김치의 가수분해효소로서 발효원으로 사용되고 균체증식에 필수적인 아미노산 생산에 관여하는 단백질분해호소를 생성하는 균주를 분리하여 동정하였다. 시판되는 풀무원 김치의 5종(전라도김치, 숙성김치, 열무김치, 포기김치, 맛김치)에서 단백질분해효소 활성을 지닌 균주 중 곰팡이와 효모를 제외하고 총 9주를 분리하여 whole cell protein pattern 및 API kit 으로 동정하여 각각의 균주들을 Lactobacillus sp. 1종, Leuconostoc sp. 1종, Bacillus sp. 6종, Brevibacillus sp. 1종으로 판정되었다. 분리된 9종과 단백질 분해효소 활성이 높은 표준균주인 Bacillus subtilis KCCM 12248와 Bacillus licheniformis KCCM 11851에 대해 단백질분해활성을 비교한 결과 김치에서 분리되는 K-2(Brevibacillus속)가 0.11 unit/mg으로 가장 높은 값을 보였다.
서로 다른 11주의 Bacillus coagulans와 13종의 Bacillus 속 14주를 deoxyribonucleic acid(DNA)-DNA hybridization method에 의해서 분류학적인 연구를 하였다. 사용한 B. coagulans 11주중 6주는 흙에서(일본 오사까교외) 분리했고, 나머지 5주는 ATCC, IFO에서 authentic strains을 얻어서 사용했다. 사용된 B. coagulans는 Bergey's Manual(8th ed)에 의거 Gordon씨들의 방법으로 동정한 결과 B. coagulans로서 확인되었다. 이렇게 동정된 B. coagulans을 분자 생물학적 차원에서 지금까지의 Conventional taxonomic study와의 관계를 연구하기 위해서 사용한 11주의 B. coagulans중 ATCC 7070을 $^3$H labeled input 즉 standard로 해서 사용했을 때 B. coagulans 내의 intraspecific DNA homology indexes는 76% 이상으로 나타났다. 이와같은 발견은 Bergey's Manual에 의거한 conventional taxonomic study의 결과와 잘 일치하고 있었음으로 새로 분리한 6주와 authentic sources로부터 받은 5주는 같은 group의 B. coagulans라는 사실을 입증해 주었다. 그리고 B. coagulans와 다른 species의 Bacillus 속 즉 B. pumilus(168), B. licheniformis (IFO 12107), B. pumilus(IFO12110), B. firmus(ATCC 14575), B. lentus(ATCC 10840), B. circulans(ATCC 4513), B.macelans(ATCC 8244), B.polymyxa, (ATCC 842), B.sphaericus(ATCC 14577), B.brevis(ATCC 8246, IFO 12334), B.laterosporus(ATCC 64), B. pantothenticus(ATCC 14576) interspecific DNA homology indexes가 각각 2~4%을 보임으로써 B. coagulans는 molecular level면에서 이들 Bacillus 속과는 상동성 관계가 적음을 나타내었다. 반면에 B. coagulans(ATCC 7050)와 E. coli(F-12)와의 상동성은 1%이하였다.
Traditional kochujang samples were collected from the folk village in Sunchang to find the major microbial composition and correlation between the taste and the microbial properties. Among the 29 samples, 17 samples showed Bacillus licheniformis as dominant strain with 11 samples Bacillus subtilis and 1 sample Staphylococcus pasteuri. Subdominant strain of 17 samples was Bacillus licheniformis with 12 samples Bacillus subtilis. Dominant strain numbers varied in rage of $6.60{\sim}8.38$ logCFU/g with subdominant strain number $5.90{\sim}7.86$ logCFU/g and total microbial number $6.64{\sim}8.56$ logCFU/g respectively. Bacterial type number varied in range of $6{\sim}18$ with the average 10.5 types. Fungi were found only in 2 samples and identified all to be Aspergillus oryzae. Yeasts were found in 25 samples. The dominant yeast strain of 23 samples was identified to be Zygosaccharomyces pseudorouxii and that of 2 samples Zygosaccharomyces rouxii. Yeast type variety showed that only single type was found in 15 samples, 2 types in 8 samples, 3 types in 1 sample and 4 types in 1 sample. Fungal number was 3.90 and 4.08 logCFU/g and yeast numbers varied in range of $3.90{\sim}6.43$ logCFU/g. The sensory scores of kochujang showed positive correlation with type numbers, but no significant correlation with the other microbial properties like total bacterial number, dominant bacterial number, subdominant bacterial number and dominant yeast number.
Resistance of perilla varieties to Botrytis cinerea LVF12 was evaluated, while antagonistic bacteria were selected and tested for their efficacy towards biological control of gray mold rot caused by B. cinerea. Among 11 perilla varieties tested for disease resistance, Milyang variety showed some degree of resistance, while the rest of varieties showed no resistance. Among 250 bacterial isolates collected from perilla loaves and rhizosphere of perilla plants, six isolates showed high levels of inhibitory effect on mycelial growth and conidial germination of B. cinerea in in vitro test. Using the pot test in growth chambers these isolates showed high levels of disease suppression, with Nl isolate showing 95.3% of control value and N4 isolate showing 90.8% of control value. Further test was performed to evaluate the two isolates ability for disease prevention and/or disease therapy, and results showed almost 100% of control vague. Isolates Nl and N4 were identified as Bacillus licheniformis and 5. megatepium, respectively, according to Bergey's manual, API 20E and 50CHB test kit, and Transmission electron microscope.
한국 재래식 간장의 독특한 맛을 생성하는 B. licheniformis SSA3-2M1 의 배양액으로부터 proteinase 를 정제한 결과 2 종의 proteinase 의 역가를 확인할 수 있었다. Proteinase I 의 역가는 II 보다 두배가량 되며 최적 pH 가 7-11.5 이었다. Proteinase I 의 역가는 II 보다 두배가량 되며 최적 pH 가 7-11.5 이었다. Proteinase II 의 최적 pH 는7-9 이며 proteinase II 는 I 보다 pH3-5 부근의 상성에서 더 안정하고 활성이 강하였다. Proteinase I 과 II 의 최적온도는 각각 50.deg.C 였으며, proteinase II 의 온도안정성은 30-45 .deg.C 온도범위에서 proteinase I 보다 더 안정하였다. Proteinase I 은 45.deg.C 에서 60% 가 실현되었으며 protein II 는 45.deg.C 에서 5% 가량 실활되었다. 염에 대한 영향은 proteinase I 이 염의 농도 25-35% 범위에서 proteinase I 보다 효소활성이 높은 것으로 나타났다. Proteinase 치는 casein 을 기질로 사용하였을 경우, proteinase I 은 6.89 mg/ml, proteinase II 는 9 mg/ml 의 $K_{m}$ 치를 나타내었다. 이결과는 proteinase I 이 II 보다 기질에 대한 친화력이 높은 것으로 나타났다. 각종 금속이온의 농도 1 mM 에서는 Pb($CH_{3}$CCO)$_{2}$ 는 효소 활성을 증가시켰고 $ZnSO_{4}$, $7H_{2}$O, $K_{2}$$SO_{4}$, $HgSO_{4}$ 등은 저하시켰으며, 5 mM 이상에서는 $HgSO_{4}$ 와 $ZnSO_{4}$ 가 다른 염에 비해서 특히 효소활성을 많이 저히하였다. Proteinase I 과 II 는 대두 단백을 가수분해하여 peptide 와 아미노산을 생성하였으머 peptide 를 다시 아미노산으로 분해하였다. Proteinase I 과 II 는 한국재래식 간장의 중요 맛성분인 아미노산을 생성하는 주효소로 밝혀졌다.
콩알메주 model system에 4종의 Bacillus 균주를 접종하여 45시간 발효시킨 후 메주의 일반성분, 효소활성, 향기성분 등을 분석하고 제조된 메주로 청국장, 된장, 간장을 제조하여 제품의 관능을 평가하였다. 발효메주의 pH는 $7.98{\sim}8.68$ 이었으며 아미노태질소는 $286{\sim}439$ mg%, 암모니아태질소는 $0.11{\sim}0.23%$, 환원당은 $0.65{\sim}2.24%$ 그리고 유리지방산은 $0.33{\sim}1.10%$의 수준이었다. 단백질과 당의 분해율은 B. subtilis구간에서 높았으며 암모니아태질소와 유리지방산의 생성율은 B. natto 구간에서 높게 조사되었다. 효소활성은 시간에 따라 증가하였다가 발효 40시간대부터 정체되는 양상이었으며 B. subtilis구간의 효소활성이 높았다. 각 실험구간별로 유리당 5종, 지방산 5종, 유기산 6종을 검출하였으며 당에서는 stachyose와 raffinose 함량이 많았고 유기산은 각 균주별로 특징적인 구성비를 보였으며 아미노산과 지방산은 보고된 실험결과들과 유사하였다. 향기성분은 총 81종이 검출되었으며 pyrazine류와 3-methyl-1-butanol, benzaldehyde등이 Bacillus 메주의 공통적인 향기성분으로 분석되었다. 각 메주를 혼합하여 제조한 장류제품의 관능평가를 실시한 결과 청국장은 B. natto와 B. licheniformis를 혼합한 구간이, 된장에서는 B. megaterium과 B. subtilis의 혼합구간이, 간장에서는 B. megaterium과 A. oryzae의 혼합구간이 양호한 평가를 받아 각 제품별로 적정한 균주를 사용할 필요성이 있음을 알 수 있었다.
양송이는 재배사라는 밀폐된 환경에서 재배되는 바 양질의 생산을 위해서는 재배사 내 환경에 대한 정보가 요구된다. 본 연구는 양송이 재배사내 실내환경에 대한 기초 정보를 얻고자 수행되었다. 재배사 내 온도와 습도는 $19.75{\pm}0.35^{\circ}C$, $87{\pm}3.67%$로 세균이 서식할 수 있는 환경조건이었으며, 부유세균의 농도는 $3.84{\times}10^3cfu/m^3$로서 환경부에서 고시한 실내공기질 오염유지 기준치인 $8.0{\times}10^2cfu/m^3$을 초과하는 수치였다. 분리된 부유세균은 Advenella kashmirensis, Bacillus vietnamensism, B. licheniformis, Burkholderia sordidicola, Fictibacillus phosphorivorans, Lysobacter daejeonensis, Microbacterium esteraromaticum, Pseudomonas aeruginosa, P. protegens, P. gessardii, P. mosseli 등 7속 11종으로 동정되었다.
본 연구는 치어기 조피볼락 Sebastes schlegeli 사료내 생균제 첨가가 넙치의 성장 및 면역반응에 미치는 영향을 평가하였다. 실험사료는 주 단백질원으로 북양어분(white fish meal), 콘글루텐밀(corn gluten meal), 탈피대두박(dehulled soybean meal)을 사용하였으며, 탄수화물원으로는 밀가루(wheat flour)를, 지질원으로는 고도불포화지방산(n-3 HUFA)이 다량 함유된 오징어간유(squid liver oil)를 사용하였다. 생균제의 첨가효과를 확인하기 위하여 B. polyfermenticus(BP), Bacillus licheniformis(BL) 및 복합종균(B. polyfermenticus+Saccharomyces cerevisiae; BP+SC)을 실험사료 내에 각각 $1.0{\times}10^7$ CFU/kg diet 수준으로 첨가하였다. 2주간의 예비사육 후, 평균무게 $12.0{\pm}0.1g(mean{\pm}SD)$인 조피볼락을 500 L 원형수조에 각 실험구 당 각각 20마리씩 3반복으로 무작위로 배치하였고, 실험사료는 1일 2회 어체중의 $1.7{\pm}0.6%$(오전 10시, 오후 4시)씩 12주간 공급 하였다. 증체율, 사료효율, 일간성장율 및 단백질 전환효율에 있어서 BP+SC를 공급한 실험구가 대조구(control)에 비하여 유의하게 높게 나타났지만(P<0.05), BP, BL 및 BP+SC를 공급한 실험구간에는 유의한 차이가 나타나지 않았다. 생존율에 있어서는 모든 실험구간에 있어 유의한 차이가 나타나지 않았다. 전어체 지방함량에 있어서 대조구가 다른 모든 실험구에 비해 높게 나타났으며, 전어체 단백질, 회분 및 수분함량에 있어서는 모든실험구간에 유의한 차이가 없었다. 혈액분석에 있어서 혈장내 glucose의 함량은 BP+SC를 공급한 실험구가 대조구에 비해 유의적으로 낮게 나타났으나, BP, BL 및 BP+SC를 공급한 실험구간에는 유의적인 차이가 나타나지 않았다. Respiratory burst activity(NBT assay)에 있어서 BP+SC와 BL을 공급한 실험구가 대조구에 비해 유의적으로 낮게 나타났으며, BP, BL 및 BP+SC를 공급한 실험구간에는 유의적인 차이가 나타나지 않았다. 혈청의 lysozyme 활성에 있어서는 BP와 BL을 공급한 실험구가 대조구에 비해 높게 나타났으며, BP, BL 및 BP+SC를 공급한 실험구간에는 유의적인 차이가 나타나지 않았다. 공격실험 결과, 폐사는 Edwardsiella tarda를 접종한지 1일 후부터 시작하여 11일째 종료 하였다. 생균제를 투여한 모든 실험구가 대조구에 비해 초기폐사율이 낮게 나타났다. 공격실험 후 8일째부터 종료시 까지는 BP+SC를 공급한 실험구가 대조구에 비해 유의적으로 낮게 나타났으며, BP, BL및 BP+SC를 공급한 실험구간에는 유의한 차이가 나타나지 않았다. 상기 결과를 토대로, 조피볼락 사료내 B. polyfermenticus, B. licheniformis 및 B. polyfermenticus 와 S. cerevisiae의 혼합첨가는 조피볼락의 성장 및 사료효율 증진과 항산화능 및 특정질병저항성에 좋은 효과를 나타낼 수 있을 것으로 사료된다.
본 연구에서는 청국장에서 biogenic amine의 함량을 조사하고, 이를 생성하는 미생물의 스크리닝 및 biogenic amine 형성 등을 통하여 생성원인을 규명하고자 하였다. 그 결과 국내 시판 청국장에는 putrescine, histamine, tryptamine 등 11종의 biogenic amine이 검출되었으며, 이 중 tyramine이 $4.2{\pm}0.9-483.1{\pm}28.4mg/kg$의 범위를 보여주여 다른 amine에 비하여 높게 나타났다. 청국장내 균주는 B. amyloliquefaciens, B. subtilis, B. licheniformis 등이 분리 동정되었고, 이들 균주에 대한 탈탄산 효소 활성 스크리닝을 살펴본 결과 모두 양성(+) 반응을 보여주었다. 최종적으로 균주에 대한 biogenic amine 생성을 확인하였을 때, 청국장내 존재하는 균주가 탈탄산 효소 활성을 통하여 biogenic amine 생성하는 것을 확인할 수 있었다.
전통발효식품인 재래간장에서 fibrinolytic enzyme를 생산하는 미생물을 분리하였고 산업적으로 활용하기 위해 분리된 미생물 중 fibrinolytic enzyme 활성이 우수한 YJ11-21 균주를 선발하였다. YJ11-21을 분자수준에서 16S rDNA 유전자 염기서열을 분석한 결과, Bacillus licheniformis로 동정되었다. Fibrinolytic enzyme 생산을 위한 최적 배양조건으로서 탄소원은 glucose, 질소원은 yeast extract를 첨가하였을 때 가장 높게 나타났다. 그리고 1% NaCl를 첨가한 배지에서 혈전용해 효소활성이 가장 높게 나타났고, 10% NaCl에서도 높은 효소활성과 생장률 또한 양호하여 YJ11-21는 내염성균으로 추정된다. YJ11-21를 $30^{\circ}C$에서 배양시 가장 높은 효소 활성과, 초발 pH 5-10까지 안정한 효소활성을 보였다. 그리고 pH 9에서 가장 높은 혈전용해 효소활성과 균주의 생장률이 나타났다.
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[게시일 2004년 10월 1일]
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