Using the reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR), a rapid and sensitive assay method for the detection and identification of barley yellow mosaic virus (BaYMV) and barley mild mosaic virus (BaMMV) was adapted. Two units of primers from each virus were selected and used for the determination of two different viruses. PCR fragments of BaYMV (ca. 0.9kb) and BaMMV (ca. 0.8kb) were obtained from the designed method for the assay of BaYMV and BaMMV coat protein. PT-PCR fragments were cloned using vector pT7 Blue and the sequences of the selected clones were analyzed. coat protein of BaYMV and that of BaMMV consisted of 297 amino acids (891 nucleotides) and 251 amino acids (753 nucleotides), respectively. The snalysis of coat protein genes from these two viruses showed that 45.6% of nucleotides sequence ad 34.9% of amino acid in BaYMV were homologous to those in BaMMV.
The two viruses of barley yellow mosaic(BaYMV) and barley mild mosaic virus (BaMMV) were detected by ELISA from barley plants with virus-like symptoms which were collected from 16 locations in southern Korea, during 1995 and 1996. Both viruses occurred in southern Korea. Barley plants at Chongdo and Koseong were infected with BaMMV, while those infected with BaYMV were at Kurye and Taegu. After sowing 50 barley cultivars at habitually infected fields in 10 locations, the susceptibility and resistance to BaYMV and BaMMV were screened with antiserum tests. The cultivars of Albori, Alchanbori, Daejinbori, Jokangbori, Milyangbori, Boeunkwamek, Naehanssalbori, Olssalbori, Weossalbori, Dusan 29 and Deogndohyangchonkwa showed positive reaction to BaYMV antiserum, while Saeolbori, Chalbori, Jinjukwa and Baegjinkwa showed positive reaction to BaMMV. Nonsankwa 1-6 and wheat cultivars of Chongkeymil, Dahongmil, Grumil, Urimil, Jochonhomil, Sinkeyhomil showed negative reactions to both viruses. The rest cultivars were infected both with BaYMV and BaMMV. Sap inoculations to barleyplants with the two viruses of BaYMV isolated in Haenam and BaMMV isolated at National Honam Agricultural Station, expressed lower infection rate than those grown in the virus-infected fields.
2단계의 nested PCR 방법을 이용하여 보리 및 벼 재배 토양에서 Barley yellow mosaic virus (BaYMV)를 검출하였다. BaYMV 분절 RNA1 외피단백질 영역의 특이 프라이머로 1차 PCR을 하고 내부서열로부터 작성된 프라이머로 2차 PCR을 실시하여 확보된 372 bp의 PCR 산물이 BaYMV 외피단백질 영역과 98%-100% 염기서열이 일치하여 BaYMV를 검출할 수 있음을 확인하였다. 이 결과는 토양으로부터 BaYMV 검출에 관한 최초의 보고이며 토양전염성 바이러스의 정확한 진단과 예찰에 적용될 수 있을 것으로 생각한다.
Kim, Hong-Sik;Baek, Seong-Bum;Kim, Dea-Wook;Hwang, Jong-Jin;Kim, Si-Ju
The Plant Pathology Journal
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제27권4호
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pp.324-332
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2011
Soil-borne barley yellow mosaic disease caused by Barley yellow mosaic virus (BaYMV) or Barley mild mosaic virus (BaMMV) gives a serious threat to the winter barley cultivated in the southern regions in Korea. It is important to develop resistant varieties for stable and high-yield production. The objectives of this study were to evaluate 22 genotypes of exotic barley germplasms carrying the resistance genes rym1 through rym12, with the exception of rym10, and to determine the genes that confer resistance to BaYMV or BaMMV in Korea. Using the traditional visual scoring of symptoms at 4 locations over 3 years, average disease rate values differed (P < 0.001) among the genotypes. ELISA test revealed the presence of both BaYMV and BaMMV in all of the field sites but Jinju and significantly different rates of infection among genotypes and years. Barley genotypes differed in how virus quantities and pathogen-induced symptoms were correlated, especially in response to BaYMV. Disease incidence was affected by the climatic conditions present during the early growing stage before overwintering. A Chinese landrace, 'Mokusekko 3', carrying rym1 and rym5 was comparatively resistant at all locations studied. The barley genotypes carrying either rym6 or rym9 were susceptible to the viral strains. The genotypes carrying rym5 were resistant in Jinju and Milyang but susceptible in Iksan and Naju. The resistance genes rym2 and rym3 were effective in local strains and would be potent contributors to disease resistance.
Barley yellow mosaic virus (BaYMV-HN) occurring Haenam area was isolated by mechanical inoculation onto barley cultivars, purification and production of antibody. BaYV-HN were purified from infected plants a filamentous virus with 13 nm in diameter and 250∼300 nm and 500∼650 nm in length. Specific antibody made by injecting the purified virus to the muscle of a rabbit. In gel-diffusion tests antibody to BaYMV-HN did not make spur with tow Japanese BaYMV isolates BaYMV-II-1 or BaYMV-III. BaYMV-HN showed the symptom of yellowing and necrosis in host plants. Mechanical inoculation tests with Japanese barley cultivars showed that BaYMV-HN infected New Golden, Akagi Nijo and Tosan Kawa 73, but did not infect Amagi Nijo, Haruna Nijo, Ishukushirazu (ym3), Misato Golden (Ym1), Kashimamugi, Joshushiro Hadaka and Mokusekko 3 (ym1). In Korean barley cultivars, some of the naked barleys which are Hinssalbori, Kinssalbori, Saessalbori and Saechalssalbori were not infected by BaYMV-HN. However, it infected all the covered barley cultivars and the beer barley cultivars. BaYMV-HN had two RNAs, RNA 1 (7.6 Kb) and RNA 2 (3.5 Kb), and one coat protein (33 KDa).
보리호위축병 피해지역에 대한 수량감소의 예측을 위하여, 보리호위축병(BaYMV)에 대한 저항성 품종과 이병성 품종간 수량구성요소, 수량 및 증질 변이를 건전구와 이병구에서 비교 조사하였다. 1. 보리호위축병의 이병주는 BaYMV에 감염된 것으로 나타났으며, 이병정도는 감수성 품종인 백동에서 9, 저항성 품종인 내한쌀보리에서 1정도 발병하였다. 2. 감수성 품종인 백동은 천립중을 제외한 간장, 수당립수, $\textrm{m}^2$당 수수 등의 수량구성요소가 유의하게 감소하였으며, 수량은 대조구의 20%수준으로 현저히 감소하였다. 3. 보리호위축병 감염구에서 종자의 발아율은 감수성 품종과 저항성 품종간에 차이가 없었으나, 정립률은 감수성 품종인 백동에서 설립중이 유의하게 증가하였으며, 대조구에 비하여 정립률과 조단백질 함량 모두 유의한 차이를 보였다. 4. 보리호위축병은 간장, 수량, 정립률, 수수, 천립중, 1수립수 등의 피해와 부의 상관을, 조단백질 함량과는 정의 상관을 보여 보리호위축병에 이병이 되면 수량 및 품질에 크게 피해를 주는 것으로 나타났다.
A rapid and sensitive assay for specific detection and identification of barley yellow mosaic virus(BaYMV) was set up using the reverse transcriptase polymerase chain reaction(RT-PCR). A couple of primers was select to discriminate the viruses. PCR fragments of BaYMV(ca.0.9 kb) were obtained by using the method designed for BaYMV capsid protein. RT-PCR fragments were cloned with vector pT7 Blue and the resulting clones were sequenced. Capsid protein of BaYMV consisted of 297 amino acids and 891 nucleotides. The capsid protein sequence of BaYMV showed that 98% of nucleotides and 99% of amino acids homology.
맥류 주 재배지인 전남북 및 경남북을 중심으로 국내에서 밀, 보리 등 맥류에 심각한 피해를 일으키는 바이러스인 BaYMV, BaMMV 그리고 SBWMV를 대상으로 바이러스 발병 현황 조사를 실시하였다. RT-PCR 방법을 이용하여 진단 한 결과 2014년과 2015년 발병포장 내 이병면적율은 5% 미만에서 90% 이상까지 지역에 따라 다양하게 확인되었다. 2014년 조사 결과 전북지역의 부안과 김제에서 90% 이상으로 가장 높은 이병면적율을 보였고, 전남 지역의 보성, 강진, 해남, 장흥 지역은 30%의 이병면적율을 보였다. 2014년 조사결과 전남북 및 경남북 모든 지역에서 BaYMV가 확인되었고, 전남의 일부 지역에서는 BaYMV가 우점하면서 BaMMV와 복함 감염되어 피해를 주고 있는 양상을 보였다. 2015년의 전체적인 발생상황은 군산지역에서 70%로 높은 이병면적율을 보임과 동시에 전북의 다양한 지역에서 BaYMV 감염이 확인되었다. 또한 전남 지역 중 영광지역이 BaYMV와 BaMMV의 복합 감염으로 나타났다. SBWMV 감염이 확인된 고성지역을 제외하고 조사기간 동안 경남북의 모든 조사 지역에서 BaYMV 단독 감염으로 확인되었다. 본 실험 결과 지역별 기온차이에 의해 복합감염 형태의 발병양상의 차이가 나타났으며, 지구 온난화에 의한 기온상승을 대비하여 관련 연구가 더 필요할 것으로 사료된다.
Testing a large number of samples from field monitoring and routine indexing is cumbersome and the available virus detection tools were labor intensive and expensive. To circumvent these problems we established tissue blot immunoassay (TBIA) method an alternative detection tool to detect Barley mild mosaic virus (BaMMV) and Barley yellow mosaic virus (BaYMV) infection in the field and greenhouse inoculated plants for monitoring and routine indexing applications, respectively. Initially, leaf and stem were tested to determine suitable plant tissue for direct blotting on nitrocellulose membrane. The dilutions of antibodies were optimized for more efficient and economical purposes. Results showed that stem tissue was more suitable for direct blotting for it had no background that interferes in the reaction. Therefore, this technique was referred as direct stem blot immunoassay or DSBIA, in this study. Re-used diluted (1:1000) antiserum and conjugate up to 3 times with the addition of half strength amount of concentrated antibodies was more effective in detecting the virus. The virus blotted on the nitrocellulose membrane from stem tissues kept at room temperature for 3 days were still detectable. The efficiency of DSBIA and RT-PCR in detecting BaMMV and BaYMV were relatively comparable. Results further proved that DSBIA is a rapid, reliable and economical detection method suitable for monitoring BaMMV and BaYMV infection in the field and practical method in indexing large scale of barley materials for virus resistance screening.
최근 국내 맥류 재배지에서는 대부분 BaMMV, BaYMV, BYDV의 발생이 확인되고 있다. 본 연구에서는 multiplex reverse transcription polymerse chain reaction (mRT-PCR) 방법에 의해 이들 3종류의 바이러스를 동시에 진단하는 방법을 확립하였다. 이들 3종 바이러스의 외피단백질 유전자 정보를 활용하여 각 바이러스에 대한 primer를 제작하였다. mRT-PCR에 사용한 primer는 RT-PCR 반응의 민감도와 특이성에 의해 선발하여 primer 농도와 mRT-PCR의 조건을 설정하였다. 각 바이러스에 대하여 선발된 primer 사용에 의한 mRT-PCR 결과 BaMMV 594 bp, BaYMV 461 bp, BYDV 290 bp의 PCR 산물을 얻을 수 있었다. 본 연구에서 확립된 맥류 바이러스 동시진단방법은 신속하고 특이적인 진단 뿐 아니라 맥류 바이러스병의 전염 등 역학 연구에도 활용 될 것으로 기대된다.
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[게시일 2004년 10월 1일]
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