라벤다의 기내배양을 통한 대량증식의 가능성을 알아보기 위하여 식물체 부위별 절편, 생장 조절물질 및 배지가 캘러스 유지 및 유식물체의 분화에 미치는 영향과 기내증식 개체의 변이에 대해 조사하였다. 캘러스 유도는 잎 절편을 이용한 2, 4-D 1 mg/l 와 NAA 2 mg/l 의 단독 또는 BAP 0.05 mg/l 와의 조합 처리 조건에서 양호하였다. 신초의 분화에는 경정을 이용한 BAP $2{\sim}4\;mg/l$ 단독 또는 BAP 4 mg/l +NAA 0.2 mg/l 조합 처리가 가장 양호하였다. $B_{5}$ 배지에 BAP 0.5 mg/l 와 NAA 0.01 mg/l 가 조합 첨가되었을 때 신초의 증식이 9.1배로 높게 나타났다. 분화된 신초의 뿌리 형성은 NAA $0.1{\sim}1\;mg/l$ 와 IAA 1 mg/l 에서 양호하였다. 기내에서 증식된 유식물체는 peatmoss:vermiculite:perlitc (1:1:1, v/v/v) 혼합 상토에서 90% 이상의 높은 활착율과 양호한 생육을 보였다. 재분화 식물체의 RAPD 분석 결과 primer OPA14에서 하나의 변이 band가 나타났다.
1. 목적 Prostaglandin은 치주질환과 관련된 국소적 골 대사에 중요한 역할을 한다. ${\Delta}^{12}PGJ_2$는 생체 내에서 혈장의 존재 하에 형성되는 천연 $PGD_2$ 대사산물이며 peroxisome- proliferator에 의해 활성화되는 감마 수용체 (PPAR ${\Gamma}$)에 대해 높은 친화성을 갖는 리간드로서 핵 수용체군에 속하는 전사조절인자이다. 이 연구의 목적은 골화 과정에서 ${\Delta}^{12}PGJ_2$의 역할을 규명하기 위해, 조골세포주의 증식과 분화에 미치는 영향과 그에 관련된 세포기전을 조사하는 데에 있다. 2. 방법 인간 골육종세포주인 Saos-2 (ATCC.HTB 85)와 쥐의 조골세포주 (MC3T3-E1)를 배양한 후 실험군에 농도가 각각 $10^{-5}$, $10^{-6}$, $10^{-7}$, $10^{-8}$, $10^{-9}$ 몰인 ${\Delta}^{12}PGJ_2$와 ciglitazone (합성 PPAR 감마 길항체)를 첨가하였다. 조골세포에서 PPAR 감마의 발현을 관찰하기 위해 역전사효소-중합효소연쇄반응(RT-PCR)을 특정한 primer를 이용하여 시행하였다. 세포 증식은 1일, 2일, 3 일째에 MIT 분석법으로 측정하였고, 2 일째에 알칼리성 인산효소 (ALPase) 생산을 측정하였다. 위의 결과에서 얻은 적정한 농도에서 다양한 조골세포 분화의 표지자들-제 1 형 교원질, 알칼리성 인산효소, osteopontin 및 bone sialoprotein-에 대한 간이 정량적 역전사효소-중합효소연쇄반응 (semiquantitative RT-PCR)을 실시하였으며 골결절 형성에 대한 효과를 알아보고자 석회화 분석도 시행하였다. 3. 결과 ${\Delta}^{12}PGJ_2$와 ciglitazone 모두 Saos-2 세포주의 증식을 촉진시켰다 .$10^{-8}$ 몰의 ${\Delta}^{12}PGJ_2$와 $10^{-6}$몰의 ciglitazone을 첨가한 실험군을 대조군과 비교했을 때, 시간에 비례하여 세포 증식률이 증가되었다. 알칼리성 인산효소의 활성화 검사에서도 증식률에서와 유사한 결과를 보여주었다. 간이 정량적 RT-PCR에서는 ${\Delta}^{12}PGJ_2$로 처리한 군의 경우 제 1 형 교원질, 알칼리성 인산효소, osteopontin, 그리고 bone sialoprotein의 상대적 mRNA 수준이 유의하게 높았다. 석회화 분석에서는 MC3T3-E1 세포를 $10^{-6}$ 몰의 ${\Delta}^{12}PGJ_2$로 처리한 군과 $10^{-5}$ 몰의 ciglitazone으로 처리한 군에서 현저한 골결절 형성을 보였다. 이러한 결과들은 ${\Delta}^{12}PGJ_2$가 유용한 골 유도물질이 될 수 있으며 또한 그 작용기전이 PPAR 감마-의존형 경로와 연관되어 있음을 보여준다.
MIEF는 소의 초유중에 함유되어 있는 분자량 22,000 dalton의 peptide로서 말초혈액 림파구의 배양액에 첨가할 경우 자연살해세포를 활성화 시켜 암세포에 대한 자연살해능을 증가시키는 것으로 이미 보고된 바 있다. 본 연구에서는 수유기간별 MIEF의 함량 및 MIEF가 B세포의 증식 및 분화에 미치는 영향을 조사하였다. 수유기간별 MlEF의 함량을 competitive ELISA inhibition assay를 이용하여 조사한 결과 MIEF의 함량은 수유 첫째날의 초유에 109$\mu\textrm{g}$/ml로 가장 높았으며, 그 이후로 급격히 감소하여 3일째 이후에서는 3-4$\mu\textrm{g}$/ml이하로 존재하였다. MIEF가 B세포의 분화에 미치는 영향은 사람의 편도선에서 분리한 림파구의 배양액에 MIEF를 가하고 5-9일간 배양한후 항체를 생산하는 세포의 수를 ELISPOT assay로 측정하여 조사하였다. MIEF는 10-30$\mu\textrm{g}$/ml의 농도에서 B세포의 분화를 촉진시켰으며, 그 정도는 양성대조군으로 사용한 LPS와 유사하여 MIEF가 B세포의 분화를 유도하는 작용이 아주 강력함을 알수 있었다.
무(Raphanus sativus L.)는 전세계적으로 재배되고 있는 뿌리 채소 중 하나로, 다양한 방법으로 소비되고 있다. 무의 F1종자 생산을 위한 원종 계통의 교배 과정에서는 화분 혼입으로 인해 순도가 떨어지는 문제가 발생할 수 있다. 따라서 본 연구에서는 무의 기내 대량증식을 위해 캘러스 재분화를 통한 대량증식 조건을 확립함으로써 기내배양 식물체를 증식시키고 원종 증식에 이용될 수 있도록 하는 것을 목표로 하였다. 무의 하배축을 이용한 캘러스 유기에서 다양한 농도의 2,4-D와 TDZ, kinetin 조합 중 가장 효과적인 조합을 선정하고, 유기된 캘러스를 두 종류의 배지(5H+1B, 1 mg/L NAA + 0.1 mg/L 2,4-D + 1 mg/L IPA + 0.02 mg/L GA3 + 2 mg/L zeatin + 1 mg/L BA; 5H+0.1T, 1 mg/L NAA + 0.1 mg/L 2,4-D + 1 mg/L IPA + 0.02 mg/L GA3 + 2 mg/L zeatin + 0.1 mg/L TDZ)에 치상함으로써shoot 재분화에 적합한 호르몬 조건을 탐색하였다. 무의 캘러스 배양 결과, RA2 계통과 RA10 계통은 1 mg/L 2,4-D + 0.05 mg/L kin 조합에서, RA4 계통은 1 mg/L 2,4-D + 0.1 mg/L kin + 0.025 mg/L TDZ 조합에서, RA30 계통은 1 mg/L 2,4-D + 0.2 mg/L kin 조합에서 캘러스의 형성이 효과적이었다. RA4 계통에서 유기된 캘러스의 shoot 재분화는 두 종류의 shoot 재분화 배지에서 모두 일어났지만, 그 빈도는 5H+1B 배지에서 훨씬 더 높았으며 재분화된 shoot를 발근배지에 계대배양하여 뿌리를 유도하고 기내 순화 과정을 거쳐 재분화된 소식물체를 얻을 수 있었다. 이 연구에서 확립한 조건들을 무의 기내 대량번식에 활용한다면, F1 종자 생산을 위한 원종 증식에 도움이 될 것으로 판단된다.
다양한 생체 재료들을 이용한 마이크로 및 나노 크기의 표면 구조 모사는 조직공학에서 세포의 성장 및 분화에 영향을 미치는 것으로 알려져 있다. 특히, 마이크로-나노 구조가 공존하는 계층적 표면 구조는 골 아세포의 증식과 분화에 탁월하여 뼈 조직 재생에 응용되어 왔다. 기존에는 화학적 처리 기법을 이용하여 마이크로 표면 구조가 제작 되었으나 미세 거칠기 및 계층적 표면 구조의 제어가 어려웠다. 현재 이러한 문제점들을 극복하기 위해 플라즈마를 이용한 애칭 기법이 주로 이용되고 있으나 높은 온도 공정 환경에 의한 재료 선택의 한계점 및 오랜 공정 시간에 의한 플라즈마 처리 효율이 감소되어 원하는 표면구조 및 거칠기를 얻을 수 없다는 단점이 있다. 본 연구에서는 이러한 문제점들을 극복하기 위해 마이크로/나노 주조 기법 이용하여 생체적합성 합성고분자 poly(${\varepsilon}$-caprolactone) (PCL) 위에 연꽃잎 구조를 모사한 후 플라즈마 애칭 기법을 이용하여 마이크로-($3.01-3.07{\mu}m$)와 나노크기 ($97{\pm}16nm$)를 동시에 갖는 계층적 구조를 제작하였다. 제작된 구조의 효능을 관찰하기 위해 조골세포를 배양한 결과 평평한 PCL 구조보다 제작된 계층적 구조가 높은 세포성장률 (>2.9배)및 세포 분화도(>2.1배)를 보였다. 이러한 결과는 새로운 표면 공학적 모델로서 손상된 뼈 및 치아조직 재생을 위한 적합한 거칠기 및 표면적인 환경을 제공해 빠른 재생 능력과 더불어 치료기간의 단축을 가져 올 수 있을 것으로 사료된다.
흰쥐의 좌골신경을 절단한 후 혈관내에서 배양한 신경줄기세포를 이식하여 말초신경에서도 수초의 재생이 일어나는지를 형태 학적으로 규명하고 배양한 신경줄기 세포들로부터 분화한 Schwann cell들이 회복할 수 있는지를 조사하여 다음과 같은 결론을 얻었다. 이식한 20일 후 동맥내 배양한 신경줄기세포는 Schwann cell로 분화하여 신경섬유의 재생이 일어나기 시작하였다. Schwann cell은 증식 후 재수초화를 형성하기 위하여 다른 Schwann cell들로부터 여러 가지를 자극을 받고 있었으며 NGF 소견으로 볼 때 신경외막으로부터 기존의 Schwann cell로부터 신경줄기세포의 분화가 유도되었으며 PCNA 반응으로 볼 때도 기존의 신경섬유의 Schwann cell주위에서부터 증식이 일어났다. 미세구조적으로는 Schwann cell의 재수초화, 축삭내 사립체와 미세소관의 수의 증가를 관찰할 수 있었다.
알려진 녹용의 효능을 과학적으로 증명하고 활성성분을 이용하여 신의약품 개발에 기여하고자 한다. 본 연구실에서는 녹용의 가장 대표적인 효능인 조혈작용을 하는 성분을 구조 분석하여 MADG임을 밝히었다. MADG는 조혈촉진기능뿐만 아니라 대식세포 증식기능 그리고 비장세포성장을 촉진하는 등 면역활성 조절제로써의 기능도 나타내었다. 그리고 녹용에 존재하는 인지질 중에서 포화지방산을 가지고 있는 phophatidylcholine도 면역활성을 촉진시키었다. 항진균작용을 하는 성분을 구조 분석한 결과 lysophophatidylcholine임을 밝히었으며 그 유도체인 CHJ-ester가 숙주세포에는 해를 주지 않으면서 항진균작용을 하는 것을 관찰하였다. 그리고 골다공증치료효과를 검색하기 위해 녹용 정제성분으로 연구한 결과 파골세포로의 분화를 100$\%$ 저해함을 밝히므로 녹용이 골다공증 치료효과가 있음을 증면하였다. 녹용성분의 유도체인 SCOH가 파골세포분화를 억제함을 밝혀 현재 골다공증치료제로써의 가능성을 조사하고 있다. 본 연구실에서는 1999년부터 녹용연구를 시작하여 현재까지 10여 개의 활성성분을 분석한 바 있다. 현재 조혈세포촉진작용, 면역증진작용, 골다공증치료작용, 대식세포 증식작용, 항진균작용, 항간질작용에 대한 성분 분석 및 그 약리 기전을 연구하고 있다.
연구는 삼지구엽초에 기내 다랑증식체 계의 설정을 위한 일환으로 절편체 별 살균방법, 생장조절제 종류 및 농도에 의한 캘루스의 증식과 배지를 달리한 식물체 분화 조건을 구명하고자 수행하여 얻어진 결과 진균과 박테리아에 의한 감염률은 근경의 정아와 액아에서 0.1% $AgNO_3$ 용액에 60분간 침지한 1차 살균 후 0.3% NaOCl 용액에 20분간 2차 살균한 처리가 가장 낮았으며 잎에서는 모든 처리에서 거의 오염이 발생되지는 않았지만 74% 이상이 고사되었다. 식물체 분화는 당년간 지하부에서 자란 근경의 정단이 0.1% $AgNO_3$ 용액에 30-60분간 침지한 1차 살균 후 0.3% NaOCl 용액에 20분간 2차 침지살균한 처리에서 가장 높았으며 1년 이상 지하부에서 자란 근경의 액아는 0.1 % $AgNO_3$ 30분간 1차 살균 후 0.3% NaOCl에 20분간 2차 살균한 처리에서 식물체 분화가 높았지만 callus와 식물체 분화는 0.1% $AgNO_3$ 60분간 1차 살균 후 0.3% NaOCl에 20분간 2차 살균한 처리에서 가장 높았다. 잎은 0.2% $AgNO_3$ 15분간 1차 살균 후 0.3% NaOCl 에 20분간 2차 살균한 처리에서 캘루스 유도율이 가장 높았다. 계대배양시 캘루스 생장은 변형된 1/2 MS 배지에 BA $0.02-0.2mg{\cdot}L^{-1}$과 NAA $2.0mg{\cdot}L^{-1}$ 혼용첨가한 처리에서 증식률이 가장 높았다. 캘루스로부터 식물체분화는 대부분 캘루스 상태로 증식되고 일부는 엽육조직으로 분화되었지만 1/2 UM 배지와 1/2 SH 배지에서 각각 8%와 3%가 식물체로 분화되었다
하늘타리 (T. kirilowii)의 기내 (in vitro) 대량증식을 위하여 줄기절편을 2 mg/L BA가 첨가된 MS 배지에 치상하였을 때 정단부위가 포함된 줄기절편의 기저부로부터 다수의 부정아가 형성되었다. 부정아는 정상적인 신초로 분화하였으며, 이와같이 형성 된 신초는 0.5 mg/L BA가 첨가된 MS 배지로 옮겼을 때 4주 후 시료당 $17.3{\pm}0.2$개의 신초로 재분화하였다. 신초의 증식에 있어서 배지내 탄소원으로는 3% sucrose가 적절하였으며, 고형물질에 의한 영향은 확인할 수 없었다. 한편 신초의 발근은 무기염 의 농도가 절반으로 줄어 든 1/2MS 배지 (2% sucrose, 0.3% phytagel, pH 5.7)에서 신초당 $4.3{\pm}0.02$개로 96%이상 형성 되었다.
본 연구는 국내에서 소비되는 약용작물 중 경제적 가치가 높은 백출의 조직배양체계 확립을 위해 수행되었다. 공시재료로는 중국백출(A. macrocephala)과 한국자생백출(A. japonica)의 교잡종인 '다출' 품종의 뿌리와 액아를 이용하였다. 뿌리배양을 위해 BAP, 2-iP, IBA, NAA를 혼용 처리한 결과, 캘러스 유도율은 BAP 처리군에서 다소 높았으나, 캘러스 증식 및 뿌리의 유도에는 2-iP 처리가 효과적이었다. 뿌리조직은 낮은 싸이토키닌의 농도와 높은 옥신의 농도에서 캘러스 유도 및 증식이 원활하였으나 식물체 재분화에는 적합하지 않았다. 백출의 액아배양 시 BAP와 NAA의 혼용처리가 2-iP와 NAA 혹은 IBA 처리보다 재분화식물체 생산에 효과적이었다. 1.0 mg/L BAP와 1.0 mg/L NAA 조건에서 액아 당 신초 출현 수가 3.8개로 가장 많았고, 경직경이 5.0 mm 이상으로 양호하였다. 그러나 BAP를 2-iP로 대치하는 경우 재분화 식물체의 초장은 큰 경향을 보이나 액아 당 재분화 식물체의 수가 적은 것으로 조사되었다. 또한 Sucrose 농도를 70 g/L로 하는 경우 액아로부터 재분화한 식물체의 뿌리 비대에 효과적이었다. 본 실험 결과, 백출의 기내 대량증식을 위한 조직으로는 뿌리보다 액아조직이 효율적이며, 식물의 재분화에는 1.0 mg/L BAP와 1.0 mg/L NAA 적합하고, 고농도의 sucrose가 뿌리 비대에 유용한 것으로 사료된다.
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[게시일 2004년 10월 1일]
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