하수 슬러지로부터 감자 뿌리썩음병 및 토마토 탄저병을 유발하는 Colletotrichum coccodes에 대해 항진균 활성이 있는 세균을 분리하였다. 분리균의 partial 16S rRNA sequence는 Bacillus methylotrophicus CBMB205 및 Bacillus amyloliquefaciens subsp. plantarum FZB42와 각각 99%의 상동성을 보여주었다. 분리균은 neighbor-joining phylogenetic tree, BlastN 염기서열 분석, 형태학적 및 배양학적 특성에 따라 Bacillus sp. SW29-2로 동정하였다. 분리균 Baciilus sp. SW29-2는 B. methylotrophicus CBMB205 type strain과 비교시 4% 이상 NaCl에서 생육하는 것이외에 형태학적, 생리학적 특성이 모두 동일하였다. 분리은 호기성, Gram-양성, 내생포자를 형성하는 세균이었다. 실험한 $18-47^{\circ}C$(최적, 약 $38^{\circ}C$)의 온도범위에서, pH 3-9(최적, 약 6.0) 범위의 초기 배지 pH에서 모두 생육이 관찰되었다. Baciilus sp. SW29-2의 C. coccodes에 대한 생육저지환(직경)은 23 mm에서 29 mm의 범위이었다. 분리 세균은 또한 사과 푸른곰팡이병(penicillum rot disease)을 유발하는 Penicillium expansum에 대해 우수한 항진균 활성을 보여주었다. 현재까지, Bacillus속 세균의 C. coccodes에 대한 항균활성 연구는 파악할 수 없었다. 이 결과는 분리균 Bacillus sp. SW29-2가 식물 병원성 C. coccodes에 대해 생물학적 방제제로의 활용 가능성이 있으며, 추후, 식물병을 유발하는 다른 진균에 대해서 적용할 예정이다.
잣버섯의 다수성 신품종 개발을 위하여, 단포자교잡에 의해 육성된 신품종 '곤지10호'의 주요 특성은 다음과 같다. 균사생장적온은 $29^{\circ}C$, 버섯 발생 및 생육온도는 $20{\pm}1^{\circ}C$로 대조품종과 같았으며, 균사 활력도 대조품종과 비슷하였다. 갓형태는 반반구형이며, Hunter 색체값으로 볼 때 갓색은 L 79.3, b 24.8, 대색은 L 84.3, b 10.9로, 갓색에 있어서 대조품종에 비하여 황색도가 더 높았다. 미송톱밥+옥분(90:10, v/v)배지로 병재배 시 배양일수는 $22{\pm}1^{\circ}C$에서 35일, 발이일수와 자실체생육일수는 $20{\pm}1^{\circ}C$에서 15일과 12일로 재배일수는 62일이 되어 대조품종보다 2일 길었다. 자실체 생육 특성은 대조품종에 비하여 갓두께는 6.3 mm로 두꺼웠으며, 유효경수는 3.5개로 적었고 대 직경은 21.6 mm로 굵었다. 재배접종 후 배양 및 생육 중 푸른곰팡이병(Trichoderma spp.) 발생율은 4.9%로 대조품종보다 낮았다. 수량은 생산력 검정 결과 병재배 시 900 ml병당 69.6 g, 봉지재배 시 1 kg봉지당 114.2 g으로 대조품종 대비 38%와 10%씩 많았다. 자실체 물리성에서 갓의 강도와 취성이 대조품종보다 강했고, 저장성은 판매가능기간으로 볼 때 34일로 대조품종에 비하여 5일 길었다.
버들송이의 기존품종의 단점을 보완하고 품종 다양화를 위해, 단포자 교잡에 의해 육성된 '참'의 주요특성은 다음과 같다. 균사 생장적온은 $26{\sim}28^{\circ}C$로 '버들송이1호'보다 다소 높았고 버섯발생 및 생육온도는 $18{\sim}20^{\circ}C$로 '버들송이1호'와 같았으며, 톱밥+밀기울+미강+건비지(70:10:10:10, v/v)배지에서 재배 시, 배양온도 $22{\sim}23^{\circ}C$에서 배양일수는 38일 내외, 생육 온도 $18{\sim}20^{\circ}C$에서 발이 일수는 7일, 자실체 생육일수는 5일로, 재배일수는 50일이 되어 '버들송이1호'와 비슷하였다. 자실체는 개체형으로 발생하고 갓 형태는 반반구형으로 '버들송이1호'와 같았으나 갓 색은 갈색으로 '버들송이1호'보다 짙고 갓 두께가 '버들송이1호'보다 두꺼웠으며, 대는 '버들송이1호'보다 굵고 길었다. 병 발생에 있어서 PDA평판배지에 '참'과 병원균을 대치배양 시 Trichoderma virens와 Trichoderma harzianum에 대해서 '버들송이1호'와 같이 저항성이 약했으며, 포장재배시험에서도 배양과정에서 푸른곰팡이병(Trichoderma spp.)이 4.8~5.0%로 '버들송이1호'와 비슷하였다. 수량은 $850m{\ell}$병(${\phi}$58 mm)당 141 g으로 '버들송이1호'와 통계적 유의차가 없었으며, 물리성에서 갓의 강도 및 취성이 '버들송이1호'보다 높았고, 저장성에서 $4^{\circ}C$ 저장 시 판매가능기간으로 볼 때 10일로 '버들송이1호'보다 2일 길었다.
Trichoderma is known as pathogen caused serious green mold disease on commercial production. T. pleuroti and T. pleuroticola were common species in various mushroom media. Many strains of T. pleuroti, known as aggressive species causing major economic losses in Korea, showed benomyl resistance. Accurate identification and detection of Trichoderma species associated with oyster mushrooms is very important for disease control. We developed species-specific primers for T. pleuroticola, T. pleuroti, T. harzianum, and T. atroviride based on species-specific fragments isolated from amplified fragment length polymorphism analysis. PCR products corresponding to the predicted fragment of 500bp, 230bp, 180bp, and 410bp were amplified from T. pleuroticola, T. pleuroti, T. harzianum, and T. atroviride, respectively. Multiplex PCR assay using species-specific primers quickly and accurately identified and detected T. pleuroti from mushroom media in which various species co-exist. Our results can be useful for the effective control of mushroom disease.
본 연구는 국내산 침엽수 톱밥추출물을 이용하여 버섯의 푸른곰팡이병 방제약제 원료를 개발하고자 시도 되었으며, 푸른곰팡이병의 원인균의 하나인 Trichoderma 속 곰팡이를 대상으로 항균활성을 시험하였다. 1,000 ppm 농도의 낙엽송 열수추줄물은 Trichoderma 속 균주에 대하여 최고 20.6%의 항균활성을 나타냈다. 1,000 ppm 농도의 미송 열수추출물은 T. aggressivum에 대하여 60.3%, T. harzianum 52.2%, T. atroviride 46.8%, T.viride 46.1%의 높은 항균활성을 나타냈으며 T. koningii에서는 36.2%의 항균활성을 나타냈다. 미송 열수출물이 낙엽송 열수출물보다 Trichoderma 속 균주에 대하여 보다 효과적인 항균화합물을 함유하고 있다고 판단되었다. 낙엽송 열수출물로부터 분리된 n-hexane 분획물은 Trichoderma 속에 대하여 68.5% ~ 79.9%의 높은 항균활성을 나타냈다. 열수출물로부터 분리된 미송의 n-hexane 분획물은 T. aggressivum에 대하여 68.5%, T. atroviride에 대하여 71.4%, T. harzianum에 대하여 71.9%, T. koningii에 대하여 75.7%, T.viride에 대하여 82.3%의 높은 항균활성을 나타냈고, ethyl acetate 분획물이 n-hexane 분획물 다음으로 높은 항균활성이 나타내었다. Trichoderma 속 균주에 대한 낙엽송 및 미송 열수추출물의 항균활성은 미송 추출물이 낙엽송 추출물보다 높게 나타났지만, 낙엽송과 미송의 열수추출물로부터 분리된 n-hexane 분획물에 의한 항균활성 차이는 거의 없었다. 미송 열수추출물과 낙엽송 및 미송의 열수출물로부터 획득된 n-hexane 분획물은 Trichoderma 속에 대한 항균원료로서 사용가능성을 확인할 수 있었다.
느타리버섯재배에서 심각한 피해를 주고 있는 푸른곰팡이병을 억제하고 버섯균사의 생장을 촉진하여 버섯의 안정생산을 도모하기 위한 탄산칼슘의 처리효과를 실내 및 실외시험을 실시한 결과. PDA배지에서의 $CaCO_3$의 처리는 버섯균의 균사생장을 촉진하고, 병원균은 억제되었으며, 볏짚배지상의 $CaCO_3$의 처리에서는 버섯균은 무처리에 비하여 균사생장이 증가되었으며, 병원균 대체적으로 0.6%의 처리까지는 증가되나 0.8%처리부터는 감소되는 경향을 나타냈다. 컬럼 내의 볏짚배지에서의 Trichoderma longibrachiatum의 접종구에서는 $CaCO_3$의 처리효과가 있었으나 T. virens의 접종구에서는 $CaCO_3$의 효과가 없었다. $CaCO_3$의 처리에 따른 느타리버섯 품종간의 균사생장의 차이는 없었다. $CaCO_3$는 처리에 따라 느타리버섯의 균사생장은 촉진하고 푸른곰팡이병원균과 붉은빵곰팡이균에 대해 약간의 억제 능력은 인정되었다. 포장시험 결과 수량성은 무처리구에 비하여 높으며, 발병율은 낮은 경향이나 절대적인 방제효과는 없었다.
균상느타리버섯에서 발생하는 곰팡이 병해 중에서 가장 많은 문제를 발생하는 것은 Trichoderma disease 또는 green mould 등으로 불리우는 푸른곰팡이병이다. 이 병은 Trichoderma, Penicillium, Aspergillus 등의 속(genus)에 포함되는 종들에 의해 발병되는 병을 총칭하는 것으로 발생빈도와 피해가 가장 큰 것은 Trichoderma 속의 병원균에 의해 발생하였다. 느타리버섯 균상에 분리된 병원균은 T. longibrachiatum, T. koningii, Trichoderma virens, T atroviride, T. hazianum, T. pseudokoningii 6종이었으며, 발생빈도가 높은 것은 T. virens, T. hazianum, T. longibrachiatum 3종이었고, 각각의 균은 배양적 특성 및 병원성도 각기 다른 특성을 보이고 있었다. T. longibrachiatum 균사생장이 매우 빠르고, 포자형성이 빠르며, 특히 후막포자형성이 잘되는 특성을 있으며, 후기에는 진한 녹색으로 변색된다. Trichoderma koningii는 균사생장은 빠르고, 공중균사가 많은 편이며, 포자는 공중균사에 밀집되어 형성된다. 특히 Trichoderma virens 같은 경우에는 포자형성에 의한 색깔변화가 느리며, 감염후기에 발견되어 그 피해가 심한 편이었다. Trichoderma atroviride. 균사생장은 보통이며, 포자형성은 공중균사에 드물게 형성되며, 후기에는 진녹색을 띤다. 이균의 특징은 coconut 냄새와 유사한 향기가 나는 것이다. T. hazianum은 초기에는 균사가 백색으로 매우 빠르고, 공중균사에 포자가 형성하며, 후기에는 진한 녹색으로 변색된다. 공중 균사에 형성된 포자는 육안적으로 pustules or tufts의 형태를 나타내었다. Trichoderma pseudokoningii 균사생장은 빠르며, 포자형성은 접종부위를 중심으로 형성되며, 후기에는 환무니를 형성하며, 특히 배지 색이 변색되고 후막포자 잘 형성되는 특징이 있었다.
느타리의 품종 다양화를 위해 단핵균주교잡에 의해 육성된 봉지재배용 느타리버섯 '곤지2호'의 주요특성은 다음과 같다. 가. 균사생장적온은 $26{\sim}29^{\circ}C$이고 버섯발생 및 생육온도는 $14{\sim}18^{\circ}C$로 광온성을 나타내었다. 나. 갓색은 진회색(L=40.8)이고 얕은 깔대기형으로 갓 조직의 탄력성이 우수하였다. 다. 대는 백색이며 굵고 긴형태를 나타내었으며, 버섯조직은 수한1호와 탄력성이 유사하였고 씹음성과 깨짐성이 높아 대조에 비해 질긴편이었다. 라. 봉지재배시 배양일수는 $20^{\circ}C$에서 20일, 초발이 소요일수는 5일, 자실체 생육일수는 4일이었다. 마. 버섯의 균일성에 있어서 갓색과 갓형태의 이형개체 발생은 없었으며, 환경 및 배지적응성이 우수하였다. 바. 세균성 갈변병과 푸른곰팡이병에 대한 병해에 없었으며 재배 환경관리가 적정할 경우 병해에 강한 편이었다. 사. DNA다형성을 비교 분석한 결과 UFPF2, UFPF5, UFPF7등의 모든 primer에서 대조구인 수한1호와는 완전히 다른 밴드양상을 나타내어 품종간의 구분이 확실하였고, 교잡모본과 혼합된 밴드양상을 나타내었다. 아. 수량은 생산력검정시 1kg 봉지에서 323.3g을 나타내어 27% 증수효과가 있었고, 농가실증재배시 301g으로 대조품종에 비해 16%증수가 되었다.
본 시험은 재배과정 중 균상배지에서 분리한 세균들의 특성을 조사하여 버섯균의 생육 및 병원균과의 연관관계를 밝히고자 하였다. 정상적으로 버섯을 수확한 농가의 경우 버섯생육초기에 분리한 세균일수록 버섯균주에 대해 저해정도가 감소하였으나, 생육이 진행될수록 저해균의 수가 증가하였으나, 버섯 수확에 실패한 농가의 경우 반대의 경향을 보였다. 또한 합성배지에 분리세균을 도말한 후 느타리버섯 균의 생육을 조사한 결과 정상적 농가의 경우 살균 직후 보다 생육이 진행될수록 저해균의 수가 증가하였지만, 실패한 농가는 오히려 반대의 경향을 보였다. 그러나 톱밥배지에서는 버섯생육초기보다 후기에 분리한 세균이 저해하는 정도가 오히려 낮았다. 또한 이들 분리 세균은 분비성 물질을 통해서 버섯균의 생육과 증식에 영향을 미쳤다. 분리 미생물 중 세균성갈반병의 원인균인 Pseudomonas tolaasii을 강하게 억제하는 미생물은 거의 없었으며 소수의 균주에서 약한 길항력을 보였다. 그러나 세균성갈색무늬병을 일으키는 P. agarici에 대해서는 강한 억제력을 보이는 균주가 많이 존재하였으며, 푸른곰팡이병의 원인균인 Trichoderma harzianum을 강하게 억제하는 미생물도 배지내에 거의 존재하지 않았다. 이와 같이 배지내에는 다양한 미생물이 존재하고 이들 다양한 미생물과 버섯균의 상호작용에 대한 면밀한 연구가 이루어진다면 느타리버섯 재배과정 중 발생하는 다양한 문제점을 해결할 수 있는 좋은 방법이 될 수 있을것으로 생각된다.
본 연구는 수목으로부터 분리된 수용성 정유를 이용하여 버섯에 병해를 일으키는 푸른곰팡이병의 원인 미생물인 Trichoderma에 대한 항균활성을 확인하고자 시도되었다. 소나무(Pinus densiflora)와 편백나무(Chamaecyparis obtusa) 잎으로부터 GAP (Gas assisted process)을 이용하여 수용성 정유를 획득하였다. 버섯의 푸른 곰팡이병을 발생시키는 Trichoderma spp. 곰팡이 5종은 $25^{\circ}C$에서 균사생장이 가장 높았으며, pH 5.0의 배지조건에서 가장 양호한 균사 생장을 나타내었다. 소나무와 편백나무 잎의 수용성 정유는 3.9% 및 3.7%의 수율을 나타내었다. 소나무와 편백나무 잎 정유의 화학적 조성은 동일 화합물이 많았으며, 동일 화합물로는 $\alpha$-Terpineol acetate, Terpinen-4-ol 및 $\alpha$-Terpineol이 확인되었다. 소나무 잎의 수용성 정유는 5000 ppm 농도에서 Trichoderma harzianum에 대하여 가장 높은 항균활성을 나타냈으며, 편백나무 잎의 수용성 정유 또한 5000 ppm 농도에서 Trichoderma atroviride에 대하여 가장 높은 항균활성을 나타내었다.
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[게시일 2004년 10월 1일]
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