• 한국미생물·생명공학회지
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• 제44권4호
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• pp.470-478
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• 2016

지렁이의 장내로부터 분리한 미생물 중에서 키틴 가수분해 활성이 우수한 미생물을 선발하였으며, 이를 동정하여 Bacillus licheniformis GA9으로 명명하였다. B. licheniformis GA9이 생산하는 키틴 분해효소의 정제는 배양상등액 40-60% 황산암모늄 침전, 음이온교환 크로마토그래피, 겔 크로마토그래피를 사용하여 정제하였다. 최종적으로 정제한 키틴 분해효소는 45.2배로 정제되었고 효소단백질 회수율은 20.0%를 나타내었다. 정제한 키틴 분해효소의 분자량은 약 52.1 kDa으로 나타났으며, N-terminal amino acid sequencing 분석결과, 아미노산 서열은 D-S-G-K-N-G-K-I-I-R-Y-Y-P-IR로 확인되었다. 키틴 분해효소의 최적반응 pH와 pH 안정성을 측정한 결과, pH 5.0에서 최대 활성을 나타내었으며 pH 5.0-6.0에서 안정성을 나타내었다. 키틴 분해효소의 최적반응 온도와 온도안정성의 경우, $40^{\circ}C$에서 최대 활성을 나타내었으며, $60^{\circ}C$까지 60%의 잔존 활성을 나타내었다. 정제한 키틴 분해효소는 10 mM $Co^{2+}$ 금속이온에 의해 효소활성이 증가하였으며, $Fe^{2+}$과 $Cu^{2+}$ 금속이온에 의해 효소활성이 감소하였으나, EDTA 첨가시 감소한 효소활성이 일부 회복되었다. 정제한 효소의 $K_m$ 및 $V_{max}$는 각각 4.02 mg/ml와 0.52 mg/min이었다. 또한 키틴 분해효소는 생명공학, 생물의약, 농업, 식품영양 등 다양한 산업분야에서 응용이 가능하다.

• Applied Biological Chemistry
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• 제40권2호
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• pp.95-100
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• 1997

키틴을 효소적인 방법으로 분해하여 키틴올리고머를 생산할 수 있는 값싸고 안정적인 효소원을 확보하기 위하여 농어, 방어, 대구, 닭 등의 동물체로 부터 키틴분해효소를 탐색하였다. 각 효소원의 장기와 소화액 및 달팽이 ${\beta}-glucuronidase$로 부터 키틴분해활성을 측정한 결과, 대구와 닭은 키틴을 주로 중합도 $3{\sim}5$의 크기로 분해하며 endochitinase의 활성도가 exochitinase활성보다 $7{\sim}10$배 높았다. 달팽이 ${\beta}-glucuronidase$는 키틴을 모두 N-acetylglucosamine으로 분해하였고 닭의 경우 소화기조직과 내용물에서 모두 endochitinase활성이 높았다. 어류중에서 농어는 키틴분해활성을 보이지 않았으며 방어와 대구는 비슷한 수준의 키틴분해활성을 보였다. 이들 효소의 최적pH는 $4{\sim}5$, 최적온도는 $50{\sim}60^{\circ}C$였다. 한편 키토산분해능력은 닭의 소화기내용물과 조직, 대구의 위조직에서 관찰되었으며, 닭 소화기내용물이 가장 높았으나 키틴분해능의 15%에 지나지 않았으며 그 다음은 달팽이의 ${\beta}-glucuronidase$로 닭 소화기내용물의 키토산분해능력의 약 30% 활성을 보였다. 키틴올리고머의 생산을 위한 가장 적합한 효소원으로 exochitinase활성이 적고, endochitinase활성이 높으며 값이 저렴하고 안정적인 공급이 가능한 닭의 소화기가 적합한 것으로 사료되었다.

• 식물조직배양학회지
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• 제21권6호
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• pp.357-362
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• 1994

키틴 가수분해 효소와 베타-1,3-글루카네이즈는 식물체의 주요 방어효소로 여겨지고 있다. 본 논문에서는 아기장대풀의 잎조직으로부터 고정된 현탁배양주를 만들고 이어서 에틸렌과 유인제 (elicitor) 처리에 의한 키틴 가수분해 효소유도양상을 분석하였다. 키틴 가수분해 효소활성은 $^3$H으로 표지된 키토산을 기질로 한 radiochemical 분석방법이나 담배식물체의 키틴 가수분해 효소를 대상으로 얻어진 항체를 이용하여 Western 분석방법을 사용하였다. 이 결과 에틸렌과 유인제 처리 공히 48시간후에 가장 활성이 높게 나타남을 관찰하였다. 또한 씨앗, 새싹, 식물체의 잎, 뿌리 등에서의 활성을 조사하여 뿌리에서 키틴 가수분해 효소 활성이 높음을 확인하였다.

• 생명과학회지
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• 제18권11호
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• pp.1617-1624
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• 2008

키틴과 그 탈아세틸화된 형태인 키토산은 지구 상에 가장 풍부하게 존재하는 바이오매스의 하나이다. 키틴과 키토산은 항균활성, 면역증강, 중금속 흡착 등 다양한 생리활성을 보이고 있으며 식품, 의약품, 환경산업 등에서 다양하게 응용되고 있다. 이러한 키틴/키토산을 가수분해하는 효소들과 그 3차구조, 유전자들이 세균, 고세균, 진핵생물등 모든 생물종에서 보고되어 왔다. 탄수화물을 가수분해하는 효소들은 그 아미노산 서열에 따라 CAZy (Carbohydrate Active Enzymes) 데이터베이스에 분류되었는데 흥미롭게도 최근까지 키틴가수분해효소와 키토산가수분해효소들은 14개의 glycosyl hydrolase (GH) family들로 분류되어 있다(GH2, GH5, GH7, GH8, GH18, GH19, GH20, GH46, GH48, GH73, GH75, GH80, GH84, GH85). 본 총설에서는 새로운 유전자원를 찾기위한 한 방편으로서 최근에 새롭게 분류된 glycosyl hydrolase family의 분류법에 따라 각각의 GH family에 속하는 키틴/키토산가수분해효소의 종류 및 구조, 그리고 그 효소적 특징에 대하여 논하고자 한다.

• Applied Biological Chemistry
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• 제39권6호
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• pp.466-471
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• 1996

키틴을 효소적인 방법으로 분해하여 키틴 올리고머를 생산할 수 있는 값싸고 안정적인 효소원을 확보하기 위하여 벼, 콩, 참다래, 아몬드, 조(粗)파파인 등의 식물체로부터 키틴분해효소를 탐색하였다. 왕겨, 콩껍질, 참다래의 외피 등에서 키틴분해효소의 활성이 나타났으며 껍질을 제거한 콩, 쌀기울, 백미, 탈지 대두분 등에서는 활성이 없었다. 이들 키틴분해효소는 exochitinase와 endochitinase 형태의 두종류 활성을 갖는 것이 관찰되었으며, 참다래와 조(粗)파파인에서 endochitinase의 활성이 높았다. pH의 영향은 exochitinase의 경우 효소원에 따라 $pH\;5{\sim}7$ 사이에서 최대활성을 나타내었고 endochitinase는 모두 pH 3과 $pH\;5{\sim}6$의 두 곳에서 최대활성을 나타내었다. 온도변화에 의한 exochitinase의 활성은 $50^{\circ}C$에서도 비교적 안정했다. 반면에 endochitinase는 종류에 따라 다양한 최적 온도를 갖는 것이 관찰되었다. 또한 이들 조효소는 키토산분해 활성을 갖고 있었으며 왕겨가 가장 높고 콩껍질, 참다래의 순서였다. 키틴을 이용한 키틴올리고머의 생산을 위한 가장 적합한 효소원으로는 exochitinase의 활성이 가장 적으며 endochitinase의 활성이 높은 조(粗)파파인이 가장 적합한 것으로 사료되었다.

• 생명과학회지
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• 제8권6호
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• pp.627-637
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• 1998

수산가공공장에서 원료어 처리시 생성되는 부산물인 참치 내장중 유문수 조직으로부터 높은 활성을 가진 단백질 분해효소를 추출하고, 이것을 부분 정제하여 참치 유문수 유래 조효소(TPCCE)를 대량으로 제조하였다. 제조된 TP-CCE에 대한 최적활성조건을 규명하였으며, 아울러 시판 정제 단백질 분해효소들과 비교하였다. 또한 TPCCE의 열안정성을 높이고자 몇가지 종류의 담체에 물리적으로 흡착시켜 제조한 고정화 효소의 열안정성을 검토하였다. 1. 참치 유문수 조직으로부터 높은 활성을 가진 단백질 가수분해효소를 부분정제하여 조효소 상태를 추출하였으며 이때의 수율은 약 2.7% 정도로 매우 높았다. 활성은 천연기질인 카제인에 대하여 0.54 U/mg이었고, 합성기질인 BTEE와 BAEE에서는 각각 1.10과 2.69 U/mg로서 시판정제효소인 trypsin과 유사한 활성을 나타내었다. 2. 참치유문수 유래 조효소의 천연기질인 casein에 대한 가수분해의 최적조건은 pH 10.0, 반응온도 45$^{\circ}C$, 반응시간 12시간이었으며, 이 때의 가수분해도는 약 80%였다. 3. 참치 유문수로부터 추출된 조효소를 여러 가지 담체에 고정화시켰으며 이용된 담체중에서 고정화율은 Chitopearl, DEAE-Cellulose 및 키틴 순으로 가장 높았으며(70~80%), 합성기질인 BAEE에 대한 활성은 키틴, DEAE-Cellu-lose 및 키토산 고정화 효소의 순서로 각각 2.46 U/mg, 2.35U/mg, 및 2.29 U/mg이었고, BTEE에 대한 활성은 키토산, 키틴, CM-Cellulose의 순서로 각각 0.89 U/mg, 0.88 U/mg 및 0.86 U/mg이였다. 이중 키틴 고정화 효소가 모든 조건에서 충분한 효과를 보여 가장 효율적으로 나타났다. 4. 고정화 효소의 열안정성에서 대부분의 고정화 효소는 유리 TPCCE보다 높은 열안정을 보였으며, 특히 DEAE-Ce-llulose를 이용한 고정화 효소는 6$0^{\circ}C$의 높은 온도에서 7일이 경과한 후에도 약 95%의 활성을 유지하여 장시간의 효소 반응공정이나 고정화 효소를 이용한 컬럼 반응에서의 연속적 단백질 가수분해물 생성과 같은 공정에서 매우 효과적으로 이용될 수 있을 것으로 판단된다.

• KSBB Journal
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• 제13권2호
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• pp.147-154
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• 1998

키토산 올리고당을 효율적으로 생산하기 위하여 고정화 효소 를 이용한 키토산의 효소적 가수분해를 시도하였다. Chitosanase는 Chitopearl계 고정화 담체에 대해서 높은 흡착율로 결합되었다. 키틴에 고정화된 효소는 비록 흡착율은 낮았지 만 그 활성은 가장 높게 나타났다. 키틴 고정화 효소는 유리 효소에 비해 약 90% 이상의 활성을 유지하였다. 고정화 효소의 최적 온도는 60°C로서 유리 효소보다 $15^{\circ}C$ 더 높았으며, 열에 대한 안정성도 유리 효소보다 넓은 온도범위에서 우수하였다 그러나 고정화 효소는 pH에 대해서는 어떠한 뚜렷한 효과도 보이지 않았다. 고정화 효소의 저장 안정성은 유리 효소보다 더 높은 저장온도인 60t에서도 더 안정한 것으로 나타났다. 키틴 고정화 효소에 의한 키토산의 가수분해반응은 반응 3시간까지 급격한 증가를 보이다 그 이후의 반응시간 경과에서도 더 이상 증가를 보이지 않았다. 고정화 효소에 의해 생성된 올리고당의 조성은 효소의 반응시간에 따라 크게 의존하였으며, 2시간의 반 응에서 비교적 고차 올라고당인 COS-4-6의 함량은 약 90% 이상이었다 두 효소에 대한 반용속도상수에서, 고정화 효소는 유리 효소에 비해 낮은 기질친화성과 낮은 반웅속도를 보였지 만, 높은 기질농도에서도 전혀 기질저해반응은 일어나지 않았다. 따라서 키틴 고정화 효소는 유리 효소에 비해 활성의 감소없이 효율적으로 키토산을 가수분해할 수 있었으며, 고차 올리고당의 생성 량도 매우 높았다.

• Journal of Animal Science and Technology
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• 제51권5호
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• pp.387-394
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• 2009

본 연구는 키틴으로부터 면역증강물질인 N-acetyl-Dglucosamine을 축적시킴으로써 동물의 면역력을 향상시켜 폐사율을 줄이고자 키틴이 함유된 DFM을 급여한 생후 3~7개월령된 한우 송아지의 분변에서 키틴분해 효소능을 가진 미생물을 분리 동정하기 위해서 수행하였다. 송아지 분변 1g당 키틴이 함유된 배지상에서 $10^5$ 이상의 집락이 형성된 10균주 중 키틴을 분해하는 2균주와 키토산을 분해하는 2균주를 선발하였으며 이들은 모두 용혈성을 갖지 않는 것으로 나타났다. 키틴을 분해하는 균주는 선발한 4균주 모두 그람 음성균으로서 HANDI 110과 HANDI 309는 키틴을 분해하는 균주로 선발되었으며 HANWOO와 HANYOO는 키토산을 분해하는 균주로 선발되었다. 분리된 미생물은 형태학적, 물리화학적 및 유전학적 분류를 통해 HANDI 110는 Escherichia fergusonii으로, HANDI 309는 Acinetobacter parvus으로, HANWOO는 Comamonas koreensis으로 HANYOO는 Chryseobacterium indologenes으로 각각 동정하였다.

• 식품과학과 산업
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• 제53권1호
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• pp.33-42
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• 2020

최근 환경친화적 농업정책의 흐름에 따라 친환경 유기농자재 중에서 농업용 키토산에 관한 제품 등록이 토양개량제, 작물생육용, 병해충방제용 등 다양한 형태로 표시되고 있으나, 천연고분자물질인 키틴 원료를 이용한 제품 등록은 미미한 실정이다. 다만 키틴 기질을 함께 이용할 수 있는 키틴분해 미생물에 관한 유기농자재는 일부 등록되어 있다. 현재 국내 키틴·키토산 제조업체는 게껍질에서 산처리와 알카리처리에 의해서 얻어진 키틴 원료를 그대로 판매할 경우 매우 낮은 수익을 얻게 됨으로 탈아세틸화 단계 과정을 거쳐 제조되는 키토산 형태로 판매하거나 산처리와 효소처리에 의한 분자량을 달리한 키토산올리고당 형태로 제품화 하는 경우가 대부분이다. 실제 농업 현장에서는 토양개량을 위해 게껍질을 그대로 이용하는 경우가 있다. 하지만 게껍질에 포함된 40~50%의 탄산칼슘의 분해는 유기산 생성미생물에 의해 분해되어야 한다. 따라서 산업체에서 생산된 탄산칼슘을 제거한 키틴의 사용이 매우 효율적이다. 따라서 키틴생산 산업체에서는 식품용, 의료용 등의 고품질 고비용보다 농업용의 키틴을 저품질 저비용으로 생산함으로써 경쟁력을 가져올 수 있을 것으로 보인다. 농업용 유기농자재 대부분 제품에서 키토산이 약산에 녹여진 상태인 액상임으로 실제적인 키토산의 농도는 1~5% 범위로 매우 낮은 수준이다. 일부 제품의 경우 첨가물로 미량의 키토산올리고당 또는 키토산아제가 포함되어 있는 경우도 있다. 작물이 생산되는 농가 토양내 키틴분해와 키토산분해를 할 수 있는 다양한 토양미생물이 존재함으로 키틴과 키토산을 기질로 하여 토양개량, 작물생육 향상, 병해충 방제 목적으로 적합하게 농업 현장에 잘 적용함으로써 천연에서 얻어진 고분자 키틴·키토산 농자재가 농가의 환경보전 및 농가소득 향상에 매우 의미 있는 역할을 가질 것으로 생각된다. 본 연구보고문에서는 국내 주요 키틴·키토산 생산업체의 소개와 이들 업체의 주요 생산품을 살펴보고, 국립농산물품질관리원의 유기농업자재정보시스템에서 키틴·키토산 원료를 이용한 친환경 유기농자재 업체별 등록현황에 대한 비교·분석을 통하여 국내 키틴·키토산의 농업적 활용 범위를 더욱 확대할 수 있는 기회를 마련하고자 한다.

• 식물조직배양학회지
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• 제22권2호
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• pp.95-99
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• 1995

본 연구는 이미 확립되어 있는 고려인삼의 체세포배발생을 통한 식물체 재분화와 Agrobacterium을 매개로 한 형질전환 시스템을 이용하여 항곰팡이성 인삼을 개발하고자 염기성인 강낭콩 키틴가수분해효소 유전자를 인삼으로 도입하였다. CaMV 35S promoter-강낭콩 키틴가수분해효소 유전자와 선발표지로서의 neomycin phosphotransferase II (NPT II) 유전자를 가진 pChi/748 binary 벡터를 pGA748로부터 제조하여 이를 도입한 A. tumefacience LBA4404와 인삼 접합배의 자엽절편을 1 mg/L 24-D, 0.1 mg/L kinetin이 첨가된 MS 액체배지에서 48시간 동안 공동배양한 후 동일배지에 100 mg/L kanamycine 500 mg/L carbenicillin을 첨가한 고체 배지에 옮겨 배양하였다. 배양 한달 후부터 절편의 절단면 부근으로부터 캘러스가 유도되기 시작하였으며 이어서 수많은 체세포배가 형성되었다. 이들 체세포배를 BA와 GA3가 각각 1 mg/L 첨가된 배지로 옮겨서 5주 경과되었을 때 식물체로 전환되었다. 재분화된 개체 중 선발된 8개의 식물체로부터 PCR과 이 산물의 Southern분석 결과 6개의 재분화 개체에서 강낭콩 키틴가수분해효소 유전자가 도입되었음을 확인하였다.