무지개송어의 초대배양 간세포에 있어서 Vitellogenin (VTG)의 합성 유도는 전기영동적 수법에 의해 행하였다. 간세포는 7일 동안 phositively charged dish를 이용한 배양으로 단층 확산되었다. 배양 7일의 간세포 생존율은 $E_2$의 유무에 따라 각각 20.7% 및 23.6%가 감소하였으며, DNA함유량도 각각 13.7% 및 14.0%가 감소하였다. $E_2$ 첨가군과 대조군간에는 생존율과 DNA 함유량에 있어서는 유의한 차이가 나타나지 않았다. 그리고, 총 단백질에 대한 VTG의 비율은 $E_2$$10^{-6}$ M의 첨가시에 최대치를 나타내었다. 그러나, 고농도($10^{-5}$M)에서는 오히려 감소하는 경향을 나타내었다.
어류에서 바이러스성 질병이 중요하다는 인식이 증가하고 있으며 어류바이러스의 연구를 위한 세포주의 발달이 활성화되고 있다. 하지만상대적으로 해산유래의 세포 주 수는 많지 않다. 특히 유럽과 우리나라 남ㆍ서해안에서 고급어종인 감성돔은 림포 시스티스병, 이리도바이러스병 등의 바이러스성 질병이 발생하고 있다. 본 연구는 감성돔에서 유래한 세포주 개발을 목적으로 하였으며, 감성돔의 비장에서 유래한 세포를 초대배양 및 계대배양 하여 새로운 세포주를 확립하였으며, 일련의 실험을 실시하여 확립된 세포주의 특성을 확인하고 바이러스에 대한 감수성을 검사하였다. (중략)
우리나라 자생식물인 산호수 (Ardisia pusilla DC)를 기내에서 대량증식하기 위하여 초대배양으로 산호수 경정을 MS, 1/2MS 배지에 BA와 TDZ의 농도를 달리하여 첨가된 배지에 치상하여 배양하였다. 무기염류를 달리한 배지와 생장조절물질 농도를 다르게 한 배지 중 1/2MS 배지에 BA 0.5mL가 첨가된 배지가 신초 수 7개 이상으로 증식이 양호하여 산호수의 초대배양에 적정배지로 나타났다. TDZ를 첨가한 배지에서는 캘러스형성이 과다하여 부정아 형성을 오히려 방해하여 BA 첨가배지보다 신초증식이 양호하지 못하였다. 신초의 증식을 위해 1/2 MS 배지에 BA 0.5 mg와 sucrose의 농도를 달리하여 첨가한 결과, sucrose 농도 20 g/L를 첨가한 배지에서 신초의 증식, 생장 및 다아체 형성이 양호하였다. 형성된 신초의 발근은 1/2MS 배지에 IBA, NAA를 각각 첨가한 배지를 사용하였는데 두 가지 옥신류에서 0.5 mg의 농도에서 신초의 생장과 발근이 양호하였다. 잎과 뿌리가 잘 발달한 유식물체를 원예용 상토에 옮겨 키웠을 때 모든 개체가 정상적인 형태로 성장하였다.
국내에서 자생하고 있는 75균주의 고등균류를 액체배양하여 얻은 다당류를 $CCl_4$에 의해 독성이 유발된 초대배양 간세포에 가하여 간세포 독성에대한 다당류의 보호효과를 glutamic pyruvate transaminase(GPT)활성을 측정하여 검색한 결과는 다음과 같다. 75균주의 고등균류 중 간세포 보호효과를 나타낸 것은 60균주로 Ganoderma lucidum 15균주 중 13균주, Lentinus edodes 7균주 중 5균주, Pleurotus ostereatus 1균주, Coriolus versicolor 5군주 중 4균주, Lyophyllum spp. 2균주, Grifori frondosa 7균주, Agaicus spp. 3균주, Schizophyllum commune 16균주 중 14균주, Cordyceps spp. 18균주 중 11균주등이었다. 상기 고등균류 중 GPT활성이 80%이하로 나타나, 비교적 간세포 보호효과가 우수한 것은 Ganoderma lucidum IY003 및 IY009, Lentinus edodes IY103, Lyophyllum sp. IY402, Agaicus sp. IY701 및 IY703, Schizophyllum commune IY804, IY810 및 IY818, Cordyceps sp. IY902등 10균주였으며, 이들의 GPT활성은 각각 80.0%, 75.5%, 78.2%, 75.2% 73.6%, 75.0%, 75.1%, 77.7%, 77.5% 및 78.4%로 나타났다.
히아신스 Pink Pearl 품종의 인편배양에서 자구의 재생과 생장은 1.0 mg/l와 3.0 mg/l의 농도에서 IAA보다 IBA가 더 효과적이었으며, 절편체의 기부가 배지에 삽식되는 정상적인 치상 방향이 역방향의 치상 방법에 비해 자구의 재생과 뿌리의 생장에 더 효율적인 것으로 나타났다. 계대배양에서 재생된 자구와 뿌리의 생장은 한천배지보다 펄라이트가 첨가된 액체배지에서 증가되었다. 이와 같은 히아신스 Pink Pearl 품종의 기내배양의 경우 자구 재생을 위한 초대배양은 한천 고체배지를, 재생 된 자구의 생장은 펄라이트의 액체배지를 사용하는 2 단계의 교대배양 시스템이 더 유용함을 시사한다.
이온운반계는 생체의 각기 다른 세포의 성장을 조절하는 성장조절인자들의 효과를 매개하는데 깊은 관련이 있는 것으로 보고되고 있다. 신장 근위세뇨관에서 솔변 연 $Na^+/H^+$ 상호운반계는 사구체에서 여과된 나트륨의 재흡수와 수소이온의 분비를 조절하는 중요한 기능을 수행한다. 이 연구는 초대배양된 신장 근위세뇨관세포의 나트륨 운반을 Insulin-like Growth Factor-I(IGF-I)이 어떤 경로를 통하여 조절하는지를 알아보고자 실시하였다. 결과는 아래와 같다. 1. 초대배양된 신장 근위세뇨관세포에서 $Na^+$ uptake는 시간의존적으로 증가되었으며, 30분동안 $Na^+$ uptake를 실시한 결과 세포외 NaCl 농도의존적으로 $Na^+$ uptake를 유의성있게 감소시켰다(대조군; $40.11{\pm}1.76$, 140mM군; $17.82{\pm}0.94pmole\;Na^+/mg\;protein/min$). 2. $Na^+$ uptake는 iodoacetic acid(IAA, $1{\times}10^{-4}M$) 또는 valinomycin($5{\times}10^{-6}M$)처리시 대조군에 비해 각각 $50.51{\pm}4.4%$와 $57.65{\pm}2.27%$ 억제되었으며, ouabain($5{\times}10^{-5}M$)을 처리한 경우는 $140.23{\pm}3.37%$ 증가되었다. IGF-I($1{\times}10^{-5}M$)으로 배양한 세포를 actinomycin D($1{\times}10^{-7}M$)와 cycloheximide($4{\times}10^{-5}M$)로 처리시 $Na^+$ uptake는 대조군에 비해 각각 $90.21{\pm}2.39%$와 $89.64{\pm}3.69%$로 감소되었다. 3. IGF-I으로 배양한 세포에서 세포외 cAMP는 농도의존적($10^{-8}-10^{-4}M$)으로 $Na^+$ uptake를 유의성있게 감소시켰고, 3-isobutyl-1-methyl-xanthine(IBMX, $5{\times}10^{-5}M$)도 억제시켰다. Pertussis toxin(PTX, 50pg/ml)이나 cholera toxin(CTX, $1{\mu}g/ml$)의 처리시에도 $Na^+$ uptake는 억제되었다. 세포외 phorbol 12-myristate 13 acetate(PMA) 또한 농도의존적(1-100ng/ml)으로 $Na^+$ uptake를 감소시켰다. 그러나 staurosporine($1{\times}10^{-7}M$)은 $Na^+$ uptake에 영향을 미치지 않았으며 PMA와 stauiosporine을 동시에 처리했을 때도 $Na^+$ uptake는 억제되지 않았다. 결론적으로 초대배양된 토끼 신장 근위세뇨관세포에서 $Na^+$ uptake는 막전위와 세포내 에너지 의존적이며 IGF-I은 부분적으로 단백질 및 RNA 합성을 통해서 그리고 세포내 cAMP나 PKC 경로를 통해서 $Na^+$ uptake를 조절하는 것으로 생각된다.
본 연구에서는 비타민 C의 배양세포 증식을 촉진하는 기능을 세포 간 결합조직의 주성분인 콜라겐 생합성에 초점을 맞추어 3T6 세포주 및 흰쥐에서 분리한 초대 연골세포를 이용하여, 세포 및 세포 외액 중의 콜라겐 함량의 분석과 콜라겐 생합성에 미치는 비타민 C의 영향을 각 농도별로 분석하여 콜라겐 생합성에 필요한 비타민 C의 적합한 첨가 농도를 검토하였다. 비타민 C를 1.0 mM 농도가 되도록 첨가하여 3T6 섬유아세포 및 초대연골 세포를 배양하였을때 양 세포 모두 콜라겐 양은 비타민 C를 첨가한 세포가 높은 수치를 나타내어 비타민 C에 의한 콜라겐 합성의 촉진효과가 현저하였으며 일수의 증가에 따라 그 합성량도 증가하였다. 비타민 C 무첨가의 경우 세포층의 콜라겐 합성량을 3T6 섬유아세포와 연골세포를 비교하였을 때 3T6 섬유아세포의 경우 배양일수의 경과와 더불어 콜라겐 양이 증가하였으나 연골세포의 경우 1일째부터 21일째까지 콜라겐양은 거의 변화하지 않아, 본 실험에 사용한 연골세포는 초대 배양세포로서 세포외로부터 비타민 C의 공급이 되지 않을 경우콜라겐 합성은 일어나지 않는 것으로 사료된다. 따라서 배양세포의 콜라겐 합성에 미치는 비타민 C의 영향을 검토하기 위하여 초대연골세포를 이용하여 비타민 C의 농도를 변화시켜 가면서 콜라겐 합성량을 측정하였다. 5 mM, 7 mM, 10 mM의 고농도의 비타민 C를 첨가한 경우 저 농도의 비타민 C 첨가 경우보다 plate 내의 총 콜라겐 함량은 적었다. 그러나 DNA 양에 대한콜라겐 함량을 비교하였을 때 5mM 이상의 비타민 C 첨가에서는 콜라겐 합성 증가량이 조금 낮은 경향을 보였으나, $0.1\~2mM$을 첨가하였을 때의 콜라겐 양과 최종적으로는 거의 비슷한 수치를 나타내었다. 0.5 mM 이상의 비타민 C 첨가는 콜라겐 합성을 저해한다는 기존의 보고와는 달리 본 연구에서는 세포독성을 억제할 목적으로 배지 중에 catalase 첨가하였으며, 그 결과 $0.1\~10mM$의 비타민 C 농도범위에서는 콜라겐 합성량에 차이가 크게 없는 것으로 나타나, $0.1\~10mM$의 비타민 C 농도로는 catalase를 첨가한 배지를 사용할 경우 세포내의 콜라겐 양에 대한 비타민 C 첨가농도별 차이는 크게 없는 것으로 추측된다.
플라스틱의 원재료로 이용되는 bisphenol-A (BPA)가 vitellogenin (VTG)의 합성에 미치는 영향을 넙치의 간세포를 초대 배양하여 조사하였다. 간세포는 2일간 사전 배양을 하였으며, estradiol-$17\beta(E_2)$ 및 BPA를 배양액에 동시 첨가하였다. 간세포는 6일간 배양한 후 배양액을 회수하여 SDS-PAGE로 분석하였다. BPA는 농도 의존적으로 총 단백질에 대한 VTG 비율은 증가하였으며, $10^{-6}M$과 $10^{-5}M$의 농도에서 유의한 차이를 나타내었다(P<0.05). 특히, BPA $10^{-5}M$의 농도에서의 총 단백질에 대한 VTG 비율은 26.36%로 $E_2$만을 첨가한 대조군과 유의한 차이를 나타내지 않았다. $E_2$와 BPA를 단독 또는 동시에 첨가하여 유도된 VTG합성은 배양액에 tamoxifen$(10^{-6}M)$을 첨가함으로서 $E_2$를 첨가한 대조군의 약 80%로 유의하게 억제되었다. 그리고, in vivo에서 $E_2$에 의해 유도된 VTG합성은 in vitro에서 간세포를 6일간 배양함에 따라 $E_2$를 첨가한 대조군의 약 22%까지 억제되었다. 이러한 감소효과는 BPA의 농도 의존적으로 지연되는 결과를 나타내었다. 따라서 넙치에서의 BPA는 $E_2$ receptor와의 반응을 통한 에스트로겐 작용에 의해 VTG합성을 유도하고, 난황형성기에서의 VTG 합성을 장시간 지속시킬 가능성이 있는 것으로 추측된다.
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[게시일 2004년 10월 1일]
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