Bacillus sphaericus 1593 is a larvicidal toxin-producing mosquitocidal bacterium. The toxin contains a parasporal crystalline inclusion which is composed of a protein that is activated under alkaline condition. To enhance alkaline environment around toxin protein, cryptic plasmid cured, B. sphaericus 1593 was transformed by the Bacillus pasteurii urease gene which generate ammonia from urea. Transformant produced urease at about 80% more than wild type strain. B. sphaericus 1593, and the urease gene was stably maintained. It also produced crystalline toxin protein at the same level as the wild type strain B. sphaericus 1593.
Escheriachia coli pSL 2-1 clone은 Bacillus sphaericus 1593의 모기살충 유전자를 클로닝한 재조합 DNA이다. 이 클론이 생산하는 살충독소 단백질의 분자량을 SDS-polyacrylamide gel을 이용하여 측정했다. B. sphaericus 1593균이 생산하는 독소결정체를 분리하여 전기영동을 한 결과는 6개의 단백질밴드(43, 58, 64, 100, 113, 130Kd)가 형성되었으나, 독소결정체를 알칼리 pH로 용해하여 전기영동을 하면 2개의 단백질 밴드(43과 64Kd)만이 나타났다. 그러나 대장균 pSL2-1균이 생산하는 독소단백질을 Sephadex G-200으로 정제하여 모기유충에 살충력이 있는 단백질을 전기영동한 결과는 42Kd만이 나타났다. LC50은 2 $\mu\textrm{g}$/$m\ell$이었다. B. sphaericus와 pSL2-1 clone 생산하는 살충단백질은 42Kd 단백질인 것으로 생각된다.
Bacillus sphaericus 1593 is pathogenic to the larvae of a number of mosquito species that are known as important vectors for the transmission of certain human and animal diseases. As a preliminary experiment for developing a multfunctional B. sphaericus 1593 as a potent antagonist, we investigated the conditions for the protoplast transformation system of B. sphaericus 1593 using the plasmid pGB215-110$\Delta$B. The protoplast of B. sphaericus 1593 were obtained most efficiency by treating the cells with 500 $\mu$g/ml of lysozyme in the SMM buffer containing 0.5 M sucrose at pH 8.0 and 40$\circ$C for 60 minutes. The cell wall was regenerated on the plate containing 1.2% agar and 0.8 M mannitol. Under the best condition for protoplast formation and regeneration established in the work the highest frequency of transformation was achieved with the 40% PEG (M.W 4,000) treatment for 15 minutes of incubation at 4$\circ$C, and subsequently for 120 minutes incubation at 30$\circ$C for phenotypic expression. The highest transformation efficiency were observed at 1.0 $\mu$g/ml of the final concentration of the plasmid DNA and the plasmids were found to be fairly stable since about 70% of the plasmids were maintained after 8 successive daily transfers onto the fresh medium.
고정화 inulinase를 이용하여 inulin으로부터 fruc-tose 시럽을 연속적으로 생산하기 위하여 Bacillus sphaericus 188-1이 생성하는 inulinase를 부분 정제한후 5시간 NaIO$_4$로 산화시킨 cellulose에 고정화시킨 다음 이들의 성질을 조사하였다. 산화 cellulose에 고정화시킨 inulinase의 활성은 g당 47 Unit 이었고 고정화수율과 활성수율은 각각 41%와 39%이었다. 고정화시킨 inulinase의 작용 최적온도와 pH는 각각 5$0^{\circ}C$, pH 9.0이었고 5$0^{\circ}C$, pH 8.0~10.0에서 비교적 안정 하였다 고정화시킨 inulinas의 활성은 K+, Ca2+, Mn2+과 Hg2+에 의하여 활성화 되었으며 EDTA(10mM)에 의하여 심하게 저해되었다.
International Journal of Industrial Entomology and Biomaterials
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제2권2호
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pp.185-189
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2001
Wild type Bacilus thuringiensis subsp. israelensis and B. sphaericus toxins have been used separately as active in ingredients for bacterial insecticides to control mosquito larvae due to their comparable toxicity to chemical insecticides. Cry11B, recently cloned from B. thuringiensis subsp. jegathesan, shows higher toxicity against three major species of mosquito larvae than Cry11A, one of the major component of B. thuringiensis subsp. israelensis inclusion body. To determine whether the combination of cry11B and B. sphaericus binary toxins is as toxic as B. thuringiensis subsp. israelensis parental strain, cry11B and B. sphaericus binary toxins genes were co-expressed as an operon using cytlA promoters/STAB-SD hybrid expression system in B. thuringiensis subsp. israelensis acrystalliferous strain 4Q7. However, unexpectedly, B. sphaericus binary toxins were barely produced, whereas relatively large amount of Cry11B was produced. When this strain was grown in four different media, NB+G and Peptonized Milk produced more toxin proteins and spores per unit of media than GYS and G-Tris. Toxicity of this strain against fourth instar Culex quinquefasciatus was ranged from of 8.3 to 45.7 ng/ml, with NB+G culture being the highest, and GYS culture was the lowest.
본 연구는 감귤원 토양유형별로 고정되어 있는 난용성 인산염함량을 파악하고 이를 생물학적으로 이용하고자 인산가용화 우수미생물을 선발하여 특성을 조사하였다. 토양중 난용성 인산염의 형태별 분포는 Al-P>Ca-P>Fe-P 순으로 화산회토 토양이 비화산회토 보다 많았다. PDA-P배지를 이용하여 인산염 가용화능이 우수한 Bacillus sphaericus를 분리하였으며 pH 4~5와 $30^{\circ}C$에서 생육이 제일 좋았다. Bacillus sphaericus은 $AlPO_4$에서 324.5 ppm, $Ca_{10}(PO_4)_6(OH)_2$에서 334.8 ppm, $Ca_3(PO_4)_2$에서 207.0 ppm의 유리인산을 생성하였으며 인산효소활성은 $35^{\circ}C$에서 배양할 때 높았다. Bacillus sphaericus를 Bentonite 등 담체에 고정 후 온도를 달리하여 7개월 보존기간 동안 밀도변화를 조사한 결과 $10^5c.f.u.\;g^{-1}$ 수준과 인산가용화능을 유지하여 추후 생물비료로 이용이 가능할 것으로 기대된다.
Bacillus sphaericus 1593 K-5 균주의 Culex pallens 모기유충에 대한 LC$_{50}$(cells/$m\ell$)은 2.6$\times$$10^2$이었다. B. sphericus 1593 K-5 Spo-D 1216 균주는 Culex pallens 모기유충에 대해 독성을 나타내지 않았다. B. sphaericus 1593 K-5 균주는 포자가 형성되어 가면서 독성이 증가함을 보였다. B. sphaericus 1593 K-5 균주의 세포질을 Sep-hadex G-100 컬럼상에서 gel permeation 크로마토그래피를 행하였을 때 3개의 단백질 분획을 보였으며 이 중 한 분획이 활성분획있다. 이 활성 분획을 DEAE-Sepha dex A-50 컬럼상에서 ion-exchange 크로마토그래피를 행하였을 때 4개의 단백질 분획을 보였으며 이중 한 분획이 활성분획이었다. B. sphericus 1593 K-5 Spo-D1216균주의 세포질은 Sephadex G-100 컬럼상에서 gel permeation 크로마토그래피를 행하였을 때 2개의 단백질 분획을 보였으며 이 분획 모두가 활성이 없음이 생체실험 결과 밝혀졌다.다.
토양으로부터 강력한 CAH activity를 갖는 균주를 분리하여, 생화학적, 배양학적, 전자현미경 동정을 한 결과, Bacillus sphaericus로 확인되었으며, 이를 B. sphaericus 366M-9로 명명하였다. 또한 이 균으로부터 최초로 cephalosporin-C deacetylase(CAH)를 분리 정제하였다. 정제수율은 약 7.5% 였으며, B. sphaericus 366M-9에서 분리한 CAH-9의 최적활성 온도는 $50^{\circ}C$였으며, 효소안정 온도구간은 30~$50^{\circ}C$이다. 또한 최적 활성 pH는 7.0이었으며, 효소안정 pH구간은 pH 6.0~8.0으로 90% 이상의 잔존 활성도를 나타내었다. 효소반응속도에 미치는 기질의 영향에서는 $K_{m}$ 값은 0.87 mM 이며,$ V_{max}$는1.22 unit/ml이었다.다.
The cholesterol oxidase produced from Bacillus sphaericus was purified and characterized. Through a series of purification procedures including DEAE-Toyoperal 650C, Sephadex G-200 and DEAE-Sephadex A-50 column chromatography, the purified enzyme was shown to have a specific activity of 0.179 units/mg protein having 31.8 fold purification and final yield of 12%. The molecular weight of the enzyme was estimated to be 47kDa and 47.tkDa by Sephadex G-200 chromatography and SDS-PAGE. The optimum temperature and pH for the enzyme were 30C and 6.0, respectively. The activity of the purified cholesterol oxidase was inhibited by Fe2+ and Hg+.
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[게시일 2004년 10월 1일]
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