• Proceedings of the KSAR Conference
• /
• 2002.06a
• /
• pp.43-43
• /
• 2002

체세포 핵이식에 의한 산자가 양, 소, 염소, 쥐 및 최근에 돼지에서 보고되었지만, 생산된 배반포의 동결보존에 관한 연구결과는 보고되지 않고 있다. 따라서, 본 연구는 체세포 핵이식란의 활용과 산업화 촉진을 위해서 체세포 핵이식 유래 배반포의 동결성 향상에 배양조건이 미치는 영향을 조사하고자 실시하였다. 공여세포는 60일령의 태아세포를 10% FBS 가 첨가된 DMEM 에서 39℃, 5% CO₂의 incubator에서 배양하여 monolayer confluent 형성을 유도한 후 0.25%trypsin 처리하였다. (중략)

• Proceedings of the Korean Society of Embryo Transfer Conference
• /
• 2002.11a
• /
• pp.77-77
• /
• 2002

본 연구는 체세포 및 체세포 핵이식란의 염색체 이상에 체세포의 계대의 영향성을 조사하고자 하였다. 한우 성축의 귀 조직으로 얻어진 세포를 공여세포를 체외성숙 후 제핵된 난자에 핵이식을 실시하였으며, 1.9kv/cm, 20$\mu\textrm{s}$/2times의 전기자극으로 융합후 5$\mu\textrm{g}$/ml의 ionomycin에서 4min, 1.9mM 6-DMAP에서 4h동안 배양함으로써 활성화를 유도하였다. 핵이식란은 CRlaa에서 4일간 배양 후 8 -cell단계에서 중기상의 유도를 위하여 상기 배양액 1ml당 0.05$\mu\textrm{g}$ colcemid에서 6-8시간 더 배양하였다. 이후, 6% Fetal bovine serum이 함유된 1% sodium citrate용액에 20분간 저장처리 후, methanol 5 : aceticacid 1 : distilled water 4로 1차, methanol 3: aceticacid 1 로 조성된 2차, methanol 4 : acetic acid 3 : distilled water 1의 3차고정액으로 1분간 재 침지시켰다. 고정 처리가 완료된 slide는 4% Giemsa용액으로 염색한 후 광학현미경 하에서 핵형 양상을 검경하였다. 체세포의 5계대에서는 684개의 spreads를 검경한 결과 염색체 수는 72%가 정상으로 60개이었고, 24%가 60개 이하였으며 4%가 60개 이상을 보였다. 10계대도 5계대와 비슷하여 71%가 정상, 26%가 60개 이하, 3%가 60개 이상이었고, 15계대에서는 55%가 정상이었고, 30%가 60개이하, 15%가 60개 이상을 보였다. 10계대 까지는 mixoploid의 비율의 변화가 없었으나 15계대에서 현저하게 늘어남을 볼 수 있었다. 또한 체외수정란과 핵이식란의 비교에서는 체외수정란은 250개의 spreads를 검경한 결과 염색체 수는 95.6%가 정상으로 60개이었고, 2.0%가 60개 이하, 2.4%가 60개 이상이었으나, 핵이식란은 204개를 검경하여 88%가 정상이었고, 4.9%가 60개이하, 7.1%가 60개 이상을 보임으로써, 핵이식란이 체외수정란에 비하여 염색체 이상의 비율이 높았다. 따라서 계대에 따라 체세포의 염색체이상의 비율이 상대적으로 증가하고, 체세포 핵이식에 따른 염색체 이상이 생길 수 있음을 알 수 있었다. (이 논문은 농림부 연구비에 의해 수행되었음)

• Proceedings of the KSAR Conference
• /
• 2002.06a
• /
• pp.38-38
• /
• 2002

돼지 체세포 핵이식에 있어서 체외발달률을 재고하기 위하여 공여세포의 종류, 활성화 방법, 배양조건 등이 체외발달에 미치는 영향을 검토하였다. 도축장에서 채취한 난소에서 미성숙난자를 채취하여 NCSU-37 배양액에 10% pFF 와 0.6mM Cystein, 1mM dbcAMP, 0.1 IU/㎖ human menopausal gonadotrophin(hMG)에서 20시간 배양후 dbcAMP 와 hMG 가 없는 배양액에서 18-24 시간 추가배양 성숙 후 성숙된 난자를 핵이식의 수핵난자로 사용하였다. (중략)

• Proceedings of the Korean Society of Developmental Biology Conference
• /
• 2003.10a
• /
• pp.135-135
• /
• 2003

본 연구는 체세포 핵이식 복제 수정란의 이식에 의한 고능력 한우를 다량 증식하기 위한 방안을 확립하기 위하여 수행되었다. 본 실험에 공여된 체세포는 육질과 육량 등급이 국내에서 100위 이내의 암소 귀세포를 채취하여 동결 및 계대배양하여 사용하였다. 한편, 핵이식 수정란의 준비를 위하여 도축장에서 채취한 난소에서 난자를 회수하여 22시간 성숙배양 후 난구세포를 제거하고 극체가 존재하는 난자만을 선별하여 recipient cytoplasm으로 이용하였다. 난자의 제핵, 체세포 핵이식, 전기융합 및 활성화 처리는 본 실험실의 방법에 준하여 실시하였으며, 핵이식란은 CR1aa 배양액 내에서 5% $CO_2$, 95% Air 및 39$^{\circ}C$의 기상조건하에서 7일간 배양 후 이식에 이용되었다. 한편, 수란축은 2회 이상 정상 발정주기가 확인된 경산우와 미경산우에 25mg의 PG $F_{2}$$\alpha$/를 투여하여 발정을 유기하거나 자연발정우를 선발하여 수란축으로 이용하였다. 그 결과, 배반포기배를 이식한 경우 14두중 5두에서 임신이 확인되었으며 그중 4두에서 유산되었고, 1두는 임신 6개월령으로 정상 발육되고 있는 것이 확인되었지만 상실배기단계에서 이식된 경우는 임신이 되지 않았다. (중략)

• Proceedings of the KSAR Conference
• /
• 2002.06a
• /
• pp.35-35
• /
• 2002

본 연구는 핵이식 기법을 이용하여 고능력 한우의 대량 생산기술을 개발하기 위하여 수행하였다. Donor cell 은 축산기술연구소 남원지소에서 사육, 검정하고 있는 축군에서 육량 육질 국내 100위 이내의 암소에서 귀세포를 채취하여 동결 및 계대배양하여 사용하였다. 도축장에서 채취한 난소에서 난자를 채취하여 22시간 성숙 배양한 후 난구세포를 제거하고, 극체가 존재하는 난자를 선별하여 recipient cytoplasm으로 사용하였다. (중략)

• Proceedings of the KSAR Conference
• /
• 2004.06a
• /
• pp.202-202
• /
• 2004

고양이 체세포 복제산자의 생산은 Shin등(2002, Nature 415: 859) 1마리의 "Cc"를 성공한 이래 재현 생산한 보도가 없다. 그리하여 본 실험에서는 체세포 복제산자 생산을 위한 기초 실험으로서 난자의 체외성숙, 체세포핵이식 수정란의 체외발달율을 검토하고자 수행하였다. 성성숙한 고양이에서 난소적출수술로 난소를 적출 한 후 4시간 내에 실험실로 운반하여 면도칼로 난소를 절재한 후 미성숙난자를 채취하여 TCM199 + 0.4% BSA + 1000 IU/ml bST에서 24시간 체외성숙하였다. 체외성숙한 난자는 난구세포를 제거 후 핵이식에 공시하였다. (중략)

• Proceedings of the KSAR Conference
• /
• 2004.06a
• /
• pp.253-253
• /
• 2004

본 연구는 소를 이용한 체세포 핵이식에 있어서 탈핵전 demecolcine 처리 및 난자의 세포주기가 재구축배의 생산 및 발육에 미치는 영향을 검토하기 위하여 실시하였다. 도축장에서 회수한 난소로부터 채취한 미성숙란을 각 실험에 따라 성숙배양한 후 실험에 이용하였다. 난구세포 제거 후 일부 난자를 0.4 ㎍/㎖의 demecolcine이 함유된 배양액으로 40분간 처리하여 핵이식에 이용하였으며, 극체 미방출란 및 MI기 난자에 demecolcine을 처리하여 미성숙난자의 핵이식 이용 가능성을 검토하였다. (중략)

• Proceedings of the Korean Society of Embryo Transfer Conference
• /
• 2004.10a
• /
• pp.87-87
• /
• 2004

• Journal of Embryo Transfer
• /
• v.21 no.2
• /
• pp.85-93
• /
• 2006

본 연구는 소 형질 전환 체세포 핵이식에서 용이한 탈핵을 위해 demecolcine을 이용할 시 탈핵율과 핵이식란의 발육능을 높이기 위한 최적의 조건을 알아보고자 실시되었다. 도축장 유래 미성숙 난자를 18시간 체외성숙 후 제1극체가 확인된 성숙 난자를 0.1, 0.2, 0.4 및 0.8 ug/ml의 demecolcine이 첨가된 배지에서 1시간 더 처리한 다음 세포막이 돌출되어 있는 난자를 체세포 핵이식에 공여하여 각 군간 배반포로의 발육능을 비교하였다. Demecolcine 처리 후 핵이 포함된 셰포막의 protrusion rates를 각 군간 비교한 결과 0.2, 0.4 및 0.8 ug/ml 군에서 0.1 ug/ml 군보다 유의적으로 높았으며 (82.8, 86.2, 90.4 vs. 70.1%), conventional blind 방법과 비교한 결과 demecolcine를 이용한 군에서 유의적으로 높은 탈핵율을 보였다(75.3 vs. 96.2%; p<0.05). 체세포 핵이식란의 발육능 비교에서는 0.1 및 0.2ug/ml 군에서 대조군과 함께 유의적으로 높은 분할율 및 배반포로의 발육능을 보였다(p<0.05). 결론적으로 소 형질전환 체세포 핵이식을 위한 탈핵시 높은 탈핵율과 배반포로의 발육율을 얻을 수 있는 demecolcine의 적정농도는 0.2ug/ml이라고 사료된다.

• Proceedings of the KSAR Conference
• /
• 2001.03a
• /
• pp.67-67
• /
• 2001

전기자극은 핵이식 시 수핵난자와 공여핵의 융합을 위해 보편적으로 사용되는 방법이다(Robl, 1999). 그러나 부적절한 전기자극은 수핵난자 세포질에 해를 입히고, 이후의 배발달에 좋지 않은 영향을 준다. 본 실험은 체세포 핵이식을 \circled1 1.9㎸/cm, 20$\mu\textrm{s}$ 2회, \circled22.0㎸/cm, 20$\mu\textrm{s}$ 2회, \circled32.2㎸/cm, 10$\mu\textrm{s}$ 2회, 및 \circled41.9㎸/cm, 30$\mu\textrm{s}$ 2회의 전기자극으로 융합을 실시하여 각 자극 별 융합율과 난자의 lysis율을 비교하고, 배양 후 배반포 발생율을 조사하였다. 공여핵은 칡소의 귀 세포를 10% FBS가 첨가된 DMEM에서 39$^{\circ}C$, 5%$CO_2$의 incubator에서 배양하여 monolayer confluent형성 후 0.5% FBS가 첨가된 DMEM에서 3-4일간 배양 후 trypsin처리하여 제핵된 체외성숙 난자에 핵이식하였다. \circled1,\circled2,\circled3,\circled4의 핵이식 조건을 이용하여 공여핵의 체세포와 수핵란 세포질간의 융합을 유도한 결과, 융합율은 각각 50.7%, 48.1%, 65.5%, 및 33.3%였으며, 수핵난자의 세포질 lysis율은 39.%1, 41.7%, 22.6%,및 52.7%으로 \circled32.2㎸/cm, 10$\mu\textrm{s}$ 2회의 조건에서 융합율이 유의적으로 높았고, 수핵난자의 세포질 lysis율에 있어서도 다른 군에 비하여 낮았다 각각의 핵이식 조건별로 융합한 후 난할율 및 배반포 발생율은 각각 65.7%, 73.5%, 77.2%, 및 53.3%과 47.8%, 52.0%, 49.7%, 및 21.8%로 나타나 난할율 및 배반포 발생율에 있어서 융합조건에 따라 큰 차이는 없었으나 1.9㎸/cm, 30$\mu\textrm{s}$ 2회의 조건이 다른 조건들에 비하여 유의적으로 낮았다. 따라서, 체세포와 수핵란 세포질간의 융합율과 배반포 발생에 미치는 영향은 전압보다는 시간에 더 크게 받음을 알 수 있었으며, 이와 같은 결과에서 융합시 시간을 오래 주는 것보다 전압을 높이는 것이 수핵난자의 세포질에 상해를 줄이고 이후 배반포 발생에 유리할 것으로 사료되었다.