분리 당화발효(Separate Hydrolysis and Fermentation, SHF)는 당화와 발효공정을 따로 수행하는 방법으로 최종 생성물인 글루코오스에 의해 억제 영향을 받기 때문에 반응에 진행됨에 따라 축적된 글루코오스의 농도가 높아지면 반응이 종결되는 단점이 있다. 이를 극복하기 위해 효소의 양을 늘리는 방법이 있지만, 효소의 생산비용이 비싸기 때문에 경제적인 방법이 될 수 없다. 이러한 분리 당화발효 공정의 단점을 극복하기 위해서 동시당화발효 공정(Simultaneous Saccharification and Fermentation, SSF)은 하나의 반응기에서 당화와 발효를 동시에 수행한다. 동시당화발효 공정에서는 당화과정에서 글루코오스가 생성되자마자 효모가 발효과정을 통해 글루코오스를 바로 제거하기 때문에 반응기내에서 당의 축적을 최소화할 수 있다. 따라서 동시당화발효 공정은 최종 생성물의 억제 작용을 방지할 수 있고, 효소의 가수분해 반응을 향상시킬 수 있다. 본 연구에서는 동시당화발효에서 에탄올의 수율에 관여하는 조건들(pH, 반응온도, 효소 투입량, 반응시간)의 최적 조건을 찾는 연구를 수행하였다. 기질로는 감자전분을 사용하였고, 효소는 glucoamylase, 균주는 Saccharomyces cerevisiae가 각각 사용되었다. 동시당화발효의 최적의 조건은 pH 4, 온도 38로 나타났다. 최적의 조건으로 감자전분을 동시당화발효하였을 때 반응 18시간 후에 에탄올은 최대 수율 86%에 도달하였다.
Cellulomonas flavigena KIST 321이 생산하는 균체외 cellulose 분해효소를 gel filtration법과 ion-exchange chromatography법으로 3종의 다른 효소를 분리하여 이들을 A, B, 및 C 효소로 명명하였다. 분리된 각 효소를 결정적 기질에 처리하여 일어나는 기질의 구조변화를 적회전 분광법과 X-ray crystallography법으로 측정하여 다음 결론을 얻었다. B효소는 결정성 cellulosem이 구성단위인 glucopyranose의 불안정화로 그 결정도를 감소시키는 $C_1$형의 효소이며 A 및 C 효소는 $C_x$형의 효소로 B 효소의 반응생성물에 작용하여 glucose를 생산하였다. 이들 각 효소의 작용에서 본균의 cellulase의 작용기작을 고찰하였다.
알긴산 올리고당은 생체에 다양한 생리활성효과를 나타내는 기능성 식품의 소재나 고부가가치 재료로서 활용 가능성이 높아 여러 응용 범위 내에서 사용될 수 있다. 알긴산은 해조류의 주요 구성성분으로 주로 갈조류에 많이 존재한다. 해조류로부터 다양하게 활용이 가능한 알긴산 올리고당을 제조하기 위해 Erwinia tasmaniensis 균주가 생성하는 효소를 이용하여 알긴산을 효소적으로 분해하고자 하였다. 따라서 본 연구에서는 E. tasmaniensis의 최적 배양조건과 균주가 생성해내는 알긴산 분해 효소의 성질 및 특성을 알아보았다. 실험 결과, 이 균주의 최적 배양을 위한 배지 내 알긴산의 최적 농도는 1.0%, 최적 시간은 36 h이었으며, 알긴산 분해 효소의 활성은 알긴산이 1.0% 포함된 배지에서 72 h동안 배양했을 때 가장 높았다. 이 효소의 최적 pH는 6.0, 최적 온도는 $20^{\circ}C$로 확인되었다. 또한 효소의 활성은 $20^{\circ}C$에서 60 min까지 지속됨을 확인했다.
연산오계는 오래전부터 건강기능 증진 및 치료 효능이 높은 것으로 알려져 왔다. 최근 건강기능식품 소재로 기능성 펩타이드 효능이 알려짐에 따라, 연산오계 다리육으로부 올리고 펩타이드 최적 생산 공정 및 생성물 특성에 대하여 연구를 수행하였다. 최적 효소가수 분해 공정 표면반응 분석을 이용하여 수행하였다. 최적 공정 조건을 확립하기 위해서 온도 (40, 50, $60^{\circ}C$), pH (pH 6.0, 7.0, 8.0), 효소 (1, 2, 3%) 범위에서 수행을 하였다. 생성물에 대한 가수분해도, 유리아미노산, 분자량 분포를 분석하였다. 효소 가수분해 최적 온도는 $58^{\circ}C$, pH 7.5, 효소의 농도는 3% 이었다. 최적 조건에서 2 시간 효소 가수분해를 한 결과 75-80% 이었다. 유리 아미노산 총량은 168.131 mg/100 g 이었다. 분자량를 MALDI-TOF 으로 분석을 한 결과 90% 이상이 300-1,000 Da 분포를 보여주었다.
p-Aminopheny1-$\beta$-D-thiogalactopyranoside agarose 친화성 크로마토그라피를 이용하여 Neisseria lactamica 2118이 생성하는 $\beta$-galactosidase를 정제한 후 몇가지 효소학적 성질을 조사 하였다. Neisseria lactamica 2118이 생성하는 $\beta$-galactosidase는 구성효소로서 lactose와 IPTG에 의하여 유도되지 않았다. 정제효소의 작용최적온도는 $35^{\circ}C$, pH는 7.5이었고 $50^{\circ}C$로 15~60분 처리시 약 80%의 활성이 유지되었으며 pH 6.0~9.0에서 안정 하였다. 또한 $Hg^(2+)$와 $Co^(2+)$에 의하여 그 활성이 저해 되었다.
활성 산소종은 노화, 특히 피부노화의 원인 물질로 작용하고 있다. 피부는 자외선에 노출되어 있어 활성 산소종을 만드는 광화학적 반응들이 계속해서 일어나고 있다. 이들 활성 산소종들은 피부 세포 및 조직 손상을 주도한다. 이들은 항산화 효소와 비효소적 항산화제들로 구성된 항산화 방어망을 파괴함으로써 산화제/항산화제 균형을 산화 상태 쪽으로 기울게 한다. 결과적으로 계속된 산화적 스트레스는 지질 과산화, 단백질 산화, 간질 성분을 파괴시키는 단백질분해효소의 활성화, 탄력 섬유인 콜라겐과 엘라스틴의 사슬절단 및 비정상적인 교차결합, 히아루론산 사슬의 절단, 멜라닌 생성반웅 촉진, DNA 산화와 같은 생체 구성 성분들의 손상을 야기시킨다. 결국에는 탄력감수 주름살 및 기미.주근깨 둥으로 특징 지워지는 피부노화가 가속화된다. 따라서 피부노화 방지를 위해서는, 과잉의 활성 산소종 생성을 억제하고 또한 생성된 활성산소를 효율적으로 제거할 수 있는 시스템이 화장품의 처방에 반드시 포함될 필요가 있다. 즉, 산화제/항산화제 밸런스가 유지되는 피부의 항산화 방어 시스템 구축이 필요하다. 피부노화 방지에 있어서 천연물의 역할로 (1) 자외선 흡수제로서의 역할, (2) 항산화제로서의 역할, (3) 주름 개선제로서의 역할, (4) 미백제로서의 역할, (5) 항균\ulcorner항염작용 및면역 조절제로서의 역할에 대하여 살펴 보았다. 21세기는 본격적으로 기능성 화장품 시대가 개막될 것으로 예측하고 있다. 이에 맞춰 천연물들은 피부노화를 방지하는데 주도적인 역할을 할 것으로 기대된다.
대두단백 가수분해 산물의 맛과 향을 개선하기 위해 효소에 의한 가수분해 system을 확립하기 위하여 단백질 가수분해 패턴이 서로 다른 효소로 생산된 단백 분해산물의 가수분해도와 표면 소수도 등을 측정하였다. 이들 분해물의 pattern을 SDS 전기영동으로 조사하였고, 효소반응에 의한 단백질분해물의 관능검사를 실시하였다. 각 균주가 생산한 단백질 분해효소의 pH 변화에 따른 효소의 활성은 No. 16 효소(Bacillu megarerium Bl6)와 No. 4효소(Aspergillus oryzae M4)는 pH 7.0에서 No. 95효소(Bacillu subtilis YG 95)와 No. 5효소(Mucor circinelloides M5)는 8.0에서 가장 높은 효소반응 활성을 보였다. 또한 반응온도에 따른 효소활성의 크기는 4가지 효소 모두 45$^{\circ}C$에서 가장 높은 활성을 나타내었다. 대두단백질 분해물의 SDS 전기영동 pattern변화에서, Bacillus megaterium Bl6과 Mucor circinelloides M5의 효소 (No. 16, No. 5)는 반응 후 분자량이 비교적 큰 peptide가 많이 생성되었으며, 효소반응 3시간 경과 후에도 분자량 66KD의 peptide를 확인할 수 있었다. 반면에 Bacillus subtilis YG 95와 Aspergillus oryzae M4의 효소(No. 95, No. 4)는 분자량 15KD∼45KD 미만의 작은 분자량의 peptide 물질이 주로 생성되었으며, 반응 2시간 경과후에는 30KD 미만의 저분자 Peptide가 주로 생성되었다. 이와 같은 결과는 HPLC 분석 결과와 일치하였다. 가수분해가 진행됨에 따라서 SDS 표면소수도가 크게 저하되었으며, Aspergillus oryzae M4 효소의 분해물의 가수분해도가 가장 높았다. 관능검사 결과, No. 4(Aspergillus oryzae M4)와 No. 95(Bacillus subtilis YG 95) 가 강한 쓴맛을 나타내었다. 각각의 효소들을 조합해서 분해한 단백분해물을 관능검사한 결과, Aspergillus oryzae M4 효소와 조합된 것의 대두단백질 분해물이 비교적 강한 쓴맛을 나타내었다. 분해물의 단맛은 시료별로 큰 차이가 나타나지 않았으나 Bacillu megarerium Bl6과 Aspergillus oryzae M4를 조합하였을 때 상대적으로 단맛의 정도가 높게 나타났다. 따라서 이와 같은 효소특성을 이용하여 대두단백질을 가수분해를 하였을 때 다양한 단백질 분해물의 제조에 이용이 가능할 것으로 사료된다.
본 연구는 청보리와 트리티케일에 L. plantarum, L. plantarum과 L. buchneri가 혼합된 접종원을 각각 첨가한 사일리지에 섬유소 분해효소를 첨가하여 사일리지 품질, 반추위 발효 패턴 및 소화율을 조사하였다. 두 초종의 사일리지 건물함량과 조단백질 함량은 전반적으로 청보리 사일리지가 높게 조사 되었으며(p<0.01), 트리티케일 사일리지 처리구에서는 섬유소 분해효소의 첨가가 유의적으로 낮은 NDF 함량을 나타내었다(p<0.01). 청보리와 트리티케일 사일리지에서 유기산 (젖산 및 초산)의 함량은 대조구에 비해 타 처리구들이 유의적으로 높았으며(p<0.01), L. plantarum을 접종균주로 사용한 처리구에서 유의적으로 높은 젖산 함량을 나타내었다(p<0.01). 사일리지 내 lactic acid bacteria는 두 초종 모두 섬유소 분해효소를 첨가한 처리구에서 높게 나타났으며, mold 생성량은 무첨가 대조구에 비해 처리구에서 낮게 조사되었다. 반추위 발효 패턴 및 소화율의 결과에서, 반추위 내 암모니아태 질소생성량은 청보리 사일리지에 L. plantarum과 L. buchneri를 혼합하여 접종한 처리구가 유의적으로 가장 높은 생성량을 나타냈다(p<0.01). 총 가스 생성량은 처리구별 유의적 차이는 없었으나, 효소첨가에 의해 증가하였다(p=0.003). 반추위 내 건물소화율은 청보리 사일리지 처리구에서 유의적으로 높게 조사되었으며(p<0.01), 트리티케일 사일리지는 혼합균주 L. plantarum과 L. buchneri에 섬유소 분해효소의 첨가한 처리구가 타 처리구 대비 유의적으로 높은 소화율을 보였다(p<0.01). 반추위 내 초산 생성량은 L. plantarum과 L. buchneri 를 접종한 처리구와 섬유소 분해효소를 첨가한 트리티케일 처리구에서 유의적으로 높게 조사되었다(p<0.01). 또한 총 휘발성 지방산은 청보리 사일리지 처리구의 균주 및 효소를 혼합 첨가한 처리구가 유의적으로 높았다(p<0.01). 본 연구를 통해 homofermentative LAB 보다 heterofermentative LAB가 안정적인 사일리지 발효에 기여하는 것을 확인 할 수 있었다. 그러나 반추동물의 사료효율 증대를 위한 대안으로 사용된 섬유소 분해효소를 이용한 효과는 초종에 따라 다양한 결과를 가지며, 효소의 적용에 대한 연구 및 균주와 효소의 상관관계에 관한 추가적인 연구가 필요할 것으로 사료된다.
비교적 연구가 미비한 Fe-SOD의 효소화학적 특성 및 그 생리적 기능을 검토하기 위해 여러 종의 세균을 대상으로하여 Fe-SOD의 고생산균주를 screening하였다. 그 결과 Fe-SOD를 대량 세포내에 생성하는 Pseudomonas polycolor를 선발하여, 이 균주의 효소생산 최적 배양조건을 설정하였다. 본 균주가 생산하는 효소는 특이적인 저해제의 작용양식에 의해 Fe을 cofactor로 요구하는 Fe-SOD임이 밝혀졌다. SOD 생성을 위한 최적배지조성은 glycerin 3%, polypeptone 1%, meat extract 0.5%, KCI 0.2%이었고, 최적 초발 pH는 9.0이었으며, 이 조건에서 500ml용 shaking flask에 배지 100ml를 넣어 15시간 전 후 배양했을 경우가 효소생산량은 최대가 되었다.
대두 단백질을 효소로 가수분해 하였을 때 생성되는 peptide의 항균활성을 조사하고 천연항균제로서 이용 가능성을 검토하기 위하여 분리 대두 단백질에 5종의 단백질 가수분해 효소를 작용시켜 생성된 가수분해물의 항균력을 측정하고 한외여과하여 분자량별로 분리된 각 fraction의 항균활성과 HPLC로 정제하여 항균성 peptide 의 아미노산 결합순서를 분석하여 다음과 같은 결론을 얻었다. 분리대두 단백질에 5종의 단백질 분해효소를 작용시켜 제조한 가수분해물 중 Asp.saitoi protease로 작용시킨 것이 항균활성이 높았다. Asp. saitoi protease로 작용시킨 대두 단백질의 가수분해물을 membrane filter로 여과한 결과 분자량 1000-3000 fraction에서 항균활성이 가장 높았다. 분자량 1000-3000 범위을 가진 가수분해물의 MIC는 0.5-0.8mg/$m\ell$ 이었으며 그람 양성균과 음성균 모두의 증식을 억제하는 경향을 보였다. 분리 대두 단백으로부터 얻어진 항균성 peptide는 121$^{\circ}C$, 10분간 열처리하여도 안정하였으며 한외여과에 의하여 분자량 1000-3000범위의 가수분해물을 동결건조하여 gel filteration하였을 때 2개의 fraction에서 항균 활성을 나타내었다. HPLC결과 RT 16.02 의 peak에서 항균활성이 확인되었고 질량은 1,633이었으며 아미노산 결합순서는 H$_2$N-G-P-P-G-V-V-A-T-V-V-A-A-R-COOH 이었다.
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[게시일 2004년 10월 1일]
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