본 연구에서는 염소, 오존, UV에 의한 크립토스포리디움의 불활성화정도를 평가하기 위해 HCT-8세포를 사용하는 세포배양법과 최적확수기법을 결합하였다. 이 방법은 크립토스포리디움 감염성을 평가하는데 있어 "gold standard"라고 여겨지는 동물감염성 실험 만큼이나 민감하였고 소독제에 의한 크립토스포리디움의 불활성화를 측정할 수 있는 유용한 방법이었다. 실험실규모의 연구결과, $5^{\circ}C$, pH 7.0 조건에서 크립토스포리움을 약 1 log 불활성화시키기위한 염소와 오존 CT값은 각각 $1,250mg{\cdot}min/L,\;16mg{\cdot}min/L$ 이었다. 이는 오존을 사용하여 소독하였을 때 조차도 낮은 온도에서는 크립토스포리디움을 불활성화시키기 어렵다는 것을 보여주는 것이다. 염소와 오존과는 달리 UV는 온도에 상관없이 크립토스포리디움을 불활성화시키기에 매우 효과적이어서 UV가 2 $mJ/cm^2$ 조사되었을 때 크립토스포리디움이 3 log 이상 불활성화되었다.
먹는 물에 존재하는 크립토스포리디움 및 지아디아등 기존의 표준 정수처리 공정에 의해 제거가 용이치 않은 원생동물 둥을 채집할 수 있는 미생물 검출 캡슐을 개발하였다. 본 장치의 여과필터는 고분자물질을 소재로 한 중공사 형태(Hollow Fiber Membrane)로 유효여과면적을 크게하였고, Pore size는 0.1㎛이다. 채집캡슐은 탁도에 따른 투과수량은 일차의 상관관계를 나타내며, 시간당 20ℓ를 투과시킬 때 탁도 7.0 NTU까지 가능함을 확인 할 수 있었다. 일차 시제품은 89.6-94.6%의 크립토스포리디움 및 72.6-78.6%의 지아디아 포낭을 회수하였고, 이차 시제품은 92.5-93.7%의 크립토스포리디움 및 81.3-88.2%의 지아디아 포낭을 회수하는 것으로 나타났다. 동일한 조건에서 외국제품은 84.0%의 크립토스포리디움 및 66.7%의 지아디아 포낭을 회수하는 것으로 나타났다.
7일령의 송아지 4마리에 실험적으로 크립토스포리디움을 감염시키고 면역혈청, 면역초유 그리고 단크론항체(C6)을 투여하여 이들의 면역요법제로서의 효과를 측정하였다. 크립토스포리디움 감염후 4일째부터 3일간 하루 2회(200~500ml)씩 3종의 면역요법제를 송아지 1마리씩 각각 경구로 투여하였으며, 나머지 한마리의 대조송아지에는 인산 완충액을 경구로 투여하였다. 크립토스포리디움에 감염된 송아지들은 설사를 나타냈는데 대조송아지의 경우 감염후 3일째부터 9일간 설사증상을 나타냈다. 면역혈청, 면역초유 그리고 C6로 치료한 송아지들은 치료후 각각 3일, 2일, 5일째부터 정상에 가까운 분변을 배출하기 시작하였다. 면역혈청과 면역초유로 치료한 송아지들의 경우, 분변으로 배출되는 오시스트의 수가 대조송아지에 비해 현저하게 줄어들었다. 이러한 결과들은 실험에 제공된 면역요법제중 면역초유나 면역혈청이 크립토스포리디움에 감염된 송아지의 설사증상과 오시스트의 배출을 억제하는 효과가 있음을 나타내는 것이다.
Cryptosporidium의 sporozoite에 대한 단클론항체(C6B6 C4Al)와 merozoite에 대한 단클론항체(Cmg-3)를 크립토스포리디움 오오시스트로 감염시킨, 생후 괄일된 생쥐에 4일 혹은 8일간 경구 투여하여 크립토스포리디움 감염에 미치는 효과를 조사하였다. 투여는 Cmg-3만으로, 혹은 C6B6, C4A1, Cmg-3를 함께 섞은 것으로, 그리고 식염수로 실행하였다. p < 0.05 수준에서 항체투여를 받은 것과 받지 않은 그룹 사이에 현격한 차이가 관찰되었다. Crng-3 한개만으로 투여하였을 때는 4일간 투여하였을 때만 효과가 있었던 반면, 3개의 단클론항체를 함께 투여하였을 때는 4일간. 8일간 모두 기생충의 증식을 현격히 감소시켰다. 이것은 경구투여된 항체가 장내에 기생하는 크립토스포리디움의 증식을 억제한 것을 보여주는 것이며 크립토스포리디움증에 대한 치료약이 없는 상황에서 치료법 개발에 새로운 접근 방법을 제시한다고 판단된다.
크립토스포리디움의 활성 및 감염성 판정을 위해 Direct RT-PCR, 세포배양 후 RT-PCR 및 면역형광염색법을 비교한 결과는 다음과 같다. 1) 크립토스포리디움의 HSP70 gene에 대해 direct RT-PCR한 결과, 민감도가 매우 높아 저농도로 존재하는 환경시료에서의 크립토스포리디움 활성을 모니터링하는데 장점이 있을 것으로 보이나, 감염성의 판정은 알 수 없으며, 정량화가 안되는 단점이 있었다. 2) ${\beta}-tubulin$ gene에 대해 RT-nested PCR을 한 결과 크립 토스포리디움의 난포낭이 $1{\times}10^4$ 세포수정도 되어야 검출이 되는 것으로 나타나 HSP70 gene에 대한 RT-PCR결과와 비교할 때 10,000배 이상 민감도가 떨어지는 것으로 나타났다. 3) 세포배양 후 RT-PCR 또는 면역형광염색법을 이용할 경우에는 민감도가 direct RT-PCR보다 다소 떨어지는 단점이 있었으나 크립토스포리디움의 오염원이나 오염이 심한 지역의 감염성 조사에 적합할 것으로 나타났으나, 정량화가 필요한 경우에는 세포배양 후 면역형광염색법이 효과적일 것으로 나타났다.
크립토스포리디움은 염소내성이 매우 강해 일반적인 표준정수처리공정의 소독으로는 제거가 불가능하다. 따라서 본 연구에서는 오존 및 UV를 이용한 단위소독공정에서 DAPI/PI 및 in vitro excystation을 이용하여 크립토스포리디움 불활성화를 평가하였으며, 또한 오존을 이용한 고도산화처리 파일럿에서는 세포배양법을 이용하여 크립토스포리디움 불활성화를 평가하였다. 오존 소독연구는 50 mL 용량의 piston type batch reactor에서 용존오존을 자동적으로 측정해주는 flow injection analysis (FIA) 시스템을 이용하여 실험한 결과, 1 log 제거에 필요한 CT값은 $25^{\circ}C$에서 DAPI/PI 및 in vitro excystation에 의해 각각 약 1.8, 2.2 $mg/L{\cdot}min$으로 나타났으며, 2 log 제거에 필요한 CT값은 각각 약 3.2, 3.8 $mg/L{\cdot}min$으로 나타났다. 또한 $5^{\circ}C$에서 크립토스포리디움 1 log 제거에 필요한 CT값은 DAPI/PI 방법에 의해 약 9.1 $mg/L{\cdot}min$으로 나타났으며, 2 log제거에 필요한 CT값은 14.8 $mg/L{\cdot}min$로 나타나, 같은 소독효과를 나타내기 위해서 저온에서는 상온에서보다 요존 요구량이 약 $4{\sim}5$배 정도 증가하여야 함을 확인하였다. 40 L규모의 오존 반응조를 이용한 파일럿 실험에서는 정수처리공정상 모래여과를 거친 물에 살아있는 크립토스포리디움을 접종한 것을 시료로 하여 연속적으로 흐르게 한 다음, 오존량을 변화시키고 체류시간은 5분으로 고정하여 불활성화를 평가하였다. 실험결과, 8 $mg/L{\cdot}min$의 CT값에서 DAPI/PI 및 excystation과 같은 생사판별법을 이용하였을 경우에는 약 0.2 log정도의 불활성화를 나타내었으며, 세포감염시험법을 이용하였을 경우에는 약 1.2 log정도의 불활성화를 나타냈다. 오존에 의한 크립토스포리디움의 소독능 평가에 단위공정 및 파일럿 실험 모두 2가지 생사판별법(DAPI/PI와 excystation) 사이에는 큰 차이를 나타내지 않았으나, 생사판별법과 세포감염시험법 사이에는 현저한 차이를 나타내었는데, 이는 세포감염시험법으로 측정하는 sporozoite 및 merozoite로의 분화과정이 생사판별법이 근거한 세포벽의 구조와 기능 유지 보다 더 오존 소독에 더 민감함을 알 수 있었다. 파일럿 실험에서의 CT값이 piston batch reactor에서의 CT값 보다 낮게 나타난 것은 파일럿 실험에서 수작업으로 인한 용존 오존 측정이 정밀하지 못하여 IOD가 농도에 반영되지 않았고, 반응조 규모(50 mL vs 40 L) 및 형태(회분식 vs 연속식)의 차이에 기인하는 것으로 여겨진다. 한편, UV를 이용한 단위공정에서는 크립토스포리디움 1, 2 log 제거에 필요한 IT값은 $25^{\circ}C$에서 각각 DAPI/PI 방법에 의해 약 25, 50 $mWs/cm^2$로 나타났으며, $5^{\circ}C$에서의 크립토스포리디움 1, 2 log제거에 필요한 IT값은 약 40, 80 $mWs/cm^2$로 나타났다. 온도 $20^{\circ}C$ 감소 시 약 60% 정도의 IT값이 더 필요한데, 이것은 저온에서는 약한 자외선을 발산하는 저압저출력 UV 램프의 특성 때문인 것으로 사료되었다.
국내 정수처리에 있어 기존 장티프스, 콜레라 등과 같은 병원성 세균의 소독 뿐만아니라 최근에는 지아디아, 크립토스포리디움과 같은 병원성 원생동물의 불활성화에 대하여 많은 관심을 가져야 하며 적정한 소독능을 확보하기 위해서는 정수지의 도류벽 설치, 용량확장, 수위비조절 및 잔류염소 농도 조절 등의 운영 및 시설개선이 필요한 것으로 판단된다.
The effects of temperature, coagulants and pre-chlorination on the removal of turbidity and pathogenic protozoa by coagulation process were investigated using jar test of lab scale. In room temperature ($25^{\circ}C$), protozoa were removed over 1.0log at the proper concentration range of coagulants, and up to over 2log at the optimal concentration of coagulants. Considering the 1.5log target removal for Giardiain the processes of coagulation, sedimentation, and filtration, this results implies that the target could be satisfied. However, the removal of protozoa and turbidity was reduced, and optimal PAC concentration was narrowed in low turbidity and cold temperature ($5^{\circ}C$). These results suggest that the drop of coagulation efficiency may be occurred in winter if the conditions are not optimized. Despite the effect of water temperature, the relation of turbidity and protozoa removal appeared to be good. The various kinds of coagulants did not significantly affected for removals of turbidity and protozoa when the concentrations of $Al_2O_3$ were considered. Prechlorination did not increase or decrease the removal of turbidity and protozoa in optimum condition at room temperature, pH 7, 15mg/L of PAC concentration.
환경수 중 크립토스포리디움 및 지아디아 분석방법은 현재 어떤 방법도 만족할만한 민감도, 특이도, 재현성을 인정 받지 못하고 있어, 다양한 형태의 정도관리 및 수행도 평가가 요구되고 있다. 본 연구는 1623방법(USEPA :Method 1623)을 사용해 한강 지표수에 대한 크립토스포리디움 및 지아디아 접종시험과 현장시료 동시분석시험에 기초하여, 환경수 중 이들의 존재여부와 농도를 측정함에 있어 분석결과의 정확도 및 신뢰도, 그리고 회수율에 미치는 영향요인을 검토하였다. 1623방법에 의한 결과, 평균적으로 한강 지표수시료에 존재하는 크립토스포 리디움의 46%와 지아디아의 60%를 검출할 수 있는 것으로 나타났으나, 각각의 회수율 범위가 13-73% 및 28-84%로 변이가 매우 커서 실제 환경 중 두 원생동물의 농도를 결정하기 위해서는 반복측정 및 통계학적 인 접 근이 수반되어 야 할 것으로 나타났다. 또한 IMS (immunomagnetic separation)중 산첨가에 의한 해체·분리과정을 1 회 더 반복함으로써 지표수시료에서의 총회수율의 약 10%를 향상시킬 수 있었으며, flow cytometry로 계수·준비된 (오)시스트((oo)cysts)를 정도관리에 사용할 경우 보다 신뢰할만한 결과를 얻을 수 있었다. 형광항체 및 DAPI염색은 현장시료특성 이나 전 처리과정에 따라 동일하지 않은 형광특징을 보인 바, 접종 된 현장시료 정제액에 대한 염색결과도 참조되어야 하며, 환경시료에는 다양한 비특이물질이 함유되어 있어 DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole) 염색 및 DIC(Differential Interference Contrast)에 의한 내부구조 관찰이 최종 동정기준이 되어야할 것으로 나타났다.
한국산 닭으로부터 분리한 크립토스포리디움(Cryptosporidium)의 중형 오오시스트를 SPF 병아리에 경구투여하여 그 분변속에의 오오시스트의 크기 및 배출양상과 파브리시우스낭 조직에서 많이 발견되는 여러 발육기의 미세구조를 관찰하였다. 병아리에 있어서 prepateat period는 평균 5.9일간, patent period는 $12.87{\pm}3.4$일간, 오오시스트 배출 정점기는 접종후 $12{\pm}2.78$일째, 그리고 일반적으로 8일째부터 14일째까지 1주일간에 걸적 다수의 오오시스트가 분변으로 배출되었다. 이 원충의 거의 모든 발육기의 미세구조는 C. muris를 제외한 사람을 포함한 포유동물과 조류에서 이미 발견된 것들과 거의 비슷하지만 분변으로 배출되는 오오시스트의 크기는 Kinyoun 항산염색(변법)표본에서 $5.24{\pm}0.44{\times}4.86{\pm}0.37{\mu\textrm{m}}$, 오스윰산 증기고정 Giemsa 염색표본에서 $6.06{\pm}0.23{\times)4.86{\pm}0.34$\mu\textrm{m}$이었다. 이상의 연구결과를 기초로 하여 한국산 닭유래 크립토스포리디움을 C. baileyi라고 동정한다.
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[게시일 2004년 10월 1일]
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