탄저균은 그람양성 아포형성세균으로 탄저를 일으키는 원인균이다. Bacillus cereus그룹에 속하는 22종을 포함하여 Bacillus 속의 29종에서 탄저균을 검증할 수 있는 DNA 마커를 개발하고 이를 이용하여 B. cereus 그룹에서 탄저균만을 구분하였다. 한국산 탄저균 경주로부터 709 bp마커(KHTS)를 확보하였다. KHTS분절로부터 얻어진 internal primer set의 PCR 산물은 B. cereus 그룹의 다른 종으로부터 탄저균만을 구별하였다.
Bacillus cereus group comprising B. cereus, B. thuringiensis, and B. mycoides was differentiated by polymerase chain reaction (PCR) and colony morphology. Prevalence of B. cereus group in rice and distribution of enterotoxin genes were determined as possible food poisoning agents. PCR using primers targeted for gyrB and cry genes could distinguish B. thuringiensis from B. cereus, and B. mycoides was differentiated by rhizoid morphological characteristics on nutrient agar. Among 136 rice and their processed products, prevalence of B. cereus group was 40%. B. cereus group consisted of 54 B. cereus, 11 B. thuringiensis, and 1 B. mycoides. Major isolates were B. cereus, with B. thuringiensis detected up to 10% among edible rice tested. Five enterotoxin genes, hbl, nhe, bceT, entFM, and cytK, were broadly distributed among B. cereus group, especially in B. cereus and B. thuringiensis. Prevalence of B. cereus group in rice and enterotoxin distribution suggest B. thuringiensis and B. cereus are toxigenic strain that should be controlled in rice and its products.
Park, Si-Hong;Kim, Hyun-Joong;Kim, Jae-Hwan;Kim, Tae-Woon;Kim, Hae-Yeong
Journal of Microbiology and Biotechnology
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제17권7호
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pp.1177-1182
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2007
Bacillus cereus group bacteria share a significant degree of genetic similarity. Thus, to differentiate and identify the Bacillus cereus group efficiently, a multiplex PCR method using the gyrB and groEL genes as diagnostic markers is suggested for simultaneous detection. The assay yielded a 400 bp amplicon for the groEL gene from all the B. cereus group bacteria, and a 253 bp amplicon from B. anthracis, 475 bp amplicon from B. cereus, 299 bp amplicon from B. thuringiensis, and 604 bp amplicon from B. mycoides for the gyrB gene. No nonspecific amplicons were observed with the DNA from 29 other pathogenic bacteria. The specificity and sensitivity of the B. cereus group identification using this multiplex PCR assay were evaluated with different kinds of food samples. In conclusion, the proposed multiplex PCR is a reliable, simple, rapid, and efficient method for the simultaneous identification of B. cereus group bacteria from food samples in a single tube.
본 연구에서는 서울, 경기, 강원도, 충남 지역의 벼를 수집하여 쌀겨와 현미에서의 $B.$$cereus$ group을 분리하였으며, 분포분석을 통해 작물의 오염 정도를 알아보았고, biofilm 형성시 특성을 연구하였다. $B.$$cereus$는 총 26개의 시료 가운데 쌀에서 34.6%, 쌀겨에서 50.0%로 가장 높은 분포도를 나타냈으며, $B.$$thuringiensis$는 쌀에서 3.9%, 쌀겨에서 23%의 분포를 보였다. 분리된 균주의 biofilm 형성 능력 실험에서는 시간이 지남에 따라 biofilm 형성 정도가 증가하였으며, 표준 균주에 비해 분리 균주가 biofilm 형성 능력이 높은 것으로 나타났다. 또한 biofilm이 형성된 $B.$$cereus$의 경우 항생제와 항균제 처리에 따른 최소저해농도는 부유 세균에 비해 대체적으로 높은 내성을 나타내는 것으로 확인되었다.
된장과 고추장에 대하여 Bacillus cereus 포자를 $10^5$ spore/g 접종하고 이의 저감화에 적용 가능한 허들로서 additive(95% ethanol 3%, 1% oregano 추출물 0.3%), Joule 가열($95^{\circ}C$, 5분) 및 초고압처리(500 MPa, $45^{\circ}C$, 5분)를 적용하여 Bacillus cereus 포자의 살균효과와 저장성을 분석하였다. 된장에 있어 AJ(additive+Joule 가열) 및 AJP(additive+Joule 가열+초고압) 처리구는 각각 2.80 log 및 3.74 log 감소효과를 보였고 고추장의 경우에는 각각 4.71 log 및 5.60 log 감소를 보여 Joule 가열처리구는 된장과 고추장에 있어서 additive 처리구와 함께 Bacillus cereus 포자의 살균에 상당한 시너지 효과를 나타내는 것으로 판단되었다. 한편 $30^{\circ}C$ 저장시험에서 additive, Joule 가열 및 초고압 병행 처리는 된장 및 고추장에서 낮은 수준의 포자를 유지하는 데에도 유효한 효과를 보여 AJ(additive+Joule 가열) 및 AJP(additive+Joule 가열+초고압) 처리기법은 된장 및 고추장의 Bacillus cereus 포자에 대한 효율적인 살균방법으로서 적용이 가능할 것으로 보였다.
수영만에서 분리된 Bacillus cereus group LS-1 의 형태학적, 생화학적 성상 및 지방산 조성 분석을 통하여 세균학적인 특성을 밝혔다. B. cereus group LS-1 은 면양혈구배지에서 비용혈성의 점조성 집략과 convex 하고 가장자리가 규칙적인 둥근형태로 운동성이 없고 glucose, maltose, sucrose 와 gelatin 을 이용하고 trehalose 와 salicin 을 분해하지 않으며 6.5% NaCl 에서 자라지 않는 Gram 양성의 중심성 아포형성간균으로 표준균주 B. cereus group 과 다소 차이를 나타내었다. 지방산 조성 분석에서 chain 의 길이가 $C_{12}$ 에서 $C_{17}$로 iso $C_{15}$와 iso $C_{13}$의 branched chain 이 우점하는 B. cereus group 의 전형적인 특징을 나타내었으며 $nC^{15}$가 검출되지 않는 B.mycoides GC subgroup B 로 0.312 의 similarity index(SI) 를 지칭하여 다른 연구 결과와도 일치하였다. 한편 API system (API 50 CHB & API 20E) 의 ATB computer profile 에서 "Doubful Profile" 99.7% 의 B. firmus 로 나타내어 큰차이를 나타내었다. 67 개의 biochemical character 로 B. mycoids S-12 는 각각 42%, 42% 59% 와 52% 의 similarity matrix 를 나타내었다. B. cereus group 간의 아주 낮은 similarity 를 나타내어 상당한 차이가 있음을 인식하였다. 따라서 key test 와 지방산 조성등을 종합하여 볼때 B. ceresu group 중의 B. mycoides 로 새로운 biotype 인 것으로 사료되며 지방산 조성 분석으로 동정함이 훨씬 용이하였다.
The Bacillus cereus group, also known as B. cereus sensu lato (B. cereus s.l.), is composed of various Bacillus species, some of which can cause diarrheal or emetic food poisoning. Several emerging highly heat-resistant Bacillus species have been identified, these include B. thermoamylovorans, B. sporothermodurans, and B. cytotoxicus NVH 391-98. Herein, we performed whole genome analysis of two thermotolerant Bacillus sp. isolates, Bacillus sp. B48 and Bacillus sp. B140, from an omelet with acacia leaves and fried rice, respectively. Phylogenomic analysis suggested that Bacillus sp. B48 and Bacillus sp. B140 are closely related to B. cereus and B. thuringiensis, respectively. Whole genome alignment of Bacillus sp. B48, Bacillus sp. B140, mesophilic strain B. cereus ATCC14579, and thermophilic strain B. cytotoxicus NVH 391-98 using the Mauve program revealed the presence of numerous homologous regions including genes responsible for heat shock in the dnaK gene cluster. However, the presence of a DUF4253 domain-containing protein was observed only in the genome of B. cereus ATCC14579 while the intracellular protease PfpI family was present only in the chromosome of B. cytotoxicus NVH 391-98. In addition, prophage Clp protease-like proteins were found in the genomes of both Bacillus sp. B48 and Bacillus sp. B140 but not in the genome of B. cereus ATCC14579. The genomic profiles of Bacillus sp. isolates were identified by using whole genome analysis especially those relating to heat-responsive gene clusters. The findings presented in this study lay the foundations for subsequent studies to reveal further insights into the molecular mechanisms of Bacillus species in terms of heat resistance mechanisms.
쌀밥의 미생물 안전성을 평가하기 위하여 쌀을 취반한 후 세균을 분석하였다. 전국에서 생산되는 생쌀 30개를 수집하여 취반 후에 중온성 호기성균과 MYP선택배지에서 Bacillus cereus group를 분리 동정하여 그의 분포도와 독소유전자를 분석하였다. 취반 직후의 쌀밥 27%에서 1-3 log CFU/g정도의 총 중온성 호기균과 거의 같은 정도로의 Bacillus spp.가 존재하는 것으로 나타났다. 그러나 균이 검출되지 않은 시료들도 증균한 후에는 B. cereus group균들이 검출되어 사실상 대부분의 시료에서 Bacillus spp.가 분포하고 있는 것을 알 수 있었다. 이들 시료로부터 37개의 분리하여 동정한 균주는 B. thuringiensis, B. cereus, B. valismortis, B. pumilus, B. coagulans, B. licheniformis, Geobacillus stearo-thermophilus, Brevibacillus laterosporus 등으로 나타났다. 분리 균주중 20개(54%)의 분리주가 B. thuringiensis로 나타났고 그 다음으로 9개(27%)의 B. cereus이였다. 그리고 3개(8%)의 B. valismortis와 각각 1개(3%)의 B. pumilus, B. coagulans, B. licheniformis, Geobacillus stearothermophilus, Brevibacillus laterosporus이였다. B. thuringiensis는 모두에서 non-hemolytic toxin gene(nhe)을 가지고 있었고 9개의 B. cereus중 7균주가 emetic toxin 유전자를 함유하고 있었다. 따라서 쌀밥에는 B. thuringiensis가 B. cereus보다 더 높은 빈도로 분포되어 있고 B. cereus는 설사형 독소유전자 보다는 구토형 독소를 더 많이 가지고 있었다. 취반 후 쌀밥을 상온에서 보관하여 발생되는 B. cereus 식중독은 설사형보다 구토형일 가능성이 더 많을 것으로 보인다.
Bacillus anthracis, B. cereus, B. thuringiensis 를 분류하기 위해 rpoB 유전자 배열을 이용한 컴퓨터 분석 작업을 수행하였다. 17개의 B. anthracis, 9개의 B. cereus, 7개의 B. thuringiensis 를 database에서 구하였다. B. anthracis 는 rpoB 유전자의 in silico 제한효소 절단에 의해, B. cereus, B. thuringiensis 2 group과 구별되었다. 그러나 B. cereus와 B. thuringiensis 는 제한효소 절단에 의해 구분되지는 않고, 염기배열과 Blast 탐색의 도움으로 구분이 가능하였다. 본 연구를 통해 3 종류의 Bacillus 종을 동정할 수 있는 알고리즘이 개발되었다.
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[게시일 2004년 10월 1일]
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