본 실험은 질소 및 탄소원이 Cercospora kikuchii 균사생장에 미치는 영향과 여러 배양조건에서 생장한 C. kikuchii가 세균생장을 저지하는 정도를 알아보았다. C. kikuchii 균사생장에 적합한 질소원은 yeastextract였고, 탄소원으로는 sucrose, glucose, maltose, fructose를 첨가하였을 때 균사생장이 좋았다. C. kikuchii의 세균생장저지 실험에서 wild type은 pH 조건은 5.0에서, 질소원으로는 yeast-extract 또는 peptone.을 첨가하였을 때, 탄소원으로는 sucrose, maltose, glucose, fructose를 첨가한 배지에서 생장하였을 때 Erwinia carotovora와 Pseudomonas solanacearum의 생장을 크게 저지시켰다. 그러나 albino 돌연변이균주는 실허된 세균의 생장을 거의 저지시키지 못하였다.
농촌진흥청, 사천성, 산동성의 곰보버섯 균주의 최적 배양조건을 찾기 위해 배지, 탄소원, 질소원을 변화시켜 살펴본 결과는 다음과 같다. 배지에서 RDA와 SCP는 YSB 배지에서 각각 0.250 및 0.350 g을 보였으며, SDP는 Czpek 배지 0.294 g의 최대 생산량을 보였으며, 탄소원에서 RDA은 최대 균사체 성장이 maltose에 의해 0.272 g, SCP의 경우는 fluctose에 의해 0.420 g, SDP는 mannitol에 의해 0.385 g의 생산량을 보였다. 질소원에서 RDA은 최대 균사체 성장이 Yeast extract와 $NH_4Cl$에 의해 0.325 g, SCP의 경우에는 Yeast extract에 의해 0.412 g, SDP의 경우에는 Asparagine, $NH_4Cl$에 의해 0.435 g의 생산량을 보였다. 또한 최적 온도는 $25^{\circ}C$였으며, PH는 5.5 - 6.5 사이로 나타났다. 버섯 및 질소원에 따라 $NH_4Cl$을 추가했을 때 성장된 균사체의 양은 다르게 나타나 이에 대한 연구는 추가적으로 진행되어야 할 것으로 사료된다.
복령(茯笭)은 약 3500년전부터 한방에서 수종, 임질, 설사, 신경안정 등의 치료제로 사용되었으며 최근에는 항암효과가 밝혀짐에 따라서 그 수요가 증가하고 있으나, 국내에서는 복령의 인공재배방법이 개발되지 못하여 수요를 자연량에 의존하고 있다. 따라서 본 연구는 복령을 인위적으로 재배하기 위하여 국내에서 채집한 복령의 형태적 특성 및 분리균주의 배양학적 특성 특히 영양원과 균사생장과의 관계를 실험하였다. 1. 형태적 특성 : 야생복령의 형태는 구형 또는 고구마형이며, 외피는 흑색으로 주름이 있고 내부는 옅은 오랜지색이며 중심에 진한 오랜지색의 심이 있는 분말상태로 직경은 $10{\sim}30cm$, 개체 중량은 $300{\sim}600\;g$ 정도이다. 분리배양한 균주의 균사 폭은 $4{\sim}8\;{\mu}$ 정도이며 톱밥배지에서 형성된 자실체는 벌집모양과 비슷하며 구멍은 다각형으로 직경은 $0.5{\sim}1mm$, 깊이 $2{\sim}3mm$ 정도이다. 2. 배양학적 특성 : 복령의 생육에 적합한 탄소원으로서는 가용성전분, glucose 및 sucrose 등이며, galactose, lactose는 부적합하였고, 탄소원농도가 1.5%에서 2.5%로 증가해도 균사발육에는 거의 영향이 없었다. 질소원으로는 무기질소원보다 유기질소원이 생육에 양호하였고 유기질소 중에서도 yeast extract, malt extract가 가장 적합하였으며, 질소함량이 0.05%에서 0.1%로 증가함에 따라서 균사생육도 왕성하였다. 한편 탄소원과 질소원의 최적 농도비는 탄소원농도 $7.5{\sim}10%$, 질소원농도 $0.10{\sim}0.15%$ 즉 100배 영역이었다. 나무추출액배지에서의 복령균사 생육은 밤나무추출액배지에서 가장 양호하였으며 소나무수피추출액배지와 오리나무추출액배지에서 비슷한 균사생육을 보인 반면 참나무추출액배지에서는 균사발육이 매우 저조하였다. 한편 C/N율을 적용하여 탄소원과 질소원을 첨가하여 조제한 배지에서의 균사생육은 영양원 무처리 배지에 비하여 균사생육이 매우 우수하였다.
생물 반응기를 이용한 현삼 종묘의 생산에 있어 적정 탄소원과 질소원의 종류 및 농도와 , 생물 반응기 형태에 대한실험의 결과는 다음과 같다. 탄소원으로서 과당을 사용하였을 때 자당 사용의 경우보다 다신초의 형성은 좋았으나, 비정상적인 개체가 많아 종묘 생산용으로는 부적합하였다. 질소원으로 질산태 질소의 효과적 이었으며, 암모니아태 질소 413 mg/L 에 절산태 질소 1,900 mg/L 로 조합하는 것이 신초형성에 가장 적합하였는데, 500 ml 플라스크 배양에서 전 질소 함량은 3 주째 까지는 83% 에서 75% 로 완만하게 감소하다 이후 46% 로 급격히 감소하였다. 이러한 현상은 신초가 급속히 증가하는 시기와 일치하였고 생물 반응기에서는 일정한 속도로 감소되었으며, 배양 종료시인 6주 째에는 500ml 플라스크에서나 생물 반응기 배양액 내의 질소함량은 거의 남아 있지 않았다. 생물반응기의 배지내 자당은 2주째에 완전히 고갈되었으며 500ml 플라스크 배양에서 자당은 3주째에 완전히 고갈되었고, 자당에서 전환된 과당과 포도당은 절편체의 생체중이 급격히 증가되는 4주와 5 주 사이에 감소되었다. 현삼의 배양에 적합한 생물 반응기 형태는 inner loop 가없는 air lift형 sphere type이었다.
본 연구에서는 탄소원 및 질소원의 이용 패턴과 mycophenolic acid의 생성 패턴을 확인하기 위하여 먼저 5 L 발효조에서 mycophenolic acid 발효의 경시적 변화를 조사하였다. 그 다음에는 여러 가지 탄소원들이 세포 생장과 mycophenolic acid 생산에 미치는 효과를 조사하였다. 과당이 mycophenolic acid 발효에 가장 좋은 탄소원이었지만, 값이 고가인 단점이 있어서, 과당을 지니고 있는 설탕이 주성분인 당밀을 탄소원으로 사용한 결과 mycophenolic acid의 산업적 생산에 가장 좋은 것으로 확인되었다. 당밀을 첨가한 실험구는 포도당을 탄소원으로 사용한 대조구에 비하여 발효 생산성이 2배 이상 증가하였다. 양호한 세포 생장과 높은 mycophenolic acid 생산을 얻기 위하여 다양한 무기질소원과 유기질소원에 대한 실험을 실시하였다. 무기질소원들 가운데 요소는 암모늄 형태의 질소원을 천천히 공급함으로써 생장과 mycophenolic acid 생산을 저해하는 배양액의 급격한 pH 하락을 일으키지 않았다. 요소를 첨가한 실험구는 질산암모늄을 첨가한 대조구보다 발효 생산성이 3.6배 증가하였다. 카제인, 펩톤, casamino acid 같은 우유 단백질 유래 유기질소원들은 대조구에 비하여 mycophenolic acid 발효 생산성을 최고 3.4배까지 증진시켰다. 카제인의 가수분해물인 펩톤과 casamino acid는 mycophenolic acid 발효 생산성뿐만 아니라 세포 생장도 촉진하였다.
탄소원과 질소원, 배지의 초기 pH 및 C/N비가 Mucor sp. KCTC 8405P의 감마 리놀렌산 생산에 미치는 영향을 조사하였다. 탄소원으로는 포도당이, 질소원으로는 황산 암모늄같은 무기 질소원과 요소, 펩톤같은 유기질소원이 균체 유지함량 및 감마 리놀렌산 수율 측면에서 양호한 것으로 판명되었다. 사용하는 질소원은 일정농도 이하로 제한할 필요가 있으며 포도당과 황산 암모늄을 사용할 경우 최적 C/N비는 약 56.6으로 조사되었다. 균체 유지함량을 증가시키기 위한 배지의 초기 pH는 8 또는 9가 유리한 것으로 나타났으며, 포도당과 sodium acetate를 혼합하여 탄소원으로 사용하는 것이 바람직한 것으로 조사되었다. 3% 포도당과 2% sodium acetate 를 탄소원으로, 0.1% 황산암모늄을 질소원으로 포함하는 배지를 사용하여 플라스크 교반배양을 실시한 결과 배지 100$m\ell$ 당 약 315mg의 균체유지량을 얻었고, 이중 감마 리놀렌산 함량은 약 13-14%로 조사되었다.
우리나라 하수의 특성이 유기물 농도가 질소 농도에 비하여 매우 낮기 때문에 외국의 종속영양 탈질 공법을 그대로 적용하기가 힘들며 적용한다 할지라도 외부탄소원을 넣어야 하므로 경제적인 처리는 불가능하다. 산업폐수의 경우에 있어서도 유기물농도가 질소농도에 비하여 낮은 폐수의 경우는 값비싼 외부탄소원을 넣어주어야 한다. 따라서 폐수 특성에 맞는 효율적이고 경제적인 질소화합물 제거 기술의 개발은 불가피하다. 따라서 종속영양탈질공정의 경제성 문제 및 기존의 황탈
한국해양연구소에서 분양받은 유류분해효모 Yarrowia lipolytica CL180를 이용하여 경유로 오염된 토양에 대한 질소원, 인원 aeration rate, 그리고 균체량에 따른 영향을 조사하였다. 실험결과 질소원이 미생물 성장의 limiting factor로 작용하였으며, 다양한 비(C : N =100 : 5, 100 : 10, 100 : 15, 100 : 20 mg/kg soil)의 질소원을 첨가한 결과 C : N의 비(w/w)가 100 : 5일 때 가장 우수한 분해율과 균체수를 나타내었다. 질소원이 이 비율 이상으로 첨가되었을 때 분해율과 균체수가 낮게 나타났으며 이는 암모니아의 독성으로 인한 영향으로 사료된다. 그러나 인원과 통기에 따른 경유분해율의 변화는 없었으며 질소원이 첨가된 soil column에서는 7일이 경과된 후 약 50%의 경유잔류량을 나타내었다. 잔류경유를 제거하기 위하여 최초 접종량과 동일한 양의 균주를 접종하였으나 일정기간의 경과후에도 경유잔류량은 거의 변화가 없었다. 이는 경유의 토양 흡착 때문으로 사료된다.
무리우산버섯(Kuehneromyces mutabilis)의 온도별 균사생장을 조사한 결과, 균사생장온도는 4~32$^{\circ}C$였으며, 최적 균사생장 온도는 $25^{\circ}C$였고, $25^{\circ}C$~32$^{\circ}C$에서도 비교적 균사생장이 양호하였다. pH별 균사생장도를 조사한 결과는 pH가 4.0, 5.0, 6.0, 7.0, 8.0으로 조절된 YMPG(Yeast Malt Peptone Glucose) 배지에서 균사생장을 조사한 결과 최적 pH는 5.0이 었고, 6.0, 7.0 순으로 균사생장이 양호하였던 반면, 8.0에서는 균사생장이 극히 불량하였다. 아위버섯의 균사생장을 위한 최적 배지조성은 7종의 탄소원을 각각 1%(w/w)농도로 첨가하여 배지를 조제하여 균사생장도를 조사한 결과 glucose, mannose 첨가구에서 균사생장이 가장 양호하였고, frctose, trehalose, starch, dextrin, lactose 순으로 균사생장이 비교적 양호하였던 반면, 다른 탄소원에서는 불량하였다. 질소원별 균사 생장량을 조사한 결과 6종의 질소원을 각각 1% (w/v)농도로 첨가하여 배지를 조제하여 균사생장도를 조사질소원별 균사생장량을 조사한 결과 yeast extract와 peptone 첨가구에서 균사생장량이 매우 양호하였다. 위의 내용을 종합해보면 무리우산버섯의 최적온도는 25~32$^{\circ}C$, 최적 pH는 5.0~6.0으로 나타났다. 또한 적정 영양원은 기본배지로 선발된 YMPG에 탄소원은 mannose, glucose, 질소원은 yeast extract와 peptone에서 가장 양호하였다.
본 연구에서는 C. bombiocola에서 생성되는 미생물 계면활성제인 Sophorolipid의 생산관여인자 중, 질소원의 종류에 따른 영향과 C/N비율에 따른 생성량의 변화를 관찰하였다. 유기질소원이 비교적 놓은 생성량을 보였으며 그 중 pepton의 경우가 80g/L에 해당하는 높은 생성량을 보였다. C/N의 비율의 변화에 의한 Sophorolipid의 생성량의 변화 양상이 질소원의 종류에 따라 각기 다르게 나타났다. 또한 탄소원의 50%을 배양 이틀후 공급하는 방법으로 Sophorolipid가 약 30% 증가됨을 알 수 있다.
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[게시일 2004년 10월 1일]
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