유전자에 대한 정보를 획득하는 기술적인 문제가 해결되면서, 질병 진단을 위한 새로운 접근 방법으로 혈액 속에 있는 모든 단백질(proteome)의 구성을 분석하는 프로테오믹스(proteomics)에 대한 연구가 최근 들어 활발하게 진행되고 있다. 본 논문은 암 진단을 위하여 혈액 중의 단백질의 구성을 측정한 2차원 전기영동 (2D electrophoresis) 젤 데이터를 해석하는 새로운 방법을 제시하였다. 우선 측정된 많은 단백질 스팟(spot) 중에서 T-statistics 방법으로 단백질 스팟들을 선택하였다. 선택된 단백질 스팟들로 이루어진 암 환자와 정상인 두 샘플들의 확률 분포를 각 집단에 따로 적용된 PCA 영역에서 계산하였다. 최종적으로 조건부 확률의 차이에 근거한 베이즈 분류(Bayes classification) 이론을 적용하여 암 진단을 하였다.
단백질 2차원 전기영동은 다양한 단백질 분리 방법 중 가장 널리 쓰이는 방법으로 실험 결과를 촬영한 영상을 분석하여 얻은 단백질 스팟의 위치나 질량, 발현 유무 등을 이용하여 각종 질병의 발생 원인 진행 상태, 생리적인 변화 등에 대해 분석할 수 있다. 실험 영상에 다수의 단백질이 존재하므로 이를 수작업으로 처리할 경우에 많은 시간과 노력이 소요되므로 본 논문에서는 자동화된 단백질 스팟 검출 방법을 제안하였으며 단백질 스팟이 같은 위치에 겹쳐서 나타나는 경우가 많은 단백질 2차원 전기영동 실험 영상의 특성을 고려하여 여러 개의 단백질이 겹쳐진 복잡한 스팟 영역에 대해서 스팟의 형태 정보를 이용하여 스팟의 개수를 추정하고 개별 스팟으로 분리하여 보다 신뢰성 있는 분석이 가능하게 하였다 본 논문에서 제안된 방법의 효용성을 검증하기 위해 기존에 널리 사용되고 있는 상용 소프트웨어와 비교 실험을 수행한 결과 겹친 정도가 60%이상인 경우 기존 방법에 비해 우수한 결과를 보였다.
단백질 연구에 획기적인 기여를 한 2차원 전기영동법에 의한 결과영상을 처리하기 위하여 일반적으로 제안되었던 기존의 영상처리기법들이 가지는 문제점 중 하나인 단백질을 나타내는 여러 개의 스팟들이 겹치고 포화되고 있는 복잡영역에서 단백질 스팟을 하나로 인식하거나 검출이 불가능하여 오류를 범하게 되는 문제점에 대한 해법을 제안한다. 복잡영역내의 각 각점의 누적 기울기를 산출하고 누적 기울기 영상을 워터쉐드 기법으로 영역 분할하여 스팟을 분리한다. 그 결과 스팟 분리에 있어서 기존의 기법들을 적용하였을 때 보다 더 우수하고 효율적인 결과를 나타내며, 2차원 전기영동 결과영상에 숨겨져 있었던 단백질 스팟을 더 많이 검출할 수 있고, 예측의 범위 또한 확장시킨다.
황해서식 두족류 (class Cephalopoda)의 가용성 단백질에 대한 연구를 위해, 인천 및 목포 연근해에서 채집된 두족류 3목 5종의 (오징어목 : 참갑오징어 (Sepia esculenta) 및 쇠갑오징어 (Sepiella japonica), 살오징어목 : 한치꼴뚜기 (Loligo chinensis) 및 참꼴뚜기 (Loligo beka), 문어목 : 낙지 (Octopus minor)의 안구단백질, 근육단백질 및 간조직을 추출하여, 각종 전기영동 (Davis-PAGE 및 SDS-PAGE, Exponential gradient SDS-PAGE, 등전점 전기영동, 2차원 전기영동) 방법에 의한 단백질 분리 양상을 통해 두족류 종사이의 유전적 근연관계를 분석하였다. 시료의 안구 및 근육 단백질에 대한 exponential gradient SDS-PAGE 전기영동 결과 대략 분자량 35-50 KDa 사이에서 단백질 분리 양상의 차이를 볼 수 있었으며, 등전점 전기영동 방법(IEF)에 의해서는 pI값 7.5-8.5 사이에서 종간 특이성을 갖는 단백질 분리 양상을 볼 수 있었다. 특히 유의성이 있다고 판단된 시료의 안구 단백질을 2차원 전기영동 방법에 의해 분리 해 본 결과 대부분 분자량 30-50 KDa 사이에 분포하고 있어 exponential gradient SDS-PAGE 전기 영동에 의한 결과와 일치함을 알 수 있었다.
서로 비슷한 어종으로 약간의 저차 가공시에도 육안적 규별이 어려운 12개 어종의 등전점 전기영동 결과는 다음과 같다. 3종의 갑각류에서 대하와 중하는 밀새우와 다른 단백질 pattern이 pH 4.5 이하에서와 pH 5~7.5에서 서로 구별이 가능하였으며, pH 범위를 변경했을때, 중하와 대하 사이의 구별은 pH 5 부근에 있는 단백질띠로 나타났지만 크기나 형태적으로 거의 같은 대하의 치어에 대한 조사가 필요한 것으로 생각되었다. 민어속 어류에서도 참조기와 항강달이는 비슷한 등전점을 가지는 단백질의 분포가 pH 5~8 사이로 나타났다. 이 분포대에서 돌가자미와 도다리에서도 비슷한 현상을 보였으며, pH 6~7, pH 8~9 범위에서 박대와 도다리는 서로 다른 단백질 분포를 보였고, 참가자미와 돌가자미는 pH 4.5, pH 6.0과 pH 8.0이하에서 뚜렷이 다른 분포를 보였다. pH범위를 변경하여도 단백질 pattern의 구별이 어려운 참조기와 황강달이에서의 2차원 전기영동은 pH 5.0rhk pH 6.0부근에 있는 단백질들에서 추정분자량 11,700과 87,000으로서 등전점 전기영동시 pH 범위 변경 및 2차원 전개 전기영동을 병용할 경우 서해산 어종(중하, 대하, 밀새우, 참조기, 수조기, 황강달이, 참가자미, 도다리, 박대, 돌가자미, 병어, 아홉등가리)의 판별에 구성 단백질의 등전점 전기영동이 신속하고 효과적임을 알 수 있었다.
다수확계(통일벼) 및 일반계 각각 3가지 품종의 각 출수후 6시기의 쌀종자에서 2% sodium dodecyl sulfate/5% ${\beta}-mercaptoethanol$로 단백질을 추출하여 1차원에서 등전점에 따라 분리한 후 2차원에서 분자량에 따라 분리하는 2차원 전기영동으로 각각의 단백질 지도를 작성하였다. 종합단백질 지도를 작성하였고 pH $5.2{\sim}8.3$, 분자량 $20,000{\sim}100,000$의 범위에서 300개 이상의 spots이 관찰되었다. 품종 및 출수시기에 따라 단백질 지도가 많은 차이를 보였다.
벼(Oryza sativa L.) 캘러스는 2.0 mg/L 2,4-D와 0.5 mg/L kinetin이 첨가된 MS 배지에서 성숙종자로부터 유도되었으며 embryogenic callus(EC)와 nonembryogenic callus(NEC)는 색깔과 외부형태에 의해 경시적으로 선별되었다. EC와 NEC의 전체 단백질로부터 SDS-PAGE와 등전점 전기영동에 의한 전기영동적 분석은 EC와 NEC의 각각에 대해 특이적, 양적인 차이를 보여주었다. 또한 EC와 NEC의 2차원 전기영동 분석은 약 20여개 이상의 EC 특이단백질과 10여개의 NEC 특이 단백질 양상을 보여주었으며, 아울러 EC 특이적인 90, 65, 50 kD의 단백질은 microheterogeneity를 보여주는 반면, NEC에서는 분자량의 변이가 큰 일련의 산성 이질단백질군을 보여주었다.
두 개의 이차원 단백질 전기영동 영상에서 한쪽 영상의 각 반점이 다른 영상의 어느 반점과 일치하는 지 알아내는 일은 단백질의 생성과 소멸, 변이 등을 알 수 있게 하는 중요한 일이다. 단백질 반점은 주로 2차원 전기영동에 의해 분리된다. 이 과정은 조직의 상태, 실험 조건 등에 따라 같은 단백질이라도 그 위치가 조금씩 다르게 된다. 각 반점을 정합하여 보면 균일하지 않은 비선형 변환 관계를 이룬다. 그러나 국지적으로 보면 반점 사이의 토폴로지가 유지되는 것을 볼 수 있다. 본 연구는 이러한 토폴로지의 유지에 착안하여 반점끼리 정합하는 방법을 제안한다. 토폴로지의 유사성을 비교하기 위하여 이웃한 반점과의 거리와 각도를 비교하였다. 실험을 통하여 제안한 방법이 우수함을 보였다.
유채(Brassica napus L. cv. Topas) 소포자 배양에 의한 기내 배발생 과정을 관찰하고 발생과정에 따른 총단백질의 변화 양상을 이차원 전기영동을 통하여 분석하였다. 배양에 적합한 소포자의 발달 단계는 4,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) 형광염색으로 핵상관찰을 통하여 결정하였다. 최초의 소포자 생존율은 63.9%였으며 이러한 생존율의 차이로 배양초기에 소포자의 이형성이 나타났다. 배 발달 경로에 따른 최초의 세포분열은 화분벽 안에서 균등분열로 시작되어 배병의 발달이 선행된 후 배 발생이 일어났으며, 구형, 심장형, 어뢰형으로의 배 발달은 여러 조직의 분화와 더불어 빠르게 진행되었다. 소포자배 발달과정을 치상단계의 소포자, 배양 3일째의 초기 분열세포, 구형 및 심장형배, 어뢰형배, 성숙한 자엽단계의 배 등의 5단계로 나누어 각각 2차원 전기영동을 수행한 결과, 최초 소포자 단계에서 나타났던 23개의 단백질들은 배 달달 경로로 진행됨에 따라 사라지고, 배양 3일째에는 8개의 단백질이 특이적 또는 지속적으로 발현되었다. 배의 발달과 더불어 20∼50 kD 사이에서 총 42개의 단백질이 급격히 나타나거나 또는 후기 배로 진행하면서 점차적으로 발현되었다.
한국산 멧누에(Bomdyx mandarina)chorion 유전자의 형질 발현기구를 규명하기 위한 연구의 일환으로 본 실험을 실시했다. 멧누에의 난각구조를 주사형 전자현마경에 의해 관찰한 결과 매우 특이적인 구조가 인정되었다. 즉 원추상의 불규칙 돌기에 의한 돌기구조층과 이 돌기 구조층을 덮고 있는 한 층의 얇은 덮개 구조층이 그것이다. 2차원 전기영동법에 의해 chorion 단백질을 분석한 결과, 난각을 구성하는 주요 단백질 성분은 등전점 4~6, 분자량 6~30 kd로 밝혀졌다. 특히 특이난각구조와 관련된 특이단백질 성분을 검출하였으며 이들의 대부분은 고cysteine 단백질인 것으로 추정했다. 이상의 연구결과에 의해 멧누에 난각의 특이 구조 형성에 따른 유전자발현기구 규명을 위한 기초자료가 얻어졌다.
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[게시일 2004년 10월 1일]
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