International Journal of Industrial Entomology and Biomaterials
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v.1
no.1
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pp.53-58
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2000
A cDNA encoding the luciferase of firefly Luciola lateralis was cloned downstream from the polyhedrin gene promoter of Bombyx mori nucleopolyhedrovirus and expressed in B. mori cells (BmN-4). The coding soquence for luciferase was inserted into pBmKSK2 rectors) which was reconstructed from the polyhedrin-based transfer vector pBmKSKl by modifying cloning sites. Recombinant virus, BmK2-LUCDF, containing the luciferase gene was selected and purified in BmN-4 cells. The emission of luminescence by luciferase was only detected in BmK2-LUCDF-infected cell extracts. This result indicates that the cloned new luciferase gene of firefly L. lateralis can be expressed efficiently in baculovirus expression system and used as a useful reporter gene.
International Journal of Industrial Entomology and Biomaterials
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v.7
no.2
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pp.197-201
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2003
The recombinant plasmids harboring a heterologous gene coding mouse endostatin were transfected and expressed stably in Trichoplusia ni Tn 5B1-4 cells and Bombyx mori BmN cells, respectively. Recombinant endostatin expressed in the stably transformed Tn 5B1-4 and BmN cells was secreted into the medium. BmN cells are relatively lower in maximum cell growth and recombinant endostatin production than Tn 5B 1-4 cells. Recombinant endostatin was also purified to homogeneity using a simple one-step ${Ni^2+}$ affinity fractionation method. Purified recombinant endostatin inhibited endothelial cell proliferation in a dose-dependent manner. The concentration at half-maximum inhibition $({ED_50})$ for recombinant endostatin was approximately 0.35 ${\mu}g$/ml.
International Journal of Industrial Entomology and Biomaterials
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v.15
no.1
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pp.35-38
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2007
In this study, ORF 46 of Bombyx mod nucleopolyhedrovirus(Bm46) fused with EGFP was expressed in Bombyx mod cell lines, larvae and pupae by BmNPV Bacmid system. Bm46 and EGFP were cloned into donor plasmid pFastBacHTb, which was transformed to competent DH10B cells containing helper and BmNPV bacmid by site-specific transposition. Recombinant bacmid was used to transfected BmN-4 cells to produce the recombinant baculovirus vBm-Bm46-EGFP. Recombination virus was injected into silkworm larvae and pupae. The expression of the fusion protein was monitored by examining green fluorescence using a fluorescent microscope. Intense fluorescence in cells and silkworm was observed at 4 days post-infection, indicating the Bm46-EGFP fusion gene was expressed successfully.
To investigate the molecular biological marker in insect cells, BmN-4 and Sf-0 cells were analysed by SDS-PAGE and random amplification of polymorphic DNA. The results showed that the patterns of total cell protein and random amplification of polymorphic DNA were distinguished between BmN-4 and Sf-9 cells, suggesting that the unique major bands were useful as molecular biological marker in BmN-4 and Sf-9 cells.
Twelve recombinant viruses with wider host range were plaque purified after coinfectian of Autographa cahjornica and Bombyx mOT! NPVs into Sf9 ar BmN-4 cells. Restriction endonucleases analysis of the recombinant's DNAs showed that the recombinatIOn between AcNPV and BmNPV genomes had occurred more than once. When the recombinam RecB-8, derived from BrnN-4 cells, was observed by electron rntcroscopy, the shape of the polyhedron was a regular tetrahedron, and few virions were occluded into a polyhedron.
To understand expression of some early and late genes of Bombyx mori nuclear polyhedrosis virus (BmNPV) in the B. mori-derived BmN cell line, the transcripts were analyzed by polymerase chain reaction with synthetic primers. After infection, the transcript of early genes, which include p35, IE1 and helicase p143, was immediately detected in the infected cells. In addition, the transcript of late genes, which include p10 and polyhedrin, was also detected in just-infected cells. In conclusion, our results revealed that transcripts of early and late genes of BmNPV are immediately expressed from the cells after infection.
To investigate the expression efficiency of new transfer vector of Bombyx mori nuclear polyhedrosis virus (BmNPV), Escherichia coli lacZ gene was inserted into new transfer vector pBmKSK1, under the control of polyhedrin promoter and expressed in BmN-4 cells and larvae of silkworm, Bombyx mori. The recombinant virus containing lacZ gene was isolated from BmN-4 cells coinfected with transfer vectro pBmKSK1-LacZ and wild type BmNPV genome, and analysed by Southern blotting. The expression of ${\beta}$-galactosidase was characterized by SDS-PAGE, Western blotting and ${\beta}$-galactosidase activity assay. The results showed that the level of expression in silkworm larvae was higher than that of BmN-4 cells.
To investigate the effect of hemolymph of silkworm larvae on the multiplication of Bombyx mori nuclear polyhedrosis virus (BmNPV) in BmN-4 cells, BmN-4 cells were infected with BmNPV, which were sequentially Heated with the hemolymph exracted from B. mori larvae. When the culture media TC-100 containing 3% fetal bovine serum was mixed with 10% hemolymph heated at 65$^{\circ}C$ for 30 minutes, the released polyhedra by multiplication of BmNPV in BmN-4 cells were increased more than those of non-treated. However, multiplication of BmNPV in BmN-4 cells treated with non-heated hemolymph was not effective, since non-heated hemolymph was toxic for the cell growth. The result of plaque assay showed that plaque forming units in BmN-4 cells treated with heated hemolymph are significantly increased, suggesting that efficiency of multiplication of BmNPV in BmN-4 cells is due to increase not of cell growth but of infectivity of BmNPV.
Bombyx mori nuclear polyhedrosis virus (BmNPV) was successfully multiplied in the nuclear of BmN4 cells cultured with insect Grace's medium. By electron microscopic observation, the virons had a single nucleocapsid in an envelope. Polyhedral protein synthesis of BmNPV in BmN4 cells was detected at 18 hr p.i. and polyhedral protein was a singlepolypeptide with a M.W of 30 kd. At 48 hr p.i. polyhedra formation was observed by inverted mociroscope and electron microscope. Genome analysis of BmNPV by restriction endonucleases was not revealed the difference between virus produced in vivo and that in vitro.
International Journal of Industrial Entomology and Biomaterials
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v.15
no.2
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pp.131-135
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2007
Open reading frame 4 of Bombyx mori nucleopolyhedrovirus (BmNPV), designated as Bm4, is a gene whose function is completely unknown. With the recently developed BmNPV bacmid and a modified pFastBac1 whose polyhedrin promoter was replaced with ie1 promoter, a recombinant bacmid expressing Bm4-EGFP fusion protein under the control of ie1 promoter in BmN cells was successfully constructed. The result not only showed that the polyhedrin promoter can be replaced efficiently with other promoters to direct the expression of foreign gene in BmN cells by using Bac-to-Bac/BmNPV baculovirus expression system but also laid the foundation for rescue experiment of Bm4 deletion mutant due to the ability of ie1 promoter to direct gene expression throughout the infection cycle.
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[게시일 2004년 10월 1일]
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