• Clinical and Experimental Reproductive Medicine
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• 제24권3호
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• pp.347-353
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• 1997

본 실험은 초자화 동결된 생쥐 배반포기배의 융해 후 배양조건 및 이식방법이 난자의 생존에 미치는 효과를 조사하고자 실시하였다. 체외수정후, M16배양액에서 4일동안 배양하여 얻어진 생쥐 배반포기배는 EFS40 (40% ethylene glycol, 18% Ficoll, 0.5 M sucrose가 함유된 PBS)으로 초자화동결하였다. 실험 I에서는 융해 후 배양조건에 따른 난자들의 체외/체내 생존율을 조사하였다. 융해된 난자가 M16과 4 mg/ml 소혈청알부민과 20 가지 아미노산이 함유된 m-CR1 (2% BME 아미노산 용액, 1% MEM 아미노산 용액) 및 단층배양이 유도된 난구세포 (10% FBS가 함유된 m-CR1배양액)에서 각각 배양되었을 때, 융해 후 24시간째 체외 생존율은 배양조건에 따라 차이가 없었다(75.6, 83.1, 82.4%). 그러나 체내 발달율에 있어서 임신 15일째 생존 산자율은 39.0, 49.0, 38.1%로서 유사한 성적을 나타냈으나, 전체 착상율에 있어서는 m-CR1 (80.4%)에 배양되었을 때, M16 (51.2%), 난구세포와 공배양시 (57.1%)보다 유의하게 높은 생존율을 보였다(p<0.05). 실험 II에서는 수정란 이식 방법에 따른 체내 발달율을 조사하였다. 배반포기배를 융해 후 체외배양없이 곧바로 가임신 2, 3일째 대리모에 이식을 실시하였을 때, 가임신 2일째 대리모에서는 임신징후를 얻지 못하였고, 가임신 3일째 대리모에서는 50.0%의 착상율과 15.4%의 정상산자율을 얻었다. 그러나, 이러한 결과는 융해 후, 16시간 배양하여 가임신 3일째 대리모에 이식 (73.5, 57.1%)하는 경우보다 유의하게 낮은 결과였다(p<0.05). 실험 III에서는 초자화 동결된 배반포기배의 융해 후 배양시 발달이 늦어진 수정란의 이용효율을 극대화시키기 위해 융해한 4일째 초기, 5일째 초기, 5일째 팽창 배반포기배의 체외/체내 생존율을 조사하였다. 가장 높은 체외 생존율은 5일째 팽창 배반포기배 (78.3%)에서 얻었으나, 체내 발달율 (산자율, 착상율)에 있어서는 4일째 초기 배반포기배 (33.3, 66.7%)의 경우가, 5일째 팽창 배반포기배(29.0, 38.7%)의 경우보다 높았다(p<0.05). 따라서 본 연구의 결과는 배양조건과 수정란 이식방법에 따라 초자화 동결된 배아의 체외/체내 발달율을 높일 수 있으며, 발달이 늦은 배반포기배의 체내 발달율은 체외 배양시간이 길어질수록 낮아짐으로, 5일째 팽창 배반포기배보다 4일째 초기 배반포기배를 동결하는 것이 더 유용하다는 것을 알 수 있었다.

• Clinical and Experimental Reproductive Medicine
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• 제26권2호
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• pp.231-238
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• 1999

본 연구는 체외생산된 소 배반포기배를 발달 단계 및 배양일에 따라 구별하여 초자화 동결 및 융해하였을 때, 그 발달능을 유지하는지 확인하고자 실시하였다. 체외수정 후 8일간 배양된 배반포기 배는 20% ethylene glycol에 3분 동안 평형시키고, EFS40 (40% ethylene glycol, 18% ficoll, 0.3M sucrose 그리고 10% FBS가 함유된 mDPBS) 동결액에 30초 동안 노출한 후, 액체질소에 침지하여 초자화 동결되었다. 체외 생존 여부는 응해 24시간 및 48시간에 재팽창 및 탈출 또는 완전탈출로써 평가하였다. 그 결과를 요약하면 다음과 같다. 1) 체외수정 후 8일간 배 양하였을 때, 난할된 배의 배반포기 배로의 발달율은 41.0%였다 (초기 ; 7.6%, 팽창; 22.9%, 탈출; 4.6%, 완전탈출; 5.9%). 2) 배반포기배를 동결액에 노출 또는 초자화 동결하였을 때, 초자화 동결된 배반포기배의 재팽창율 (73.3%)은 대조군 및 동결액에 노출된 경우 (100, 97.0%)보다 낮았다 (p<0.05). 그러나 융해 48시간 후 탈출 또는 완전탈출 배반포기배 형성율은 초자화 동결된 경우 (66.7, 46.7%)와 노출된 경우 (66.7, 39.4%)는 유의한 차이를 나타내지 않았으나, 대조군(100, 100%)과는 차이를 보였다 (p<0.01). 그러나, 완전탈출까지 발달한 배반포기배의 총 세포수를 조사하였을 때, 각 처리군간의 유의한 차이는 없었다. 3) 배반포기배의 발달 단계에 따른 체외 생존율을 비교하였을 때, 재팽창율은 실험군간에 유의한 차이를 보이지 않았다 $(64.5{\sim}75.6%)$. 그러나 융해 48시간 후, 탈출 또는 완전탈출로써 평가된 초기 배반포기배의 발달율 (25.8, 9.7%)은 팽창 (69.7, 39.4%)및 탈출 배반포기배 (53.3, 43.3%)의 발달율보다 낮게 나타났다 (p<0.05). 4) 또한, 배양 7, 8 그리고 9일의 팽창 배반포기배를 초자화 동결하였을 때, 8일 및 9일간 배양된 배반포기배의 재팽창율은 7일간 배양된 경우보다 낮게 나타났다 (7일; 93.9%, 8일; 75.8%, 9일; 87.5%) (p<0.05). 그러나 완전탈출 배반포기배로의 발달율에서는 처리군간에 유의한 차이를 보이지 않았다 (7일; 36.4%, 8일; 36.4%, 9일; 31.3%). 이러한 결과는 EFS40을 이용한 2단계 초자화 동결 방법이 체외생산 된 팽창 및 탈출 배반포기배의 동결에 유용하게 이용될 수 있음을 시사한다.

• 한국가축번식학회지
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• 제23권2호
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• pp.141-148
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• 1999

본 실험은 체외 생산된 소 완전탈출 배반포기배의 생존능이 초자화동결 융해 후에도 유지될 수 있는지를 조사하고자 실시하였다. 완전탈출 배반포기배는 체외 수정 후 체외배양 9일과 10일에 얻었으며, 직경을 기준으로 small(S-HBs: ø$\leq$300 $\mu\textrm{m}$)과 large(L-HBs: ø＞300 $\mu\textrm{m}$)로 구분하였다. 동결액은 35% ethylene glycoJ(EG), 18% ficoll, 0.3 M sucrose와 10% FBS가 첨가된 mDPBS로 만들어진 EFS35를 사용했다. 완전탈출 배반포기배는 2 단계로 초자화동결되었는데, 10% EG에 5분간 평형 그리고 EFS35에 노출한 후 L$N_2$에 초자화되기까지 30~45초간 처리하였다. 체외에서의 생존능은 융해 후 2, 16 시간째의 재 팽창으로 조사하였다. 그 결과를 요약하면 다음과 같다. 1) 체외 수정 후 8 일째에 얻어진 배반포기배 (40.8%) 를 24~48 시간 추가배양했던 바, 체외 수정 후 9일째와 10일째의 완전탈출 배반포기배의 발달율은 20.5%와 6.7%였다. 또한, 완전탈출 배반포기배의 총 세포수를 조사하였던 바, 배양 9일째의 완전탈출 배반포기배의 총세포수 (232.7$\pm$16) 가 배양 10 일째의 완전탈출 배반포기배 057.5$\pm$9.3) 보다 많게 나타났다. 2) 체외수정 후 체외 배양 9일째 생산된 L-HBs 의 생존에 동결액이 미치는 영향을 조사하였던 바, 동결군 (75.5%) 이 대조군 (100%) 과 노출군 (100%) 에 비해 낮은 생존능을 보였다. 3) 완전탈출 배반포기배를 직경 (L-HBs, S-HBs)과 배양일로 구분하여 초자화동결된 난자의 생존에 미치는 영향을 조사하였던 바, 9일에 얻어진 완전탈출 배반포기배 (75.5%, 63.6%)는, 10일에 얻어진 완전탈출 배반포기배 (64.3%, 60.7%)보다 약간 높은 생존능이 있음을 알 수 있었다. 4) 융해 후 체외배조건이 난자의 생존능에 미치는 영향을 조사하였던 바, 동결 융해된 완전탈출 배반포기배의 생존능은 공배양 (43.2%, 41.9%)보다 mCR1aa (10% FBS) 배양액 (79.3%, 62.5%)에서 유의하게 높게 나타나는 것을 확인하였다 (p＜0.05). 따라서, 이러한 결과에서 볼 때 소 완전탈출 배반포기배는 EFS35 동결액을 사용하여 성공적으로 초자화동결 후 보존될 수 있음을 확인하였다.

• 한국가축번식학회지
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• 제20권2호
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• pp.119-126
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• 1996

본 연구는 30% Ficoll과 0.3M sucrose가 함유된 mDPBS 용액에 40%의 ethylene glycol을 첨가함으로서 제조된 EFS40을 이용하여 1-세포기의 생쥐수정란을 효율적으로 동결할 수 있는 적정 조건을 확립하기 위하여 실시하였다. 체외수정에 의해 생산된 생쥐수정란은 1단계 동결법 혹은 2단계 동결법, 두 가지 동결 방법에 의해 각각 초자화 동결되었으며, 동결 후, 융해된 수정란의 생존율은 2-세포기로 분할율과 배양 5일째 탈출배반포기로의 발달율로 각각 검증하여 다음과 같은 결과를 얻었다. 1단계 동결법에서, 수정란을 직접 초자동결액에 1분 동안 노출시켰을 때, 수정란의 생존율은 85.5%, 발달율은 31.9%였다. 수정란을 먼저 20% ethylene glycol에 1, 3, 5분간 노출시킨 후, 1분동안 EFS40 용액으로 옮겨 동결하는 2단게 동결법에서는 1단게 동결법보다 낮은 생존율을 보였다(65.4, 53.6 및 29.6%). 가장 높은 생존율(95.9%)은 EFS40에서 30초동안 노출이 1단계 동결법에서 얻을 수 있었다. 이 조건하에서 2-세포기로 분할된 수정란의 63.8%가 탈출배반포기로 발달하였다. 또한, Differential labelling 기법을 이용하여 Total과 ICM(inner cell mass)의 세포수를 조사한 결과, 초자 동결 후 발달된 배반포의 Total과 ICM 세포수(63.2$\pm$16.9, 13.5$\pm$4.0)와 대조군 세포수(54.0$\pm$15.2, 12.3$\pm$4.6)간에는 각각 유의차가 인정되지 않았다. 이러한 결과는 동결로 인한 수정란의 발달율은 다소 낮았지만, 동결후 융해된 수정란은 정상적으로 배반포까지 발달함을 보여준다. 이러한 결과로 미루어 보아, 본 실험에 사용된 초자화 동결 방법은 1-세포기 생쥐 수정란을 성공적으로 동결시킬 수 있다는 것을 알 수 있었다.

• 한국가금학회지
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• 제40권3호
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• pp.197-205
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• 2013

동결 닭 원시생식세포의 생식계열 키메라를 이용한 생체에의 복원을 실용화하기 위해서는, 닭 원시생식세포의 동결보존기술의 향상에 의해 동결 및 융해 후의 많은 생존세포를 확보하는 것이 반드시 필요하다. 닭 원시생식세포는 배양 5.5일령의 닭 원시생식선으로부터 채취하고, MACS 방법에 의해서 순수 닭 원시생식세포를 분리했다. 15% 각각의 EG를 동결보호제로 사용한 처리군이 각 군의 농도에 상관없이 유의적(p<0.05)으로 PG 처리군보다 동결 및 융해 후의 세포의 생존율이 높음을 확인하였다. 특히, 10% EG 처리군에서 85.63%로 동일한 농도의 PG 처리군(66.81%)보다 유의적(p<0.05)으로 가장 높은 생존율을 보였다. 한편, 상업용 닭(한협3호)에서도 오계와 비슷한 경향의 결과를 확인하였다. 이상의 결과들로부터 유리화 동결에 있어서 가장 높은 생존율을 보인 10% EG이 최적의 동결 보호제로서 사용 가능함을 확인하였다.

• Journal of Chest Surgery
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• 제29권11호
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• pp.1173-1181
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• 1996

동종동맥판의 보존기법이 발전하면서 상당한 정도의 생육성이 보존되며, 특히 면역반응의 주된 요인인 내피세포 생육성이 약 50%이상 보존되기 때문에 보존처리된 동종동맥판 내피세포의 면역능력을 평가하는것이 동종동맥판의 임상적변화의 원인을 규명하는데 필요할 것이다. 실험은 200~250gm의 Sprague-Dawley Rat를 사용하였다. Rat로부터 적출한 동맥벽을 현재 임상적으로 사용하고 있는 냉장보존법과 냉동보존법을 사용하여 2주일간 보존하였으며 보존처리전(No treat)과 멸균처리후(sterile),냉장 보존후 1(1day), 2(2day), 7(7day), 14일째(14day), 2주간의 냉동보존후(cryo)에 표본을 채취하여 보존시간에 따른 변화를 관찰하였다. 면역표현에 대한 연구를 위하여 혈관조직으로부터 내피세포를 분리한 뒤 면역조직화학검사(Immunohistochemical study)를 하였다. 혈관내피세포의 항원 표현정도를 정량적으로 분석하기 위하여 anti-MHC class I antibody(MRC OX-18)과 anti-MHC class II antibody(MRC OX-6), anti-ICAM antibody를 사용하였다. 처리된 내피세포를 Flow cytomwtry로 분석하여 항체가 부착된 내피세포의 비율을 알아냄으로써 내피세포의 항원성(antigenic expression)을 조사하였다. 또한 보존처리된 동종동맥판에 의한 생체내에서의 면역반응을 평가하기 위하여 위에서와 같은 방법으로 보존처리전(No treat), 멸균처리 후 2일 보존후(2 day), 7일 보존후(7 day), 14일 보존 후(14 day), 냉동보존(cryo)된 동종동맥판을 Mouse에 이식한 후 일정기간(1, 2, 3, 4, 6, 8주)이 경과된 시점에서 혈중의 CD4$^{+}$, CD8$^{+}$ T cell분포를 측정하였다. 이를 위하여 Mouse의 미정맥에서 채취한 혈액에 monoclonal antibody를 처리한 뒤 flow cytometry를 이용하여 lymphocyte중의 CD4$^{+}$, CD8$^{+}$ T cell 비율을 측정하였다. 내피세포의 MHC Class I 표현정도는 No treat에서 23.95%였고, sterile에서 48.08%로 증가한 뒤 14day 까지 36.02%로, cryo에서도 35.53% 로 증가되어 있었다(p=0.0183). MHC Class II 표현정도는 No treat에서 9.72%, sterile에서 10.13%이였고 14day 에서 10.27%, cryo 에서 13.39% 였다(P=0.1599). ICAM-1 표현정도는 No treat에서 15.02%, sterile에서 19.85%였고, 14day에서 35.33%, cryo에서 34.67% 로 증가하였다(P=0.001). 정상 Mouse에서 CD4$^{+}$, CD8$^{+}$ T-cell분포는 각각 42.13%, 25.57% 였고 CD4$^{+}$/CD8$^{+}$ ratio는 1.64였다. 동종동맥을 이식받은 Mouse의 정맥혈중 CD4$^{+}$ T-cell분포는 No treat군에서 1주에서 8주사이에 49.23% 에서 36.8%사이로 변화를 보이지 않았고(p=0.955), 2 day군에서는 30.36%로 감소하였고(p=0.0001), 7day군에서는 32.8%로 감소하였고(p=0.008), 14 day 군은 26.92%로 감소(p=0.0001), cryo군은 29.56%로 감소하였다(p=0.0018). CD8$^{+}$T-cell은 모든 군에서 1주에서 8주 사이에 42.32%에서 58.92%사이로 증가하였다(p=0.0001~0.0002). CD4$^{+}$/CD8$^{+}$ ratio는 모든 군에서 1주에 1.22 에서 2.28 사이에 있었으나 8주후에는 모든 군에서 0.47에서 0.95 사이로 감소하였다(p=0.0001). 즉, 보존처리된 동종동맥판의 내피세포는 보존처리과정의 초기에는 MHC class I과 II항원효과를 동시에 보이고, 보존기간이 길어지면서 MHC class II항원효과는 변함이 없으나 MHC class I 항원효과는 증가함을 알 수 있다. 또한 CD4$^{+}$ T-cell은 보존처리 기간 중 소폭의 변환를 보임에 반하여 CD8$^{+}$ T-cell은 보존처리된 기간에 관계없이 이식된 후 8주간에 걸쳐 지속적으로 증가함을 알 수 있다. 4$^{\circ}C$에 냉장보존한 군과 냉동보존한 군간에는 차이가 없었다. 이와같은 결과를 볼 때 동종동맥판을 체내에 이식할 경우 내피세포에 의한 MHC class I 항원효과가 지속적으로 유지되고 있음을 추측할 수 있다.

• 한국수정란이식학회지
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• 제25권4호
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• pp.291-295
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• 2010

Four estrus-induced Himalayan tahrs (Hemitragus jemlahicus) were inseminated with frozen-thawed semen by laparoscopic or transcervical insemination techniques with no regard to the site of ovulation in non-breeding season. In June and July, 2009, estrus was synchronized by Eazi-Breed $CIDR^{(R)}$ (Controlled internal drug release; Pfizer Animal Health, New Zealand) insertion for 16 days and PG 600 (PMSG 400IU, hCG 200 IU; Intervet, Netherlands) injection (IM) a day before removing $CIDR^{(R)}$. Forty eight hours later, laparoscopic or transcervical insemination was done to each of two tahrs under anesthetic condition inducted by ketamine (1.5 mg/kg) and medetomidine (0.09 mg/kg). For examination of estradiol and progesterone, blood was collected right before $CIDR^{(R)}$ insertion, PG 600 injection, $CIDR^{(R)}$ removal and insemination. Estradiol levels of four tahrs (No. 1, 2, 3, 4) before $CIDR^{(R)}$ insertion and insemination were 13.3, 8.8, 14.3, 12 pg/ml and 23.5, 25.5, 21.1, 11.5 pg/ml, respectively. Progesterone levels of four tahrs (No. 1, 2, 3, 4) before $CIDR^{(R)}$ insertion and insemination were 1.8, 0.05, 0.63, 0.61 ng/ml and 1.03, 0.37, 1.48, 2.12 ng/ml. Except for No. 4 tahr, cervices showed cervical mucus and opened enough to penetrate with embryo transfer gun sheet usually used for cows. Therefore, No.4 was laparoscopically inseminated together with No. 1. In conclusion, none of four Himalayan tahrs was pregnant. However, we proved that estrus could be induced by CIDR and PG 600 injection in non-breeding season, and laparoscopic or transcervical insemination with frozen-thawed semen could be one of assisted reproductive techniques in Himalayan Tahr.

• Clinical and Experimental Reproductive Medicine
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• 제48권1호
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• pp.85-90
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• 2021

We present data from three Caucasian men with Zinner syndrome who attended our center for the treatment of primary couple's infertility. Each patient was scheduled for conventional testicular sperm extraction (cTESE) and cryopreservation. Sperm analysis confirmed absolute azoospermia. Patient 1 had right and left testis volumes of 24 mL and 23 mL, respectively; left seminal vesicle (SV) agenesis, severe right SV hypotrophy with right renal agenesis. Follicle-stimulating hormone (FSH) was 3.2 IU/L. Patient 2 exhibited right and left testis volumes of 18 mL and 16 mL, respectively; a left SV cyst of 32 × 28 mm, ipsilateral kidney absence, and right SV agenesis. FSH was 2.8 IU/L. Patient 3 showed a testicular volume of 10 mL bilaterally, a 65 × 46 mm left SV cyst, right SV enlargement, and left kidney agenesis. FSH was 32.0 IU/L. Sperm retrieval was successful in all patients. Nevertheless, cTESE should be performed on the day of oocyte retrieval.

• Animal Bioscience
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• 제37권4호
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• pp.640-654
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• 2024

Objective: The purpose of this study was to explore the effect of sodium salicylate (SS) on semen preservation and metabolic regulation in goats. Methods: Under the condition of low temperature, SS was added to goat semen diluent to detect goat sperm motility, plasma membrane, acrosome, antioxidant capacity, mitochondrial membrane potential (MMP) and metabonomics. Results: The results show that at the 8th day of low-temperature storage, the sperm motility of the 20 μM SS group was 66.64%, and the integrity rates of the plasma membrane and acrosome were both above 60%, significantly higher than those of the other groups. The activities of catalase and superoxide dismutase in the sperm of the 20 μM SS group were significantly higher than those of the control group, the contents of reactive oxygen species and malondialdehyde were significantly lower than those in the control group, the MMP was significantly higher than that in the control group, and the contents of Ca²⁺ and total cholesterol were significantly higher than those in the control group. Through metabonomics analysis, there were significant metabolic differences between the control group and the 20 μM SS group. Twenty of the most significant metabolic markers were screened, mainly involving five metabolic pathways, of which nicotinic acid and nicotinamide metabolic pathways were the most significant. Conclusion: The results indicate that SS can effectively improve the low-temperature preservation quality of goat sperm.

• 한국수정란이식학회지
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• 제17권2호
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• pp.129-136
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• 2002

본 연구는 체내, 체외 소 배반포기 배의 GMP vitrification 후 활력도의 비교와 한우 수정란을 몽골 소에 수정란이식 후 산자생산 가능성을 조사하고자 실시하였다. 한우 수정란은 체외수정란 또는 과배란처리에 의한 체내수정란을 생산하여 GMP vitrification 방법으로 동결 후 몽고로 수송하였다. 수란우는 CIDR과 $PGF_2\alpha$ 처리에 의하여 동기화를 유도하였다 체내수정란생산을 위하여 7두를 과배란처리하였다. 총 64개의 배반포기를 회수하였다. ($9.1\pm2.94$per cow). 체외수정란생산은 80.1% 분할율(174／217)과 40.8% 배반포기 발달율(71／174)을 얻었다. 체내수정란(93.7%; 45／48)의 동결융해 후 생존율은 체외수정란(82.5%; 52／63)보다 유의적으로 높았다(P＜0.05). 8두의 몽골 소에 2개의 수정란을 이식하여 5두가 이식 후 60일째 임신이 확인되었으나, 그 중 1두는 240째 유산을 확인하였다. 그 중 2두의 수란우에서 2두의 산자를 275일째 생산에 성공하였다. 이러한 결과는 GMP vitrification 방법은 체내, 체외수정란의 동결보존방법으로 이용될 수 있을 뿐만 아니라 동결융해란의 몽골 소에 이식 후 한우를 생산할 수 가능성을 확인하였다.