회:학술대회논문집
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• 한국동물번식학회 2002년도 춘계학술발표대회 발표논문초록집
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• pp.88-88
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• 2002

Erythropoietin (EPO)는 조혈작용 (erythropoiesis)을 나타내는 호르몬으로서 사람의 빈혈치료제로 사용되며, 포유통물 중 사람, 생쥐 등의 유즙 내에 혈청 EPO 와 동일한 크기로 다량으로 존재한다고 보고된 바 있다. 생쥐의 WAP promoter를 이용하여 사람의 조혈촉진제인 EPO를 유즙으로 생산하는 형질전환돼지 (새롬이)의 유즙을 분석하기 위해 SDS-PAGE와 Western blotting 을 수행하였다. 먼저, 형질전환돼지의 유즙으로부터 원심분리에 의해 지방층을 제거한 후, 16.5% polyacrylamide gel 에서 PAGE를 수행하였다. (중략)

• 한국생물공학회:학술대회논문집
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• 한국생물공학회 2001년도 추계학술발표대회
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• pp.747-749
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• 2001

의약용 인간 단백질은 현재 여러 제약으로 인해 동물 세포에서 만들어지고 있다. 그렇지만 곤충세포 시스템의 문제점인 수율과 배양의 까다로움과 같은 단점들을 보완할 수 있는 곤충세포 시스템 개발의 필요성이 대두되고 있고 본 연구에서는 의약용으로 많이 생산되고 있는 erythropoietin (EPO)을 Drosophila S2 cell에서 발현하여 CHO cell 유래의 EPO와 비교하였다. 그 결과 CHO cell에서보다 더 작은 분자량을 갖는 EPO를 확인하였다.

• 한국동물번식학회:학술대회논문집
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• 한국동물번식학회 2001년도 춘계학술발표대회
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• pp.14-14
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• 2001

본 연구는 생명공학 관련 기술개발에 의하여 신소재 물질을 생산하고 사람에게 안전하고 생리활성이 높은 고가의 의료용 단백질 생산기술을 체계화하며 형질전환 가축을 이용한 유용물질 생산에 따른 산업화와 부가가치의 극대화에 그 목적이 있다. 유즙으로 사람의 빈혈치료제인 EPO(Erythropoietin)를 분비할 수 있는 형질전환돼지를 생산하기 위하여 WAP(Whey Acidic Protein) Promoter(2.6kb) 하류에 사람의 조혈촉진유전자(EPO: 2.6kb)를 연결시켜 미세주입용 재조합 벡터(WAP-EPO : 약 7.8kb)를 구축하였다. 구축된 재조합 벡터를 1세포기 수정란에 약 2ng/ul 농도로 미세주입한 다음 외과적 방법으로 이식하였다. 이식 후 분만 모돈으로부터 생산된 자돈의 꼬리조직을 이용 게놈DNA를 추출하고 PCR 검정을 한 결과, 유즙으로 사람의 빈혈치료제를 생산할 수 있는 유전자가 도입된 형질전환돼지 $\boxDr$새롬이$\boxUl$ (♂)를 확인하였다. 또한 이렇게 꼬리조직으로부터 확인된 새롬이의 혈액과 정액을 채취, 게놈 DNA를 추출하여 외래 유전자 삽입여부를 PCR 방법으로 검정한 결과 꼬리조직과 마찬가지로 혈액 및 정액에서도 외래유전자가 삽입되었음을 확인할 수 있었다. 이렇게 생산된 형질전환돼지 $\boxDr$새롬이$\boxUl$를 이용 계대번식을 통한 F$_1$ 산자의 생산과 유전자 전이율을 확인하기 위하여 $\boxDr$새롬이$\boxUl$정액을 이용한 인공수정을 실시하였다. 인공수정은 1999년 7월 1일부터 2000년 9월 8일 까지 총 78두의 모돈을 이용하였으며, 그 중 21두의 모돈이 분만하여 인공수정에 의한 분만율은 26.92%로 나타났다.(Table Omitted) Table 1에서와 같이 새롬이 정액을 이용한 인공수정에 의해 형질전환된 F$_1$ 자돈의 형질전환율은 17.98%로 나타났으며, 32두의 형질전환자돈 중 8두(암:4두, 수:4두)는 분만과 동시에 폐사하였거나 사육중 폐사하여 현재 24두(암:12두, 수:12두)가 생존하여 F$_1$ 간 교배계획에 의해 사육되고 있다. 이 중 암컷 4두는 현재 F$_2$ 자돈 생산과 함께 유즙내로 사람 빈혈치료제의 분비 유무를 검정중에 있으며, FISH 법에 의한 외래 유전자 삽입 검정을 확인 중에 있다.

• 미생물학회지
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• 제47권2호
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• pp.170-173
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• 2011

국내에서 분리된 에포틸론 생산 점액세균 Sorangium cellulosum KYC3013의 에포틸론 생합성 유전자군(epoA~F, epoK)을 클로닝하였다. 이 유전자들이 암호화하고 있는 단백질들의 아미노산 서열을 다른 대륙 또는 나라에서 분리된 S. cellulosum SMP44, S. cellulosum So ce90, S. cellulosum So0157-2의 단백질들과 비교한 결과 서로 97.4-99.8% 동일하였다. 이러한 결과는 에포틸론 생합성 유전자들이 S. cellulosum 균주들 사이에서 잘 보존되어 있음을 보여주었다.

• 식물조직배양학회지
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• 제24권1호
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• pp.63-69
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• 1997

Erythropoietin(EPO)은 적혈구 모세포의 분화와 성장을 중재하는 당단백질이며 담배 식물체에서 재조합 사람 EPO를 생산하기 위해 CaMV 35S promoter를 갖는 발현 vector인 pBI$\Delta$GUS121, pBD$\Delta$ GUS121, pPEV-1을 이용하여 5.4kb의 EPO genomic DNA를 cloning 하였고 Agrobacterium tumefaciens에 의한 형질전환에 의해 Nicotiana tabacum (var. Xanthi)으로 도입되었다. Kanamycin을 포함하는 MS 배지에서 각각의 construct에 대하여 10 km 저항성 식물체들이 얻어졌다. 형질전환된 식물체의 게놈에 EPO genomic DNA의 정확한 결합은 polymerase chain reaction에 의해 332bP의 DNA 조각에 의해 확인되었으며 Northern blot 결과 1.8 kb의 전사체들이 식물체 잎에서 발현 축적되는 것이 확인되었다. Promoter의 수나 5'-UTS 서열에 의한 mRNA 양에는 변화가 없었지만 식물체 게놈에 결합된 위치 및 copy number에 의해 mRNA 수준에 영향을 주는 것으로 밝혀졌다. EPO 항체를 이용한 Western blot 결과 식물체에서 발현된 EPO 단백질의 크기는 동물세포에서 발현된 37kDa 보다 작은 30 kDa 이었다. 이는 식물체에서 modification(glycosylation) system은 동물세포에서와는 다르다는 것을 보여준다.

• 한국동물번식학회:학술대회논문집
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• 한국동물번식학회 2003년도 학술발표대회 발표논문초록집
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• pp.93-93
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• 2003

소의 수정란이식에 있어서 성공적인 임신을 위해서는 수란우의 적절한 영양상태, 양질의 수정란, 이식 시술자의 기술력과 수란우와 수정란의 적절한 동기화가 필수 요인이라 사료된다. 특히, 적절한 동기화를 위해서 발정관찰은 필수적이지만 번거롭고 장시간동안 관찰을 해야 하는 단점이 있다. 따라서 본 연구에서는 이러한 단점을 보완할 수 있도록 발정동기화 처리방법을 비교, 검토하여 수정란이식에 있어서 효과적인 발정동기화 방법을 모색하고자 실시하였다. 발정동기화 방법은 Fig 1과 같이 CIDR처리방법(A군)과 GnRH 처리방법(B군)을 사용하였으며, 황체의 등급은 직장검사와 초음파 진단기를 이용하여 직경이 2cm 이상, 1~2cm와 1cm 미만의 황체를 각각 1등급, 2등급과 3등급으로 분류하였다. 또한 본 실험에 공시된 수정란은 체외 생산된 한우 배반포기의 수정란을 사용하였으며, 1등급의 황체를 가진 수란우만을 선별하여 비외과적인 방법으로 황체가 존재하는 자궁각심부에 이식하였다. 임신진단은 이식 후 45~60일에 직장검사와 초음파진단을 이용하여 실시하였다. 발정동기화처리결과는 Table 1에서 보는 바와 같이 A군과 B군에서 발정발현율이 각각 100%와 96%로 나타났으며, 이식하기에 적합한 1등급 황체의 출현율이 65.4%와 56%로 A군에서 다소 높게 나타났다. 발정동기화 처리방법에 따른 수정란 이식 후 수태율은 A군에서 신선란과 동결란일 때 각각 66.7%와 60%로 나타나 B군의 22.2%와 0%의 결과보다 유의적으로 높은 결과를 나타내었다. 따라서 본 연구의 결과로 미루어 볼 때 수정란 이식을 위한 발정동기화 방법은 CIDR 처리방법을 적용하는 것이 GnRH 처리방법 보다 효율적이라 사료된다.다. 특히 기능황체에서의 특이적 발현 spot을 확인할 수 있었다. 이러한 결과들로부터 황체의 progesterone분비기능의 역할을 수행하기 위한 단백질들이 전, 중기에 발현된다는 것을 알 수 있고 퇴행황체에서는 발현이 안되고 있는 것을 알 수 있다. 이러한 결과를 토대로 다른 양상을 띤 spot을 분리하여 어떤 단백질인지를 분석하여 각각의 황체단백질의 특성을 규명할 수 있을 것으로 사료된다.적율(HCT)을 이루고 있음을 알 수 있었다. 적혈구 평균용적(Mean Corpuscular Volume ; MCV), 평균적혈구혈색소량(Mean Corpuscular Hemoglobin ; MCH), 평균적혈구혈색소농도(Mean Corpuscular Hemoglobin Concentration ; MCHC) 그리고 혈소판(Platelets) 분석결과 형질전환돼지가 일반돼지보다 약간 높은 수치를 나타냈으며 변화양상 또한 유사한 결과를 나타내었다. 이와 같은 시험분석결과를 토대로 사람 조혈촉진유전자(hEPO)가 형질전환된 돼지는 유즙으로 발현할 수 있도록 형질전환 되었음에도 불구하고 헤모글로빈 및 적혈구가 증가함으로서 형질전환돼지 개체의 혈장으로도 사람 조혈촉진인자가 분비하고 있음을 간접적으로 알 수 있었다. 정상돼지 보다 형질전환돼지가 약 30% 높은HCT 수준을 보였으며 이러한 현상은 사람에서는 적혈구증다증(erythrocytosis)으로 분류되고 있다. 이에 대한 고찰은 형질전환돼지 자체의 생리적 문제점(side effects)에 대한 해결과 더불어 기존의 인간질병에 대한 모델동물로서의 이용 가능성을 제시할 수 있는 것으로 사료된다.mu\textrm{m}$ 300BG는 56.32$\mu\tex