본 연구에서는 Bacillus subtilis JK-1의 생물계면활성제 생산을 위한 배양 특성을 조사하기 위하여 다양한 배양 온도와 배지의 pH, NaCl 농도에 따른 균주의 생장과 배양액의 pH, crude 생물계면활성제의 표면장력을 배양 시간대별로 측정하였다. B. subtilis JK-1은 $15-45^{\circ}C$와 pH 6-10, 0-10% (w/v) NaCl 농도의 환경에서 생장과 생물계면활성제 생산이 가능하였으며, 배양액의 pH는 중성 또는 약알칼리성으로 점차 변화 하였다. 생물계면활성제 생산은 pH 7.0의 초기 배지에서 $35^{\circ}C$, 48시간 동안 배양했을 때 최대였으며, 이 때의 표면장력은 24.0mN/m이었다. 그리고 배지 내 NaCl 농도가 0% (w/v)에서 10% (w/v)로 증가할수록 균주 생육도는 감소하였고, 최종 배양액의 pH는 약알칼리성에서 산성으로 변화하였으며, 표면장력 값은 증가하였다.
청국장으로부터 알칼리성 pretense 생성이 우수한 균주를 분리한 후 형태적, 생리.생화학적 특성 및 16S rRNA 유전자 염기서열을 통한 계통분석을 이용하여 동정을 실시한 결과 Bacillus subtilis JK-1으로 판명되었다. B. subtilis JK-1이 생산하는 pretense의 최적 활성 pH와 온도는 각각 9.0과 $55^{\circ}C$이었으며, $40{\sim}80^{\circ}C$의 sh도에서 안정하였다. 본 균주는 배지 중에 탄소원과 질소원, 무기염으로 1.0% (w/v) xylose와 1.0% (w/v) yeast extract, 0.3% (w/v) $CuSO_4$를 사통하였을 경우 최대의 알칼리성 protease 생산성을 나타내었다. B. subtilis JK-1의 생육은 배양 후 12시간만에 최대 성장을 나타냈으며, 효소 활성은 8시간부터 급격히 증가하여 $16{\sim}20$시간에 최대 활성을 나타내었다.
본 연구에서는 원유, 휘발유, 등유, 경유를 분해하면서 생물 계면활성제를 생산하는 균주인 B. subtilis JK-1을 선별하여 생물계면활성제 생산에 관한 연구를 수행하였다. 생물계면활성제 생산을 위한 최적 배지를 결정하기 위해 다양한 탄소원과 질소원, 무기염류를 조사하였다. B. subtilis JK-1은 탄소원인 1.0%(w/v) soluble starch와 질소원인 0.5% (w/v) skim milk를 포함한 배지에서 96 시간 동안 배양한 결과 가장 많은 생물계면활성제를 생산하였으며, 이 때 탄소원과 질소원의 비율은 2.0이었다. 그리고 0.1% (w/v)의 $KNO_3$는 생물계면활성제 생산을 위한 최적 무기염으로 확인되었다. B. subtilis JK-1은 LB 배지와 TSB 배지보다 본 연구에서 확립한 생물계면활성제 생산 최적 배지에서 더 많은 생물계면활성제를 생산하였다. 생물계면활성제 생산 최적 배지에서 B. subtilis JK-1 배양액의 표면장력은 균주 접종 후 48시간 만에 47.3 dyne/cm에서 24.0 dyne/cm로 감소하였다.
토양으로부터 chitinase를 생성하는 균주를 분리하여 동정한 결과 Bacillus subtilis로 판명되었으며, 분리한 균주를 Bacillus subtilis JK-56이라 명명하였다. B. subtilis JK-56의 chitinase 생산 최적 조건을 검토한 결과 1% chitin, 0.5% polypeptone, 0.1% KCI, 0.05% MnS $O_4$.4$H_2O$이며 초발 pH 7.0, 배양온도 37$^{\circ}C$에서 가장 많은 효소를 생산하였다. 본 균주가 생산하는 chitinase를 정제하기 위해서 native-PAGE를 이용해 효소활성 band를 확인한 결과, 1개의 강한 활성 band와 2개의 약한 활성 band를 가지는 isozyme으로 확인되었다. 확인된 isozyme을 정제한 결과, isozyme 중 1개의 강한 활성 band를 정제하였고 정제된 효소를 Chi-56A라고 명명하였다 Chi-56A의 효소 특성에 관해서 실험한 결과 분자량은 약 53kDa, pI는 4.3으로 확인되었다. 본 효소는 $65^{\circ}C$까지 상당히 안정하였으며 효소의 최대활성 온도도 $65^{\circ}C$로 확인되는 등 열에 대해 상당히 안정한 효소로 확인되었다. Collidal chitin에 대한 정제효소 Chi-56A의 $K_{m}$ 값은 17.33g/L였다. 그리고 pH 6.0에서 최대의 활성을 나타내었고, 산성범위보다 알칼리범위에서 안정한 것으로 나타났다. 또한 $Mn^{2+}$ 존재 하에서 높은 활성을 나타내었고 C $O^{2+}$와 $Mg^{2+}$ 존재 하에서도 활성이 약간 증가한 반면에 H $g^{2+}$ 존재 하에서는 상당한 저해를 받았다. Chito 올리고당에 대한 분해 산물을 HPLC로 확인해 본 결과 짝수개의 올리고당의 분해산물은 (GlcNAc)$_2$만을 생산하였고 홀수개의 올리고당에 대해서는 GlcNAc와 (GlcNAc)$_2$를 생산하는 것으로 비환원성 말단으로부터 이당체인 diacetyl chitobiose ((GlcNAc)$_2$)를 생산하는 exo형 chitinase로 추정 된다.
This study examined Tetraselmis sp. JK-46 isolated from seawater from the East Sea. Deep seawater (DSW) had a greater effect on the growth of Tetraselmis sp. JK-46 than surface seawater (SSW). The crude protein, lipid, carbohydrate and ash contents of Tetraselmis sp. JK-46 cultured with DSW were 27.2, 37.1, 13.2 and 26.3 %, respectively, and these values were similar to the results for samples cultured with SSW. The contents of Mg, Ca, Fe and K in the DSW cultured samples were 7080.3, 1009.6, 251.2, and 2749.7 mg/100 g, respectively. The fatty acid compositions of Tetraselmis sp. JK-46 cultured with DSW and SSW were 53.7 and 49.0 % polyunsaturated fatty acids (PUFA) and 25.7 and 30.7 % saturated fatty acids (SFA), respectively. The total amino acid contents of the samples cultured with DSW and SSW were 7392.6 and 6376.0 mg/100 g respectively. The 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) radical scavenging activity of Tetraselmis sp. JK-46 extracts increased with the concentration of the chloroform and ethyl acetate fractions. The half maximal inhibitiory concentrations ($IC_{50}$) of the chloroform and ethyl acetate fractions of DSW and SSW cultured samples were 1.2 and 2.6 mg/mL, and 3.1 and 3.3 mg/mL, respectively. The ethyl acetate fractions of DSW and SSW cultured samples has anticoagulant activity and the activated partial thromboplastin times (APTT) were 93.4 and 89.3 sec., respectively. The chloroform and ethyl acetate fractions showed antimicrobial activity against Bacillus subtilis, Escherichia coli and Candida albicans.
Kim, Hyo-Jin;Hwang, In-Sun;Kim, Beom-Seok;Hwang, Byung-Kook
The Plant Pathology Journal
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제22권1호
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pp.75-89
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2006
The actinomycete strain JK-1 that showed strong inhibitory activity against some plant pathogenic fungi and oomycetes was isolated from Jung-bal Mountain in Ko-yang, Korea. The strain JK-1 produced spores singly borne on sporophores and the spores were spherical and 0.9-1.2 11m in diameter. The cell wall of the strain JK-1 contained meso-diaminopimelic acid. The actinomycete strain JK-1 was identified as the genus Micromonospora based on the morphological, physiological, biochemical and chemotaxonomic characteristics. From the 168 rDNA analysis, the strain JK-1 was assigned to M aurantiaca. The antibiotic MA-1 was purified from the culture broth of M aurantiaca JK-1 using various purification procedures, such as Diaion HP20 chromatography, C18 flash column chromatography, silica gel flash column chromatography and Sephadex LH-20 column chromatography. $^{1}H-$, $^{13}C-NMR$ and EI mass spectral analysis of the antibiotic MA-1 revealed that the antibiotic MA-1 is identical to phenylacetic acid. Phenylacetic acid showed in vitro inhibitory effects against fungal and oomycete pathogens Alternaria mali, Botrytis cinerea, Magnaporthe grisea, Phytophthora capsici and yeast Saccharomyces cerevisiae at < 100 $\mug$$ml^{-1}$. In addition, phenylacetic, acid completely inhibited the growth of Sclerotinia sclerotiorum, Bacillus subtilis, Candida albicans, Xanthomonas campestris pv. vesicatoria at < $\mug$$ml^{-1}$. Phenylacetic acid strongly inhibited conidial germination and hyphal growth of M grisea and C. orbiculare. Phenylacetic acid showed significantly high levels of inhibitory' effect against rice blast and cucumber anthracnose diseases at 250 $\mug$$ml^{-1}$. The control efficacies of phenylacetic acid against the two diseases were similar to those of commercial compounds tricyclazole, iprobenfos and chlorothalonil .n the greenhouse.
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[게시일 2004년 10월 1일]
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