본 실험은 Corynebacterium속 식물병원세균에 관한 연구의 일환으로서 Corynebacterium속 식물병원세균의 종 및 속으로서의 특성을 구명하기 위하여 행하여진 것으로서 균체구성단백의 정량은 Lang의 Messier 변법을 사용하였으며 균채 구성단백의 아미노산정량은 미생물 정량에 의하였다. Corynebacterium 속 식물병원세균은 타속의 병원세균에 비하여 다소 적은양의 균체 구성단백을 가지고 있었으며 균체구성단백의 아미노산; Cystein, Trypthophane, Histidine, Phenylalanine 및 Isoleucin에 있어서도 같은 결과를 나타내었다. 허나 이 현상은 종적 혹은 개체의 균주의 특성으로서 분류에는 관계를 갖지 않고 있음이 밝혀졌다
To develop the host-vector system for industrial Coryneform bacteria that seemed to be the most suitable microorganisms for molecular breeding of genes involved in the production of amion acids, nucleotides, and other products of industrial interest, broad host range E. coli plasmid R 1162 DNA was transformed into Brevibacterium ammoniagenes and the plasmids pKU6 isolated from a transformant was physically characterized. All other plasmids from the transformed cells except pKU6 exsisted as multimeric forms in Brevibacterium ammoniagenes. The plasmid DNA was retransformed into Corynebacterium glutamicum with a high frequency ($1.32{\times}10^{-1}$ per cell) and maintained stably both in Brevibacterium ammoniagenes and Corynebacterium glutamicum after 100 generations of cultures with 25-30 copy number per cell. The size of both plasmid pKU6 and plasmid R1162 were the same and restriction maps by EcoR I, Ava I, Pst I, Pvu II and Hinc II were also similar.
Park, Jong-Uk;Jo, Jae-Hyung;Kim, Young-Ji;Chung, So-Sun;Lee, Jin-Ho;Lee, Hyune-Hwan
Journal of Microbiology and Biotechnology
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제18권4호
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pp.639-647
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2008
The heat-inducible expression vectors for Corynebacterium glutamicum and C. ammoniagenes were constructed by using the ${\lambda}O_L1$ and the cryptic promoters, CJ1 and CJ4 that express genes constitutively in C. ammoniagenes. Although the promoters were isolated from C. ammoniagenes, CJ1 and CJ4 were also active in C. glutamicum. To construct vectors, the $O_L1$ from the ${\lambda}P_L$ promoter was isolated and fused to the CJ1 and CJ4 promoters by recombinant PCR. The resulting artificial promoters, CJ1O and CJ4O, which have one ${\lambda}O_L1$, and CJ1OX2, which has two successive ${\lambda}O_L1$, were fused to the green fluorescent protein (GFP) gene followed by subcloning into pCES208. The expression of GFP in the corynebacteria harboring the vectors was regulated successfully by the temperature-sensitive cI857 repressor. Among them, C. ammoniagenes harboring plasmid pCJ1OX2G containing GFP fused to CJ1OX2 showed more GFP than the other ones and the expression was tightly regulated by the repressor. To construct the generally applicable expression vector using the plasmid pCJ1OX2G, the His-tag, enterokinase (EK) moiety, and the MCS were inserted in front of the GFP gene. Using the vector, the expression of pyrR from C. glutamicum was tried by temperature shift-up. The results indicated that the constructed vectors (pCeHEMG) can be successfully used in the expression and regulation of foreign genes in corynebacteria.
To investigate impediments to plasmid transformation in Brevibacterium flavum BF4 and B. lactofermentum BL1, cell surface barriers were determined by measuring growth inhibition whilst enzymatic barriers were determined by comparing DNA methylation properties. B. lactofermentum was more sensitive to growth inhibition by glycine than B. flavum. Release of cellular proteins during sonication was more rapid for B. lactofermentum than for B. flavum. Plasmid DNA (pCSL 17) isolated from B. flavum transformed recipient $McrBC^+$ strains of Escherichia coli with lower efficiency than $McrBC^-$. McrBC digestion of this DNA confirmed that B. flavum contain methylated cytidines in the target sequence of McrBc sequences but B. lactofermentum contained a different methylation pattern. DNA derived from the B. lactofermentum transformed recipient $EcoKR^+$ strains of E. coli with lower efficiency than $EcoKR^-$, indicating the presence of methylated adenosines in the target sequence of EcoK sequences. The present data describe the differences in the physical and enzymatic barriers between two species of corynebacteria and also provide some insight into the successful foreign gene expression in corynebacteria.
본 실험은 Corynebacterium속 식물병원세균에 관한 연구의 일환으로서 Corynebacterium속 식물병원세균의 종 및 속으로서의 특성을 구명함과 동시에 C. sepedonicum이 생성하는 Rumiflabin에 기초를 둔 ultraviolet method의 재검토를 위하여 행하여 진 것으로 vitamin B군의 정량은 미생물 정량에 의하였다. 대다수의 식물병원세균은 Thiamine (vitamin $B_1$), Nicotinic acid, Biotin 및 안식향산을 생장물질로서 사용하였다. Riboflavin은 corynebacterium속 식물 병원세균 (C. rathay 및 C. fascians는 제외)은 물론 타속의 식문병원세균도 생성하는 점으로 Corynebacterium속 식물병원 세균의 특성이 아니라는 점이 구명되었으며 sepedonicum에 의하여 발생되는 감자의 윤부병과 청고병과의 감별에 사용되어온 Ultra-violet light법은 재검토되어야 한다.
B. lactofermentum의 lysine 생합성에 있어서 DDH경로 및 ddh gene이 지닌 중요성을 조사하기 위하여, site-specific mutagenesis technique를 통하여 B. lactofermentum의 ddh gene을 disruption함으로서 DDH 경로를 차단시켰다. B. lactofermentum ddh mutant는 wild type 및 AEC내성 균주보다 성장이 매우 저조하였으며 lysine 생산량에서도 급격한 저하를 가져왔다. 이와 같이 B. lactofermentum이 DAP 경로만을 가졌을 때 세포의 성장 및 lysine 생산량에 있어서 극적인 저하를 가져왔기 때문에 B. lactofermentum에서의 DDH 경로는 meso-DAP 및 lysine 생합성에 있어 필수적인 경로로 작용한다는 것을 확인하였다. 그러므로 C. glutamicum과 B. lactofermentum과 같은 corynebacteria가 lysine을 많이 생산하는 것은 DDH 경로가 부가적으로 존재하기 때문이며, 이러한 DDH 경로는 metabolic flux가 증가되면 중간 대사물을 lysine으로 변화시키는 중요한 경로로 작용할 것이라 사료된다.
A total of 364 quarter milk samples of 91 dairy cattle from 4 area around Jeonju in Jeonbug area were examined for infection rate and causative abets of mastitis by the Laboratory Procedures used in the Connecticut Mastitis-Control Program. The results obtained were as follows: 1. One hundred and thirty quarters (35.7%) from 67 cows (73.6%) were found to be infected with mastitis. It was found that 5 (1.37%) of the infected quarters were clinical mastitis and all of the rest were subclinical mastitis (125 quarters). 2. The main causative agents were found to be Staphylococcus aureus (46 quarters), Streptococcus agalactiae (49 quarters), streptococcus disgalactiae (18 quarters), Steptococcus uberis (13 quarters). Corynebacteria, Coliform organisms, Pseudomonas were also occasionally found to be causative organisms. 3. Having examined the number of infection Quarter per head of mastitis dairy cattle samplings, major findings were that the average number of infection quarter to total dairy cattle examined was 1.4 quarters, and that average number of infection quarter to the infected cattle was 1.9 quarters.
A total of 835 quarter milk samples of 212 dairy cows from 14 herds were examined for mastitis and the results obtained were as follows; 1. Three hundred and fifty-eight quarters(42.9%) from 149 cows(70.3%) were found to be infected with mastitis. It was found that 11(1.3%) of the infected quarters were clinical mastitis and all of the rest were subclinical mastitis. 2. Streptococcus agalactiae(62 quarters) and Staphylococcus aureus(42 quarters) were the main two causative organisms of the mastitis. Streptococcus dysgalactiae, Streptococcus uberis, other streptococci, Corynebacteria, and Yeast were also found to cause the infection. 3. The majority of Staphylococcus aureus strains were sensitive to penicillin, orbenin, terramycin, and leucomycin, however, the most of Streptococcus strains were sensitive to penicillin and orbenin only. 4. Penicillin and orbenin were highly effective in the treatment of mastitis, especially orbenin for Staph ylococcus aureus infection and penicillin for Streptococcal infection. 5. A mastitis control program for dairy farms in Korea was discussed and recommended.
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[게시일 2004년 10월 1일]
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