• 제목/요약/키워드: 역전사효소 중합효소 연쇄반응 분석

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치아 우식증에 따른 치수내 유전자 발현 변화에 관한 분석 (GENE EXPRESSION ANALYSIS OF THE DENTAL PULP IN HEALTHY AND CARIES TEETH)

  • 오소희;김종수
    • 대한소아치과학회지
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    • 제37권3호
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    • pp.275-287
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    • 2010
  • 치아 우식증은 범발성 질환이고 이에 대한 생체반응은 단순하지 않으며 질병 과정과 숙주의 활성 모두를 반영하는 복합적인 반응이다. 이러한 반응을 이해하기 위해서는 질병의 세포학적, 분자학적인 면을 이해하는 것이 필수적이다. 이에 본 연구는 임상적으로 건강한 치아와 우식이 진행된 치아로부터 얻어진 치수 안의 유전자 발현을 규명하고 우식 병소에서 일어나는 치유 및 재생에 관계되는 분자와 면역 세포들 사이의 분자 생화학적 상호작용을 규명하기 위해서 우식치아와 건전치아의 치수를 이용하여 cDNA 미세배열(microarray) 분석과 역전사효소 중합효소 연쇄반응 (RT-PCR) 분석, 그리고 면역화학염색법 (immunohistochemistry)을 시행하여 다음과 같은 결론을 얻었다. 1. cDNA 미세배열 분석 결과, 건전치아군인 대조군에서는 143개의 유전자가, 우식치아군인 실험군에서는 377개의 유전자가 1.6배이상 발현되었다. 2. 역전사효소 중합효소 연쇄반응 분석에서 14개의 유전자를 선택하였고 cDNA 미세배열 분석결과와 동일한 결과를 확인하였다. 3. TGF-${\beta}1$의 면역조직화학적 관찰 결과, 건전치에 비해 우식치의 상아모세포와 치수에서 특히 강하게 발현되었다.

(${\Delta}^{12}PGJ_2$ 및 PPAR 감마 길항체가 조골세포의 증식 및 분화에 미치는 효과 (The Effect of ${\Delta}^{12}PGJ2$ and $PPAR{\Gamma}$ Agonist on the Proliferation and Differentiation of Osteoblast)

  • 허정미;김경화;정경욱;이혜준;류인철;구영;정종평
    • Journal of Periodontal and Implant Science
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    • 제35권1호
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    • pp.133-152
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    • 2005
  • 1. 목적 Prostaglandin은 치주질환과 관련된 국소적 골 대사에 중요한 역할을 한다. ${\Delta}^{12}PGJ_2$는 생체 내에서 혈장의 존재 하에 형성되는 천연 $PGD_2$ 대사산물이며 peroxisome- proliferator에 의해 활성화되는 감마 수용체 (PPAR ${\Gamma}$)에 대해 높은 친화성을 갖는 리간드로서 핵 수용체군에 속하는 전사조절인자이다. 이 연구의 목적은 골화 과정에서 ${\Delta}^{12}PGJ_2$의 역할을 규명하기 위해, 조골세포주의 증식과 분화에 미치는 영향과 그에 관련된 세포기전을 조사하는 데에 있다. 2. 방법 인간 골육종세포주인 Saos-2 (ATCC.HTB 85)와 쥐의 조골세포주 (MC3T3-E1)를 배양한 후 실험군에 농도가 각각 $10^{-5}$, $10^{-6}$, $10^{-7}$, $10^{-8}$, $10^{-9}$ 몰인 ${\Delta}^{12}PGJ_2$와 ciglitazone (합성 PPAR 감마 길항체)를 첨가하였다. 조골세포에서 PPAR 감마의 발현을 관찰하기 위해 역전사효소-중합효소연쇄반응(RT-PCR)을 특정한 primer를 이용하여 시행하였다. 세포 증식은 1일, 2일, 3 일째에 MIT 분석법으로 측정하였고, 2 일째에 알칼리성 인산효소 (ALPase) 생산을 측정하였다. 위의 결과에서 얻은 적정한 농도에서 다양한 조골세포 분화의 표지자들-제 1 형 교원질, 알칼리성 인산효소, osteopontin 및 bone sialoprotein-에 대한 간이 정량적 역전사효소-중합효소연쇄반응 (semiquantitative RT-PCR)을 실시하였으며 골결절 형성에 대한 효과를 알아보고자 석회화 분석도 시행하였다. 3. 결과 ${\Delta}^{12}PGJ_2$와 ciglitazone 모두 Saos-2 세포주의 증식을 촉진시켰다 .$10^{-8}$ 몰의 ${\Delta}^{12}PGJ_2$$10^{-6}$몰의 ciglitazone을 첨가한 실험군을 대조군과 비교했을 때, 시간에 비례하여 세포 증식률이 증가되었다. 알칼리성 인산효소의 활성화 검사에서도 증식률에서와 유사한 결과를 보여주었다. 간이 정량적 RT-PCR에서는 ${\Delta}^{12}PGJ_2$로 처리한 군의 경우 제 1 형 교원질, 알칼리성 인산효소, osteopontin, 그리고 bone sialoprotein의 상대적 mRNA 수준이 유의하게 높았다. 석회화 분석에서는 MC3T3-E1 세포를 $10^{-6}$ 몰의 ${\Delta}^{12}PGJ_2$로 처리한 군과 $10^{-5}$ 몰의 ciglitazone으로 처리한 군에서 현저한 골결절 형성을 보였다. 이러한 결과들은 ${\Delta}^{12}PGJ_2$가 유용한 골 유도물질이 될 수 있으며 또한 그 작용기전이 PPAR 감마-의존형 경로와 연관되어 있음을 보여준다.

생쥐 초기 배아에서 Aquaporin 8과 9의 발현에 관한 연구

  • 신현상;계명찬;강수만;이성은;이지원;강한승;김문규
    • 한국발생생물학회:학술대회논문집
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    • 한국발생생물학회 2003년도 제3회 국제심포지움 및 학술대회
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    • pp.68-68
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    • 2003
  • Aquaporin은 막관통 통로 단백질(transmembrane channel protein)로서, 삼투압의 농도구배에 따라 세포막을 가로질러 물분자를 이동시키는 기능을 하고 있다. 포유류 초기배아에서 포배강 형성은 영양외배엽세포에서 $Na^+ / K^+$ATPase에 의한 이온 농도 구배가 형성되면 auqaporin에 의해 물이 포배강으로 유입되면서 이루어진다. 본 연구에서는 생쥐 초기배아에서 반정량적인 역전사 중합효소 연쇄반응 방법(semi-quantitative RT-PCR)과 실시간 역전사 중합효소 연쇄반응 방법(real-time RT-PCR)을 통하여 AQP8과 9의 mRNA발현을 조사하고 다중 면역형광현미경 방법(confocal immunofluorescence microscopy)을 통해 단백질 발현양상을 분석하였다. AQP8 mRNA는 상실기까지 발현되지 않다가 포배기에 이르러 발현되었고 AQP9 mRNA는 수정란에서부터 발현되어 포배기에는 유의할 정도로 증가하였다. 따라서 AQP8 mRNA는 배아유전자가 활성화되어 나타나는 것이고 AQP9 mRNA는 모계유전자 기원임을 알 수 있었다. AQP8 단백질은 상실배 단계까지 발현되지 않다가 포배시기에 영양외배엽세포사이의 접합면에 발현되었고 AQP9 단백질은 상실배 시기에 할구 사이의 인접 부위에서 강하게 발현되었다가 포배시기에는 세포간의 접합면에 약하게 발현하는 경향을 나타내었다. 실시간 역전사 중합효소 연쇄반응 방법으로 조사한 결과 포배에서 물과 글리세롤을 통과시키는 AQP9는 mRNA의 발현양이 AQP8보다 약 4배 정도 많았다. 또한 포배기에 이르러서야 물만을 통과시키는 AQP8의 발현이 나타나는 것을 보아 포배강 형성시 외부에서 영양외배엽을 통해 포배강으로 유입되는 물의 이동(trans- trophectodermal water movements)에 AQP9보다 AQP8이 더 중요하게 관여할 것으로 사료된다., K, Pb, Cd, Cr, Co, Cu, Ni)을 측정하였다. 실험 조건1의 결과로서 각 국의 유아용 일회용 기저귀의 중금속 함량은 거의 유사한 경향을 나타내었으며 Cr, Zn, Pb, Ni, Mn, Mg, Li, K는 detection limit(2 ppm) 이하였고, Cd, Fe, Co, Cu, Ca, Al, Sr는 검출되었지만 기준치 이하였다. 실험 조건2의 결과로서 측정 항목(Cr, Sb, Cd, Pb, Ni, Co, Cu)중 Cr, Cd, Ni, Cu는 detection limit(0.1 ppm) 이하였고, Sb, Pb, Co는 검출되었지만 기준치 이하였다.았다. 4%의 경우에는 8$0^{\circ}C$이하로 온도를 낮추는 것이 좋은 상태를 나타내었다. 이와 같은 결과는 일반적으로 화학적 레팅을 4%, 7%에서한 선행결과와 상당히 다른 결과이다.염 농도가 증가할수록 감소 현상을 보였다.X>, 75BG30은 8.6$\mu\textrm{m}$, 75BG40은 7.02$\mu\textrm{m}$로 나타났다. 따라서 경화제 양에 관계없이 10$\mu\textrm{m}$ 이하로 나타나, 경화제 10$m\ell$만으로 미세한 크기를 얻을 수 있음을 알 수 있다. 젤리 강도 변화에 따른 차이는 300BF는 78.09$\mu\textrm{m}$ 300BG는 56.32$\mu\textrm{m}$로, 75BF나 75BG에 비하여 현저히 증가하여, 젤라틴의 젤리 강도는 캡슐 제조 조건의 주요한 변수임을 알 수 있다.추출물 투여시 혈당강하 및 혈중콜레스테롤 강하가 나타났으며, 상엽복합추출물 투여와 운동을 병행시 이러한 감소 효과가 더 뚜렷하게 나타났다.교육의 적임자로 보는 시각이 비교적 높았고 약 1/2정도는 영양교육에 참여하겠다는 의지를 가지고 있을 뿐만 아니라 실제로 영양지도를

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DNA 중합효소 연쇄반응을 이용한 한국형 젖소 면역 결핍 바이러스의 검출 (Molecular Detection of Korean-type Bovine Immunodeficiency Virus by Polymerase Chain Reaction)

  • 권오식
    • 대한의생명과학회지
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    • 제5권1호
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    • pp.101-107
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    • 1999
  • 젖소 면역결핍 바이러스 (BIV)는 젖소에게 여러 가지 면역결핍증후군을 야기하는 렌티 바이러스 (역전사효소 바이러스의 아군)로서 국내에서는 이에 대한 연구나 보고가 진행된 바 없다. 본 연구에서는 BIV가 다른 젖소의 역전사효소 바이러스인 젖소 백혈병바이러스 (BLV)와 동시 감염되고 (50%정도)있는 점을 착안해 우선 대구.경북지역의 소의 BLV감염실태를 조사해 BLV가 감염된 젖소를 대상으로 BIV 감염상태를 알아보았다. 먼저 10회에 걸쳐 젖소와 황소 248마리의 혈액을 채취 해 BLV와 BIV의 숙주세포가 되는 말초혈액 단핵구 (peripheral blood monocytes, PBMC)를 분리하고, 이를 이용해 DNA중합효소 연쇄반응 (PCR)과 Southern blot분석법을 통해 BLV와 BIV의 존재여부를 조사하였다. 그 결과 조사대상 젖소의 66.9% (81/121) 이상이 BLV에 감염되어 있음을 PCR 검사를 통해 알 수 있었으며, 이는 Southern blot법으로 재차 확인되었다. 이 결과는 종래에 보고된 대구경북지역에서의 BLV 감염율인 27~30%보다 2배 이상 높은 수치로서, (1) 우리가 사용한 방법들 (PCR & Southern blot법)이 분자생물학적 연구방법인 관계로 고도의 특이성 (specificity)을 지녔기 때문이며 (2) 지난 10년간 조사 대상지역인 대구 경북지역 내에서 젖소들에게 지속적으로 BLV감염이 증가하였기 때문으로 본다. 한편 이들 BLV positive PBMC의 chromosomal DNA를 사용해 BIV의 검출을 시도한 바, lot 3C샘플은 BLV에 100%감염되어 있음과 동시에 그 일부가 BIV에 감염되어 있음을 PCR 방법을 통하여 확인할 수 있었다.

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SYBR Green 실시간 역전사 중합효소연쇄반응을 이용한 개 싸이토카인 유전자 발현의 정량 (Development and Evaluation of a SYBR Green Real-time PCR Assay for Canine Cytokine Gene Expression)

  • 유도현;인동철;박철;박진호
    • 한국임상수의학회지
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    • 제27권5호
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    • pp.508-513
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    • 2010
  • 싸이토카인은 염증 및 면역 반응의 평가에 있어서 매우 중요한 요소이다. 따라서 이들의 mRNA 수준을 정량하고 평가하는 것은 염증 및 면역 반응을 평가하는데 있어서 그 민감도가 매우 높은 방법으로 알려져 있다. 본 연구의 목적은 SYBR green dye를 이용하여 개의 싸이토카인 mRNA를 정량적 실시간 역전사 중합효소연쇄반응(real-time reverse transcriptase PCR; qRT-PCR)으로 분석을 할 수 있도록 함에 있다고 할 수 있다. 제작된 시발체(primer)의 최적화된 붙임 온도(annealing temperature; $T_a$)는 인터루킨(interleukin; IL)-$1{\beta}$, IL-6, IL-10이 각각 $62^{\circ}C$, glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase (GAPDH)와 tumor necrosis factor (TNF)-${\alpha}$$60^{\circ}C$ 그리고 high mobility group box 1 (HMGB1)이 $58^{\circ}C$였다. 표준 정량 곡선을 이용하여 측정한 시발체의 효율성은 97.1%에서 102.%로 매우 높았고, 2차 구조물(secondary structure)과 시발체-이합체 형성(primer-dimer formation)은 융해곡선(melt-curve)분석과 전기영동을 통해 확인하였다. 이렇게 정립된 qRT-PCR 분석법은 민감도와 특이도가 매우 높은 개 싸이토카인 유전자 정량법으로 활용될 수 있을 것이다.

조기 난소 부전증(Premature Ovarian Failure, POF) 환자에서 난포 자극 호르몬 수용체 유전자 변이 및 발현 양상에 대한 분석 (Analysis of Gene Mutation and Expression Level of Follicle Stimulating Hormone Receptor in Premature Ovarian Failure(POE) Patients)

  • 김정욱;염혜원;이형송;송견지;천강우;박용석;김계현
    • 한국발생생물학회지:발생과생식
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    • 제4권1호
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    • pp.61-66
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    • 2000
  • 본 연구에서는 조기 난소 부전증 환자를 대상으로 난포 자극 호르몬 수용체 유전자의 돌연변이와 발현 양상을 분석하였다. 돌연변이 분석을 위해 환자의 말초혈액에서 genomic DNA를 분리하고 nucleotide 566을 포함하고 있는 exon 7에 특이적인 primer쌍을 이용하여 중합효소 연쇄 반응을 시행하였다. 전기 영동으로 반응산물을 확인한 다음, 돌연변이 여부를 조사하기 위하여 제한효소 절단분석 (Restriction Fragment Length Polymorphism, RFLP)을 시행한 결과, 대조군과 조기 난소 부전증 환자군 모두에서 돌연변이를 관찰할 수 없었다. 난포 자극 호르몬 수용체의 발현양상을 확인하기 위해 시험관아기 시술과정 중 난자 채취과정에서 얻어진 황체화 과립세포에서 total RNA를 추출하여 역전사 중합효소 연쇄 반응을 시행하였다. 반응 산물을 전기 영동하여 발현양상을 비교해 본 결과, 대조군에 비해 조기 난소 부전증 환자군에서 난포 자극 호르몬 수용체 유전자의 발현이 다소 낮은 것으로 확인되었다. 이상의 결과로 보아 조기 난소 부전증 환자에서 난포 자극 호르몬 수용체 유전자의 돌연변이는 발견할 수 없었으며 난포 자극 호르몬 수용체 유전자의 발현이 대조군에 비해 낮아 과배란 유도시에 생식소 자극 호르몬에 대해 저적응증을 보이며 난포형성과정에도 장애를 받는 것으로 사료된다.

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상기도 감염으로 입원한 소아환자에서 항생제 사용에 대한 후향적 분석 (A Retrospective Analysis of Use in Hospitalized Children with Upper Respiratory Tract Infection)

  • 정민영;박지현;오지은
    • Pediatric Infection and Vaccine
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    • 제24권2호
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    • pp.87-94
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    • 2017
  • 목적: 상기도 감염인 소아에게 항생제를 처방하는 것은 아직도 많은 진료실에서 이루어지고 있다. 이 연구는 역전사 중합효소연쇄반응 검사로 호흡기 바이러스가 확인된 이후에도 항생제를 사용한 소아 환자들의 임상적 특징을 조사하고자 하였다. 방법: 2013년 1월부터 2014년 11월에 고신대학교 복음병원 소아청소년과에 상기도 감염으로 입원한 환자 중 역전사 중합효소연쇄반응을 시행한 환자들을 대상으로 후향적 의무기록 분석을 통해 평가하였다. 결과: 상기도 감염으로 진단받은 393명 중 전체 환자 연령의 중앙값은 23개월이었다. 입원 당시 항생제를 처방받은 환자(79명, 20.1%)와 항생제를 처방받지 않은 환자들의 임상적 요인을 비교할 때, 중이염 또는 부비동염의 동반, 높은 고감도 C-반응단백질의 수치가 항생제 처방과 의미 있게 관련 있었다(P<0.001). 입원하여 항생제를 사용하던 중 역전사 중합효소연쇄반응 방법으로 호흡기 바이러스가 확인되었지만, 항생제를 계속 사용한 환자는 44명 중 28명(63.6%)이었다. 항생제를 계속 사용한 환자는 항생제를 중단한 환자와 비교할 때 중이염 동반 비율이 유의하게 높았다(75% vs. 25%, P=0.002). 결론: 본 연구에서 상기도 감염의 원인이 바이러스임을 확인된 소아 환자에게서도 항생제를 지속한 주된 이유는 중이염이 동반되었기 때문이었다. 중이염을 정확하게 진단하고 그 중 항생제가 꼭 필요한 경우를 가려낸다면 소아 상기도 감염에서 불필요한 항생제 사용을 줄이는 데 도움이 될 것으로 생각된다.

상업용 유전자 변형작물 이벤트 선발을 위한 도입유전자 확인, 발현 및 세대간 안정성 평가 : 오이모자이크바이러스 저항성 GM 고추 (Identification of Introduced Gene and Its Expression and Gene Stability Assessment for Event Selection of Genetically Modified Plant toward Approval: Cucumber Mosaic Virus Resistant Hot Pepper)

  • 강승원;한밝음;이태호;김은지;이긍표
    • 원예과학기술지
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    • 제30권2호
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    • pp.192-200
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    • 2012
  • 형질전환 작물 개발시, 위해성 평가에 영향을 미치게 될 요인들을 파악하고, 이에 대한 과학적 근거의 마련을 위한 실험 자료 생산계획의 확립과 실험을 진행하는 것이 매우 중요하다. 또한 유전자변형작물을 개발한 후 정부의 승인을 위한 과학적이고 신뢰할 만한 자료를 축적하기 위해서는 오랜 기간과 많은 자본이 투입된다. 이에 따라, 본 연구에서는 CMV 저항성 유전자변형 고추에 대한 평가분석 연구를 통해 유전자변형작물의 환경위해성 평가를 수행하는데 있어 도입유전자 확인을 위한 평가서 작성을 위해 요구되는 서던 분석을 위한 탐침 포화, 도입유전자의 발현 해석을 위한 RT-PCR, ELISA 실험에 관한 사례를 제시하고자 하였다. 서던 분석을 위해 삽입 유전자 전체 서열의 확인이 가능한 10개의 부분적으로 겹치는 탐침을 제작하였다. 서던 분석 결과, 고추에 도입된 외래유전자가 단일사본으로 존재하여, 게놈전체에서 도입된 위치 이외에 상동성을 갖는 다른 조각 부위가 없음을 확인하였으며, 도입유전자 전체의 안정성을 확실히 입증할 수 있었다. 그와 더불어, 역전사 중합효소 연쇄반응 및 효소면역법 실험을 통하여, CMV 저항성 고추의 잎, 과실 등과 같은 주요 기관에서의 삽입 유전자에 대한 안정적인 발현을 확인 할 수 있었다.

역전사 중합효소련쇄반응(RT-PCR)과 제한효소 분석을 이용한 오이 모자이크 바이러스의 신속한 검정과 동정 (Rapid Detection and Identification of Cucumber Mosaic Virus by Reverse Transcription and Polymerase Chain Reaction (RT-PCR) and Restriction Analysis)

  • Park, Won Mok
    • Journal of Plant Biology
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    • 제38권3호
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    • pp.267-274
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    • 1995
  • Based upon the nucleotide sequence of As strain of cucumber mosaic virus (CMV-As0 RNA4, coat protein (CP) gene was selected for the design of oligonucleotide primers of polymerase chain reaction (PCR) for detection and identification of the virus. Reverse transcription and polymerase chain reaction (RT-PCR) was performed with a set of 18-mer CMV CP-specific primers to amplify a 671 bp fragment from crude nucleic acid extracts of virus-infected leaf tissues as well as purified viral RNAs. The minimum concentrations of template viral RNA and crude nucleic acids from infected tobacco tissue required to detect the virus were 1.0 fg and 1:65,536 (w/v), respectively. No PCR product was obtained when potato virus Y-VN RNA or extracts of healthy plants were used as templates in RT-PCR using the same primers. The RT-PCR detected CMV-Y strain as well as CMV-As strain. Restriction analysis of the two individual PCR amplified DNA fragments from CMV-As and CMV-Y strains showed distinct polymorphic patterns. PCR product from CMV-As has a single recognition site for EcoRI and EcoRV, respectively, and the product from CMV-Y has no site for EcoRI or EcoRV but only one site for HindIII. The RT-PCR was able to detect the virus in the tissues of infected pepper, tomato and Chinese cabbage plants.

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간이 조즙액 추출법을 이용한 RT-PCR 방법에 의한 오이 모자이크 바이러스의 검정 (Detection of Cucumber Mosaic Virus by RT-PCR Using a Simple and Rapid Crude Sap Extraction Method)

  • 이상용;홍진성;이진상;최장경
    • 한국식물병리학회지
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    • 제12권4호
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    • pp.432-436
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    • 1996
  • 역전사 중합효소 연쇄반응(RT-PCR)을 이용하여 담배(Nicotiana glutinosa)에 증식시킨 7종의 오이 모자이크 바이러스(CMV)를 검정하였다. RT-PCR을 위한 간단하고 신속한 바이러스 핵산의 조즙액 추출법이 개발되었으며, CMV 외피단백질 유전자 부위를 기초로 하여 제작한 20개의 염기로 구성된 primer를 사용하여 RT-PCR을 실시한 결과, 약 490 염기쌍의 DNA 단편들이 이병식물의 조즙액으로부터 증폭되었다. EcoRI 및 MspI을 이용한 RT-PCR 산물의 분석에 의하여, 공시한 7종의 바이러스는 모두 CMV subgroup I으로 동정되었다. Ouchterlony 한천젤 이중 확산법을 이용한 항혈청 검정에서도 7종의 바이러스 모두 CMV-Y의 항혈청과 단일의 침강선을 형성하였다.

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