밀어 (Rhinogobius brunneus)의 난자형성과정에서 난황전구 단백질 (vitellogenin, Vg)의 변화 및 estrogen에 의한 혈청단백질의 유도에 관하여 조사하였다. 혈청내 Vg는 분자량 190, 130 및 115 kDa(reduced form)으로 난자의 성숙과정에서 peptide cleavage가 일어났다. 수컷 밀어에 17$\beta$-estradiol을 1회 주사한 후 48시간에 다량의 Vg로 추정되는 단백질이 유도되어 1주간 지속되었으며 이후로 감소하였다. 이러한 현상은 동계적응 밀어에서는 관찰되지 않았다. 환경 estiogen의 일종인 nonylphenol을 주사하여 Vg으로 추측되는 혈청단백을 유도하였다. 밀어는 환경에스트로젠에 의한 수컷에서 Vg유도에 적합한 실험어류로 사료된다.
중금속에 대한 내성을 나타낸 Serratia marcescens를 이용하여 카드뮴 흡착 기작에 관하여 조사하였다. 먼저 카드뮴에 대하여 민감성을 나타내는 돌연변이 균주인 PM을 개발하였으며 PM균주는 50ppm 이상의 카드뮴 농도에서 성장하지 못하였다. 카드뮴을 50ppm 처리한 균주에서 10회 이상 계대 배양하여 카드뮴에 적응을 유도한 PA균주는 PC, PM균주에 비해 성장 속도가 증가하였으며 세포 내 카드뮴 축적량도 4∼5배 증가하였다. PA균주는 100 ppm 카드뮴 처리군에서 처리량 중 23%를 세포내에 축적하였으며 세포막 부위보다 세포질 부위에 더욱 많은 카드뮴을 축적하였다. 카드뮴 처리시, 전 세포 단백질 양상에서 28 KDa과 64 KDa의 2개의 유도 단백질과 45 KDa의 감소 유도 단백질을 확인하였으며 원자 흡광 분석을 통하여 각각의 유도 단백질에 결합된 카드뮴 양은 단백질 1 g당 318.25 ㎍, 325.37 ㎍이 검출되었다. 세포내에 축적된 카드뮴을 전자현미경을 이용하여 카드뮴 결합 물질을 확인한 결과, 세포질의 단백질 분획에서 28 KDa크기의 유도 단백질이 카드뮴과 흡착한 것으로 나타났다. 카드뮴 흡착에 대한 DNA조사 결과 20 Kb 크기의 plasmid가 존재하였으며, curing agent로 plasmid를 제거한 결과 카드뮴 내성을 상실하여 본 분리 균주의 카드뮴 내성 유전자는 plasmid상에 위치하는 것으로 확인하였다.
단백질을 함유하지 않은 식이를 5일간 먹인 쥐에게 동량으로 혼합된 필수 아미노산 혼합물(amino acid mixture)을 투여 하여 ornithine $\delta$-transamiaase(OT)를 유도(induction)한 군과 또한 amino acid mixture를 먹인 후 $6{\sim}9 \;1/2$시간 후에 glucose를 동시에 먹인 군에서 OT의 유도 기전을 보기 위하여 방사성 동위원소인 L-methionine-$CH_{3}-C^{14}$ 또는 L-Phenylalanine-$H^{3}$(uniformly labelled) 을 사용하여 유도전 OT를 pulse label하여 준비된 항체로 각각 유리 분리시켜서 방사능을 측정하였다. Amino acid mixture만을 투여한 군에서는zero time에 비해 OT활성은 6시간 후에 1.5배, 12시간 후에는 약 3배, 18시간 후에는 13배가 증가되었다. 또한 OT에 incorporate된 표지 아미노산의 방사능은 6시간 후에 1.5배, 12시간 후에 약 3배가 증가 되었을을 보였다. 그러나 이 기간동안 간장의 total soluble protein에 incorporate된 표지 아미노산의 방사능은 거의 증가하지 않았다. 그러므로, amino acid mixture에 의한 OT의 증가는 고유하게 유도되었으며 이때의 관성의 증가는 OT 단백질의 분해률의 감소에 의한 것이 아니라 순수하게 OT 단백질의 생합성에 의찬 증거라고 볼 수 있다. amino acid mixture를 투여한지 6시간 후에 glucose 용액을 동시에 먹인 쥐에서는 OT 활성은 증가를 하였으나 amino acid mixture만을 먹인 군보다는 약간 감소를 보였다. 또한 glucosedp이 투여된 후에는 OT에 표지 아미노산이 더 이상 incorporate되지는 않아 방사능의 증가는 보이지 않았으나 glucose가 투석될 당시보다 더 이상 감소되지는 않았다. 그러므로 glucose에 의한 유도에 대한 억제 (repression)는 단백질의 분해률의 증가에서 온 것이라기 보다는 OT 단백질의 생합성을 억제하여서 $OT_{1}$활성을 감소하지 않았는가 본다.
본 논문은 인공적인 단백질인 MCL-1ES BH3M에 관한 것으로 MCL-1ES BH3M를 과발현시 세포사멸을 유도한다. MCL-1L을 주형으로 재조합 PCR을 통해서 MCL-1ES BH3M를 클로닝하였다. 새롭게 클로닝한 단백질인 MCL-1ES BH3M 단백질은 안정성을 유지하기 위해서 PEST 도메인이 제거되어 있으며, 다른 BCL-2 패밀리 단백질과의 결합을 조절하기 위해서 BH3도메인의 Leu-Arg-Arg-Val-Gly-Asp-Gly 서열을 7개의 Ala 잔기로 인위적으로 돌연변이를 유도하였다. MCL-1ES BH3M를 293T 세포에서 과발현할 경우 세포사멸을 유도하였고, 항-세포사멸 단백질인 MCL-1L을 같이 과발현하더라도 세포사멸을 유도하였다. 또한, 과발현시 Caspase 9과 3를 활성화하였으며 면역염색법을 통해서 MCL-1ES BH3M 과발현시 미토콘드리아에 MCL-1ES BH3M 단백질이 부분적으로 위치하는 것을 확인하였다. 이상의 결과로 MCL-1ES BH3M는 Caspase 9과 3의 활성을 통해서 세포사멸을 유도한다. 결론적으로 본 연구는 세포사멸을 유도하는 새로운 molecule을 클로닝하였고, 이 molecule에 의한 세포사멸 기능을 확인하였다.
선행연구에서 본 연구자는 IEX-1 단백질이 난소 암세포에서 세포사멸(apoptosis)을 유도하는 기능을 수행함을 확인하였으나, 세포사멸과 세포생존의 여러 단계에서 어떠한 신호전달 체계로 IEX-1이 작용하는지는 정확히 알지 못하고 있다. 따라서 IEX-1 단백질과 결합하는 새로운 단백질을 찾기 위해 yeast two-hybrid system을 이용하였다. 그 결과 IEX-1이 여러 다양한 인간 암 세포에서 세포사멸을 유도하는 CATHEPSIN B 단백질과 결합함을 밝혔다. 본 연구에서는 리소좀 프로테아제의 일원인 CATHEPSIN B 단백질과 IEX-1 단백질의 결합을 면역침강법과 western blot 분석으로 확인하였다. 그러므로 이 결과들을 통해서 IEX-1과 CATHEPSIN B는 세포 내에서 서로의 기능에 영향을 미칠 것으로 예상되며, 세포사멸을 유도하는 IEX-1 단백질이 lysosome-mediated apoptotic pathway에 관여할 가능성을 시사한다.
BCL-2 family 단백질들은 세포사멸 신호전달 체계에서 중추적인 역할을 수행하는 것으로 알려져 있으며, BCL2L10 단백질은 그 중 하나로 세포의 사멸과 생존을 조절하는 것으로 알려져 있다. 특이하게도 BCL2L10 단백질은 세포 또는 조직 특이적으로 서로 상반되는 친 세포사멸 또는 항 세포사멸 효과가 각각 보고되어 있다. 현재까지 난소세포에서의 BCL2L10의 발현 여부 및 기능은 알려져 있지 않다. 따라서 본 연구에서 인간 난소 과립세포주인 KGN 세포에서의 BCL2L10 단백질의 발현 여부를 확인한 결과, 상당한 양의 단백질이 발현함을 확인할 수 있었으며, 또한 세포사멸효과를 확인하기 위해서 BCL2L10 단백질을 dose-dependent하게 과발현시킨 후 세포의 생존에 미치는 영향을 분석한 결과,BCL2L10은 KGN 세포에서 과발현 시 세포사멸을 유도함을 관찰하였다. BCL2L10 단백질을 과발현 시 Caspase 9와 3를 활성화 하였으며, 면역염색법을 통해서 BCL2L10 단백질이 미토콘드리아에 위치하는 것을 확인하였다. 또한 BCL2L10단백질의 과발현에 의해 미토콘드리아에서 cytochrome c가 세포질로 분비되는 것을 확인하였다. 이상의 결과로서 본 연구는 BCL2L10의 과발현이 KGN 세포에서 세포사멸을 유도하고, 또한 미토콘드리아에 위치하여 세포질로 cytochrome c를 분비하여 Caspase 9와 3을 활성화 시키는 메커니즘으로 세포사멸을 유도함을 확인하였다. 이러한 연구결과는 BCL2L10단백질이 인간 난소과립세포의 생존과 사멸을 조절하는 인자임을 최초로 규명한 것으로서, 추후 난소에서의 BCL2L10단백질의 생리적인 기능 및 신호 조절 연구의 기반 데이터로서 그 의의가 있으며 활용될 수 있다.
파이토케미칼 resveratrol은 항산화, 항염증, 항암등을 포함하는 다양한 생리활성을 가지고 있는 것으로 알려져 있다. 본 연구에서는 resveratrol이 CCN family 중의 하나인 cysteine-rich angiogenic inducer 61 (CYR61) 유전자의 발현을 유도할 수 있는지 연구하였다. 결과에 의하면 resveratrol은 3개의 다른 인간 대장암 세포주에서 CYR61 단백질의 발현을 유도하였을 뿐만 아니라, HCT116세포주에서는 처리한 resveratrol 농도와 시간 의존적으로 CYR61 단백질의 발현을 유도하였다. 이러한 CYR61 단백질의 발현이 resveratrol의 어떤 생리활성과 관련이 있는지 확인하기 위하여 몇 종류의 NSAIDs와 항산화제를 처리하여 CYR61 단백질의 발현을 확인하였으나, 오직 resveratrol의 처리에 의해서만 CYR61 단백질의 발현이 유도되었다. 또한, CYR61의 발현은 암 억제유전자인 p53과는 관련이 없는 것으로 판단되었다. Promoter assay를 통하여 프로모터 -732 ~ +54 사이에 조절부위가 있음을 확인하였고, 파이토케미칼 Indole-3-carbinol이나 6-gingerol에 의해서도 CYR61의 발현이 유도되지 않음을 확인하였다. 이러한 연구결과는 resveratrol에 의한 CYR61 유전자의 발현은 resveratrol특이적이며, 이러한 연구결과는 resveratrol만의 특이한 생리활성을 이해하는데 도움을 줄 것으로 기대된다.
배추흰나비 5령 유충의 복부에 E. coli K-12를 주입한 다음 면역혈림프로 부터 다섯 종류의 항균단백질을 유도하였으며, 이러한 단백질들은 그람 양성균과 그람 음성균에 대해 항균성이 있거나 혹은 그람 양성균에 대해서만 항균성이 있었다. 유도된 단백질 가운데 열에 안정되고 염기성인 4 kDa 정도의 분자량을 갖는 peptide를 분리하였으며, 이것을 hinnavins이라고 명명하였다.
온열처리가 근세포의 분화에 어떤 영향을 미치는 지를 알아보기 위하여 배양한 근세포에 여러가지 온열처리를 한 다음, 단백질 합성, 세포증식, 융합지수, creatine kinase(CK)의 활성 및 cholesterol 함량의 변화를 조사하였다. 배양한지 24시간지나 45$^{\circ}C$에서 1 hr의 온열처리를 하면 근세포의 융합과 CK 활성이 지연되었으며, 55시간지나 같은 온열처리를 하면 세포막내(세포내 양의 95% 이상)의 chloesterol 양이 일시적으로 증가함과 아울러 세포융합이 지연되었다. 그러나 세포증식은 대조군과 뚜렷한 차이가 없었다. 이상과 같은 실험 결과로부터 온열처리가 분화에 미치는 영향은 온열처리를 받게되는 근원세포의 분화정도에 따라 차이가 있으며 온열처리에 따른 chloesterol 양의 일시적인 증가가 근세포 융합에 영향을 미칠 수 있다는 가능성이 제시되었다. 한편, 근세포는 온열처리를 받으면 평소의 단백질 합성 수준이 떨어짐과 더불어 heat shock protein(HSP)합성이 증대 내지는 유도 되었으며 HSP 합성의 유도는 actinomycin D의 처리로 억제되었다. 또한 온열처리로 근세포는 열내성을 얻어 세포융하과 CK 활성은 동일한 온열처리를 4시간 간격으로 두번 주어도 한번 주었을 경우와 차이가 없었으며 두번째 온열처리에 의해서는 새로운 HSP 합성이 유도되지도 않았다.
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[게시일 2004년 10월 1일]
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