장기간 경유로 오염된 지역의 토양으로부터 분리한 세균 3Y는 석유계 탄화수소를 구성하는 다양한 화합물을 유일 탄소원으로하여 성장하였다. Sphingomonas sp. 3Y는 지방족 화합물은 물론이고 방향족 화합물을 이용해서 성장할 수 있었다. 지방족 화합물로서는 hexane과 hexadecane을 이용하여 성장하였고, 한편 방향족 화합물로서는 BTEX는 물론이고 phenol, biphenyl, 또는 phenanthrene을 유일 탄소원으로 이용하여 성장하였다. 본 균주는 indole과 catechol을 이용한 실험결과 방향족 탄화수소의 생분해 과정에서 맨 첫 단계 반응에 관여하는 효소인 aromatic ring dioxygenase 활성과 benzene 환을 깨는 효소인 meta-cleavage dioxygenase 활성을 나타내었다. Sphingomonas sp. 3Y의 16S rRNA 유전자의 염기서열 분석과 계통수 작성 결과 본 균주는 ${\alpha}$-Proteobacteria인 Sphingomonas속에 해당하였으며 지금까지 잘 알려진 석유계 탄화수소를 분해하는 Sphingomonas sp. 균주들과는 다른 cluster를 형성하였다. 다양한 석유계 탄화수소 성분을 이용하여 성장하는 Sphingomonas sp. 3Y는 유류로 오염된 토양의 복원에 유용하게 사용될 것으로 여겨지며 이 균주의 최적 분해 조건을 조사한다면 그 결과는 이 균주가 분리된 오염지역의 생물학적 분해를 최적화하는데 기여할 것이다.
Erm 단백질은 23S rRNA의 특정 아데닌 잔기 $N_6$ 위치에 methylation을 일으켜 임상적으로 중요하게 사용되는 macrolide-lincosamide-streptogramin B계 항생제에 내성을 유발시킨다. 최근 ErmC'에서 N-말단 catalytic domain과 C-말단 substrate binding domain를 연결하는 오목한 홈 형성부위에 존재하는 잘 보존된 아미노산 잔기가 기질과 상호작용하는 것으로 제안되었다. 우리는 ErmSF에서 두 domain의 연결 부위의 오목한 홈에 위치하여 기질과의 상호작용이 예상되며 또한 Erm 단백질들 사이에서 매우 높게 보존되어있는 237번 아르지닌 잔기를 치환하여 그 기능을 in vivo, in vitro상에서 검색하여 분석하였다. R237A 변이 단백질을 발현하는 세균은 야생형 단백질을 발현하는 세균과 비교하여 in vivo 상에서는 차이를 나타내지 않았으나 순수분리 한 후 in vitro에서의 효소 활성은 야생형에 비하여 51%만을 나타내어 그 잔기가 기질 부착 기능을 수행하고 있다고 제안할 수 있었다.
쌀의 저장 중 미생물학적 요인에 의한 품질 저하를 억제하기 위해 미곡창고 내의 환경과 창고 내에 보관되어 있는 나락에서 곰팡이, 세균 및 효모를 분리 동정한 후 주요 오염균에 대한 상백피, 감초, 꽈배기 모자반 및 감태의 항균효과를 조사하였다. 미곡창고 내의 환경과 나락에서 분리된 주된 오염균은 Sphingomonas paucimobilis와 Bacillus cereus를 비롯한 여러 Bacillus 속 세균과 불완전균류, Aspergillus spp., Penicillium spp.의 곰팡이 그리고 Candida spp.의 효모인 것으로 나타났다 분리된 균주에 대한 천연추출물의 항균력을 측정한 결과 상백피, 감초, 꽈배기 모자반 및 감태 모두 미곡창고 오염균주에 대해 항균력이 있는 것으로 나타났으며, 꽈배기 모자반, 상백피, 감초는 항진균 활성도 있는 것으로 밝혀졌다. 특히 상백피의 항균력이 뛰어난 것으로 나타났는데, $0.0025{\sim}0.0075%$농도에서 주요 오염균의 생육을 억제하였으며, 내 열성 포자를 형성하는 Bacillus cereus의 생육을 0.0025% 농도에서 억제하였다. 이상의 결과를 볼 때 이들 천연추출물을 미곡창고 내에 처리하거나 나락에 직접 처리할 경우 쌀의 저장 중 미생물학적 안전성을 확보할 수 있을 것으로 생각된다.
강원도 고령지 밭작물 재배지역에서는 2-4년 주기로 대량의 모재성토를 시용하고 있으나 모재성토의 질과 이들이 토양환경과 수질에 미치는 악영향에 관한 연구는 매우 부족한 상황이다. 따라서 모재성토의 물리 화학적질 및 생물학적 질을 평가하고. 모재성토의 시용현황을 조사하고 이들이 토양환경에 미치는 영향을 알아보고자 본 연구를 수행하였다 모재성토 자체의 화학성은 매우 낮았으며, 특히 유효인산과 유기물 함량은 작물이 생육하기에 매우 부족한 값을 나타냈다. 토양의 생물학적 질 지표의 하나인 토양효소 활성 값에 있어서도 모재성토는 매우 낮은 값을 보였는데, phosphatase 활성의 경우 우리나라 밭토양 평균치의 1/3 정도의 값을 나타냈다. 자운리 지역의 토양 미생물 조사 결과 세균 사상균, 방선균의 개체수는 모재성토의 경우 밭토양에 비해 각각세균은 6-10배. 사상균은 3-4배, 방선균은 11-13배 정도 적은 미생물상을 나타냈다. 홍천군 자운리 지역의 영농활동 및 토양조사를 실시한 결과, 이 지역의 43%에 해당하는 농경지에 모재성토가 행해졌으며, 토양침식한계허용치인 $11.2MT\;ha^{-1}\;yr^{-1}$을 초과하는 농경지는 40%에 달하는 것으로 조사되었다. 침사지를 설치하여 침사지의 토양 유실 방지 효과 및 토양 유실량을 측정한 결과 모재성토를 시용한 농경지에 설치한 침사지에서의 토양유실은 모재성토를 시용하지 않은 농경지에 비해 6배 이상의 토양유실이 발생한 것으로 나타났다. 침사지 유역에서의 토양 유실발생량을 조사한 바에 의하면 동일한 밭일지라도 경사도, 경운방법, 토성 및 강우강도 등의 영향인자에 따라 변화가 매우 큰 것으로 나타났다.
폐수처리에 중요한 역할을 담당하고 있는 세균 군집의 다양성과 폐수종류에 따른 군집차이를 알아보기 위해 분자생물학적 분석방법을 사용하였다. 국내 폐수처리장 슬러지 시료로부터 16S rDNA 클론 라이브러리를 구축하였고, HaeIII RFLP pattern과 염기서열을 분석하였다. 하수처리장 시료에서는 총 1,151개의 클론에서 699개의 서로 다른 RFLP pattern이, 화학산업 폐수처리장 시료에서는 총 1,228개의 클론에서 300개의 서로 다른 RFLP pattern이 관찰되었다. Shannon-Weiner diversity index의 계산결과 하수처리장 슬러지 시료는 8.7,화학산업 폐수처리장 슬러지 시료는 6.1로 하수처리장시료가 더 다양한 군집을 구성하고 있었다. 두 시료에서 우점하는 RFLP pattern에 해당되는 40개의 클론을 선정하여 염기서열 분석과 상동성 검색을 수행하였다. 분석된 서열의 $70\%$인 28개의 클론은 배양이 보고되지 않은 균주의 16S rRNA와 유사도가 높았고, 두 시료 모두 ${\beta}-Proteobacteria$가 우점하였다. 그러나, 하수처리장의 경우 활성슬러지에서 분리된 균주들과 유사한 군집이 많았던 반면, 화학산업 페수처리장의 경우 고온이며, 혐기성이고,탄화수소나 황이 많이 존재하는 환경에서 분리된 균주들과 유사한 군집이 많았다. 이러한 결과는 유입수의 조성에 따른 차이로 생각된다.
본 연구에서는 유기농자재인 키토산, 목초액 및 EM 활성액 등을 공시재료로, 배추 정식 전에 100배액 토양관주 처리하고, 배추 정식 후 15일 간격으로 엽면살포 농도를 100배액과 1,000배액으로 3회 엽면살포한 후 배추의 생육 및 토양 미생물상의 변화에 대해 분석하였다. 유기농자재 처리에 따른 배추의 생육특성은 대조구에 비해 유기농자재 처리구에서 생육이 양호하게 나타났으며, 유기농자재 간에는 키토산 처리구에서 양호하였고, 특히 키토산 1,000배액 처리구에서 생육이 양호하였으며, 주중이 5.60 kg으로 가장 무거웠다. 유기농자재 처리에 따른 토양 미생물상 변화는 대조구에 비해 유기농자재 처리구에서 세균, 트리코데마 및 방선균수은 증가한 경향을 보였고, 사상균수는 약간 감소한 경향을 보였으나 처리간 일정한 경향은 없었다. 유기농처리구 간에는 키토산 1,000 배액 처리구에서 세균, 트리코데마 및 방선균수가 가장 많이 증가하였다.
본 연구는 항진균 및 항세균 활성이 있는 김치 유래 유산균인 $Lb.$$plantarum$ AF1을 가지고 천연항균제로서 사용 적합성 및 안정성을 평가하고자 $Lb.$$plantarum$ AF1을 SD 계통의 흰쥐에게 4주간 반복 경구투여를 통하여 장기투여에 의한 안전성을 확인하고자 식품의약품안전청의 의약품 등의 독성시험기준에 따라 실시하였다. SD 계열의 암수 흰쥐에 시험물질을 0, 500, 1,000 및 2,000 mg/kg/day의 용량으로 4주간 반복 경구투여한 후 사망률, 일반증상, 체중변화, 사료 섭취량, 수분섭취량, 혈액학적 및 혈액생화학적 변화, 부검 소견 및 장기무게의 변화를 관찰하였다. 모든 시험군에서 시험기간 시험물질로 인한 일반증상 및 사망동뮬이 관찰되지 않았다. 전 시험기간 동안 $Lb.$$plantarum$ AF1의 4주간의 경구투여 결과 체중이 지속적으로 증가되었지만 대조군과 유의성 있는 변화가 관찰되지 않았다. 또한 혈액학적, 혈액생화학적 검사, 장기의 육안적 관찰, 장기 중량변화 및 조직 병리학적 소견에서도 모든 시험물질 투여군이 대조군과 유의성이 있는 차이를 보이지 않았으며, 모두 정상 범위를 벗어나지 않아 시험물질에 기인하는 이상 소견을 발견할 수 없었다. 이상의 결과로 보아 4주 반복투여 독성시험 결과 항진균 및 항세균 활성을 지닌 유산균인 $Lb.$$plantarum$ AF1은 저독성 물질로 판정되었으며, 안전성 확인을 통하여 천연항균제로의 개발이 가능할 것으로 사료된다.
차나무 겹퉁근무늬병을 일으키는 Pestalotiopsis longiseta에 대하여 강력한 길항능력을 나타내는 Bacillus subtilis BD0310 균주의 대량배양을 위한 배양조건과 P. longiseta에 대한 항균활성을 증대시킬 수 있는 탄소원과 질소원을 선발하였다. B. subtilis BD0310 균주를 대량배양하기 위한 최적온도 및 시간은 $30^{\circ}C$, 24 시간인 것으로 확인되었으며, 초기 최적 pH 는 7 로 확인되었다. B. subtilis BD03l0 균주를 대량으로 배양할 경우 P. longiseta에 대한 항균활성을 가장 높게 증가시키는 탄소원을 선발하기 위하여 fructose, galactose, glucose, glycerol, inositol, lactose, maltose, sorbitol, starch 등 9 가지 탄소원을 사용하여 조사한 결과 maltose와 inositol이 가장 효율적인 탄소원으로 선발되었으며, casein, tryptone, malt extract, yeast extract, $(NH_4)_2SO_4$등 5 가지 질소원 중에서 yeast extract와 tryptone이 가장 효율적인 질소원으로 선발되었다. 이러 한 결과들은 길항세균 B. subtilis BD0310를 차나무 겹둥근무늬병 방제용 미생물제제로 개발하기 위한 대량배양생산 공정을 확립하는데 기여할 것으로 전망된다.
다기능성 농업용 미생물 제제를 개발하기 위하여 생물방제 및 생물비료 활성을 가지는 미생물을 탐색하였다. 본 연구실에서 분리 및 동정된 균주가운데 Pantoea agglomerans 및 Bacillus megaterium을 실험군주로 선정하였으며, 경남 밀양에 위치하는 양계장 부근 부엽토로부터 새로운 다목적 세균 MF12를 분리하였다. 형태학적, 배양적, 생화학적 특성 및 16S rDNA 염기서열을 분석한 결과, MF12는 Bacillus pumilis로 동정되었다. 이 균주들의 불용성 인산 가용능, IAA 및 siderophore 생성능, ammonification ability, 식물병원성 진균 세포성분 분해효소 생성능 및 항진균능을 조사하였다. P. agglomerans는 고체배지에서 불용성 인산을 가용화할 수 없었으나 액체배지에서는 가용성 인산을 생성하였다. 상기 모든 균주들은 배양시간에 따라 $3{\sim}639{\mu}g/ml$의 IAA를 생성하였으며, P. agglomerans만이 siderophore를 생성하였다. 이 균주는 pectinase와 lipase를 생성하였다. B. megaterium은 amylase, pretense 및 lipase를 생성한 반면 B. pumilisr는 protease와 lipase를 생성하였다. P. agglomerans는 Fusarium oxysporum과 Colletotrichum gloeosporioides의 생육을 억제하였으며, B. pumilis는 Botrytis cinerea, Sclerotinia sclerotiorum 및 Phythium ultimum의 생육을 억제하였다.
항진균 활성균주를 선발하는 과정에서 DM3 균주를 대천 바닷가에서 수집된 진흙 시료로부터 분리하였으며 API 50CHB kit를 이용하여 동정한 결과 Bacillus licheniformis로 동정되었다. 이 균주는 12종의 식물병원성 진균에 대해 항균활성을 나타내었다. 감마선($^{60}Co$)을 조사하여 항진균 활성 결핍 돌연변이체(mDMB)를 유도한 후, 이차원전기영동으로 단백질을 분석한 결과 DM3와 mDM3에만 존재하는 각각 4종과 3종의 단 단백질을 확인할 수 있었다. 2-DE 결과 B. licheniformis DM3에서 spot 1은 serine hydroxymethyltransferase(45.0kDa), spot 2는 hypothetical protein(40.7 kDa), spot 3는 NifU protein homolog(15.4 kDa), 그리고 spot 4는 resolvase(12.5 kDa)와 상동성을 지닌 단백질로 동정되었고 B. licheniformis mDM3에서만 발현된 spot 5는 lysozyme(18.1 kDa)과 spot 6, 7은 alkyl hydroperoxide reductase(15.6 kDa)으로 동정되었다. B. licheniformis DM3에서 이들 단백질들의 항진균 활성 관련 여부를 규명하기 위해서 더 연구가 진행되어야 할 것으로 사료된다.
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[게시일 2004년 10월 1일]
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