에탄올 발효에서의 주요 환경 인자인 온도, pH, 통 기속도, 초기 포도당 농도, 효모추출물 농도 등이 세 포성장과 에탄올 및 부산물 생성에 미치는 영향에 대하여 연구하였다. 통기속도가 증가함에 따라 최대 세포농도는 거의 션형적으로 증가하는 반면 최대 에 탄올 및 부산물 농도는 감소하였다. 배양온도가 높아질수록 세포의 성장속도와 에탄올 빛 부산물 생성 속도는 증가하는 반면 최종 세포농도와 최종 에탄올 및 부산물 농도는 오히려 낮게 나타난다. 배지내의 pH 벙위가 4.0 이하냐 6.0 이상으로 되연 세포성장, 에탄올 및 부산물 생성이 급격히 감소하였고 pH 4.5 에서 세포농도와 에탄올 및 부산물 농도가 최대치를 나타내었다. 초기 포도당 농도의 증가에 따라 세포 농도와 에탄올 및 발효 부산물 농도는 증가하였으나 수율은 오히려 감소하였다. 효모추출물 농도가 증가 하면 세포성장은 증가하나 에탄올 및 부산물의 생성 은 오히려 감소하였다.
발효액중에 생성된 에탄올의 농도가 균의 성장 및 에탄올 앵성속도에 미치는 영향을 연속발효법으로 연구하였다. 그 결과 생성된 에탄올의 농도 $20g^{-1}$에부터 균의 비성장속도가 급속히 저하되나 에탄올의 생성속도는 에탄올 농도가 $60g^{-1}$ 이상이 되어야 저해되는 것을 알았다. 이러한 현상은 Zymomas mobilis 균에서 특이하게 보고되었던 균성장(Anabolism)과 당대사(catabolism)사이에의 연결에 분리가 일어나는 소위 uncoupling현상이 에탄올 농도에 크게 영향을 받는 것으로 판단되었다.
Saccharomyces cerevisiae는 전통적으로 알코올 음료와 bioethanol 생산에 이용되지만, 발효가 진행되는 동안 효모의 에탄올 생성은 에탄올의 축적에 의한 충격으로 세포활성에 손상을 초래한다. 본 연구는 S. cerevisiae의 에탄올 스트레스 반응과 에탄올 내성의 분자적 기초에 관해 수행되었으며, 에탄올 스트레스가 진행되는 동안 효모의 에탄올 생성 향상을 위한 유전 공학 전략의 수립에 활용될 수 있다. 이전의 연구들은 유전자 발현에 대한 에탄올 스트레스의 충격이 환경적 영향을 받기 때문에 다양한 균주와 조건들에 관해 이루어졌다. 그러나 에탄올 공격에 의해 영향을 받은 gene ontology 범주에서의 일부 공통점은 S. cerevisiae의 에탄올 스트레스 반응이 해당과정 및 미토콘드리아 기능과 관련된 유전자 발현의 증가와 에너지가 요구되는 성장과정과 관련된 유전자의 발현 감소에 따라 에너지 생산에 제약 받음을 의미한다. Genomewide screens를 이용한 연구는 vacuole function의 유지가 에탄올 내성에 대해 중요함을 암시한다. 아마도 단백질 turnover와 이온 항상성 유지에 이 세포기관의 역할이 중요하기 때문인 것으로 사료된다. 특히 에탄올 스트레스가 일어날 때 핵 내 Asr1과 Rat8의 축적은 비록 이 가설이 논란이 많은 주제로 남아있지만 S. cerevisiae가 에탄올 스트레스에 대한 특별한 반응을 가지고 있음을 의미한다.
본 연구에서는 에탄 자화균인 Methylosinus trichosporim OB3b를 이용하여 메탄으로부터 에탄올 생성에 관한 실험을 수행하였다. 에탄으로부터 에탄올을 생성하기 위해서는 메탄 산화과정 중 두번 째 효소인 methanol dehydrogenase 효소의 활성을 부분 저해해야 하므로 이를 위해 EDTA를 사용한 결과 EDTA가 methanol dehydrogenase의 저해제 임을 확인하였고 배지에 6mM EDTA를 첨가하였을 때 전혀 첨가하지 않았을 때와 비교하여 메탄올 생 성이 약 5배 정도 증가되어 lOmmole/L의 에탄율을 얻을 수 있었다. 또한 Cu의 존재유무가 에단올 생성 에 미치는 영향을 실험한 결과 ImM Cu 존재시 $5\mu\textrm{M}$ Cu 존재하에 비해 메탄올 생성이 약 2.5배 증가되어 약 11mmole/L의 메탄올을 얻을 수 있었는데 이는 Cu 존재가 입자상(particulate) MMO의 생성을 촉 진시키며 생성된 이 세포 단위중량당 MMO 활성이 높은 pMMO가 에탄으로부터 에탄올의 생성을 촉진 시키는 것으로 생각된다. 그리고 온도가 에탄올 생 성에 미치는 영향을 실험한 결과 온도가 3TC에서 $30^{\circ}C , 25^{\circ}C$ 로 낮아점에 따라 생성 메단올 농도가 증 가하여 15.5mmole/L에 이르렀고 메탄 소비속도도 증가됨을 알 수 있였다. 또한 메단과 산소의 구생성 분비가 에탄올 생성에 미치는 영향을 실험한 결과 산소대비 에탄 농도가 증가할수록 생성 에탄올의 농 도 및 세포농도가 증가됨을 알 수 였다. 그리하여 50% 메탄, 50% 산소 존재하에 비해 70% 에탄, 30% 산소 경우에는 약 50% 증가된 15.3 mmole/L 농도의 머l단올을 얻을 수가 있였으며 세포농도도 많이 증가됨을 알 수 있다.
기존의 일반적인 에탄올 제조법으로는 1) ethylene의 가수분해, 2)전분이나 당분의 발효, 3)acetylene으로부터 얻은 acetaldehyde의 환원반응이 있다. 기존의 화석연로에 의존하지 않고 에탄올을 생성하는 방법은 발효에 의한 방법이다. 발효에 의해 생성되는 에탄올의 농도는 batch식 발효에서 13-14%, 고정화 발효방법에서 5-10%정도이다. 이를 고순도의 에탄올로 농축하기 위한 방법으로는 증류법, 투과증발법, 역삼투법등이 있으며 증류를 이용하여 농축하는 경우에는 상당히 큰 열에너지를 필요로 한다.
Saccharomyces cerevisiae STV89와 Kluyveromyces fragilis CBS397의 에탄올 내성에 대한 산소와 불포화 지방산의 첨가 영향을 연구하기 위한 알콜발효를 수행하였다. 실험결과 통기에 의하여 세포성장과 에탄올 생성속도가 촉진되어으며, 세포와 에탄올 생성량도 크게 증가되었다. 특히 균주의 비교에서 cell의 최대 비성장 속도와 에탄올 생성 속도가 S.cerevisiae의 경우 1.7배와 2.3배 증가하였지만, K. fragilis인 경우 6.4배와 4.4배가 증가하여 K. FRAGILIS가 에탄올 생성 및 cellgrowth를 위하여 S. cerevisiae보다 산소가 더 필수적인 요인으로 작용한다. 또한 S. cerevisiae와 K. fragilis 모두 ergosterol, linoleic acid 및 oleic acid의 첨가에 의하여 cell growth와 에탄올 형성이 향상되었다. 따라서 산소와 불포화 지방산은 효모의 에탄올 내성 증가에 중요한 요인으로 작용함을 알 수 있었다.
원자력 발전소의 2차계통수에는 pH를 조절하여 부식을 억제하기 위해 pH제어제로 약염기성 화학물질을 첨가하고 있다. pH 제어제로 암모니아를 사용하였으나 pH가 낮아 부식생성물이 생성되어 증기발생기의 전열관에 슬러지의 퇴적으로 전열관의 부식이 촉진되므로 pH 제어제를 에탄올아민으로 바꿈으로 슬러지의 생성 및 이동을 억제하고 있다. 그러나 에탄올아민은 암모니아와 물리화학적 성질이 다르므로, 증기발생기에 유입되는 부식생성물의 용해와 흡착, 이온성 불순물의 잠복현상에 미치는 영향이 다르다. 본 연구는 암모니아와 에탄올아민이 온도가 점차 높아짐에 따라 부식생성물에 대찬 용해와 흡착, 이온성불순물의 잠복현상에 미치는 영향을 조사하였다. 이 실험의 결과로 2차 계통수의 pH 제어제는 ETA가 암모니아보다 증기발생기 슬러지의 철산화물에 더 흡착되어 더 많이 용해되어 퇴적된 슬러지 양을 감소시키므로, 슬러지에 흡착된 불순물의 양을 감소시저 잠복 현상을 억제할 것으로 조사되었다.
본 연구에서는 연화 열수 및 에탄올 추출물의 3T3-L1 지방세포 분화 및 ROS생성 저감효과를 구명하기 위하여 3T3-L1 전지방세포 분화과정 중 연화 열수 및 에탄올 추출물에 의한 지방축적과 ROS 생성을 관찰하였다. 연화 열수 및 에탄올 추출물은 XTT assay에서 100, 200 및 $400{\mu}g/mL$ 농도에서 세포 독성을 보이지 않았다. 지방세포 분화 중 세포 내 지방축적 및 ROS 생성량을 비교한 결과, 연화 열수 및 에탄올 추출물을 처리한 지방세포의 경우 지방축적량과 ROS 생성량 모두 유의적으로 억제되는 것으로 나타났다. 특히 연화 열수 및 에탄올 추출물을 처리함으로써 지방세포분화와 관련된 전사인자인 $PPAR{\gamma}$, $C/EBP{\alpha}$ 및 aP mRNA의 발현을 유의적으로 감소시켰으며, ROS의 생성과 관련이 있는 주요 유전자인 NOX4 및 catalase의 유전자발현 또한 유의적으로 감소하였다. 이 결과를 통해 연화 열수 및 에탄올 추출물이 3T3-L1 지방세포 내 중성지방의 축적 억제효과와 더불어 ROS 생성 억제에 효과적으로 작용함을 확인하였다. 따라서 연화 열수 및 에탄올 추출물은 비만과 같은 대사증후군 관련 질환의 개선을 위한 천연물 기능성 소재로의 활용이 기대된다.
감국 에탄올 추출물이 $H_2O_2$로 유도한 산화적 스트레스 상황에서 MC3T3-E1 조골세포의 증식 및 분화, ROS 생성 및 염증 매개성 cytokine인 TNF-${\alpha}$ 생성 등에 미치는 영향을 분석하였다. $H_2O_2$로 유도한 산화적 스트레스 상황에서 감국 에탄올 추출물은 30-100 ${\mu}g/mL$ 농도 범위에서 조골세포의 증식을 유의적으로 증가시켰다. 또한, 감국 에탄올 추출물 200 ${\mu}g/mL$ 농도에서 ALP 활성이 약 1.5배 유의적인 증가를 나타냈다. 그러나 collagen 합성에는 유의적 차이를 보이지 않았다. Mineralization 측정에서는 200 ${\mu}g/mL$ 농도에서 대조군에 비해 유의적 증가를 보였다. $H_2O_2$로 유도한 산화적 스트레스 상황에서 감국 에탄올 추출물이 intracellular ROS 생성에 미치는 영향을 측정해본 결과, 30 ${\mu}g/mL$ 농도에서 antioxidant인 trolox 20 ${\mu}M$과 유사한 ROS 생성수준을 나타내어 유사한 항산화 효과를 보였으며, 그 이상의 농도에서는 더 높은 항산화 효과를 나타냈다. $H_2O_2$로 유도한 산화적 스트레스 상황에서 조골세포의 collagen 및 ALP의 합성을 억제하고 파골세포로의 분화 증강과 골흡수를 촉진시키는 것으로 알려진 TNF-${\alpha}$ 생성정도를 측정한 결과, 감국 에탄올 추출물 처리에 의해 농도 의존적으로 생성이 감소되었으며, 200 ${\mu}g/mL$ 농도에서 대조군 대비 89% 수준을 나타내어 유의적 차이를 보였다. 이상의 결과를 통해 감국 에탄올 추출물은 $H_2O_2$로 유도된 산화적 스트레스 상황에서 세포 내 ROS 생성과 염증매개 cytokine인 TNF-${\alpha}$ 생성을 감소시킴으로써 조골세포 손상과 활성 감소를 억제하고, 증식과 분화를 촉진시키는 효과가 있는 것을 확인할 수 있었다. 따라서 감국 에탄올 추출물의 골다공증 예방을 위한 식물성 에스트로젠(phytoestrogen) 및 항산화 소재로의 이용 가능성이 있을 것으로 사료된다.
아르곤과 일산화탄소가 포화된 에탄올 수용액의 광화학 반응을 184.9 nm의 자외선을 이용 연구하였다. 아르곤이 포화된 $1{\times}10^{-2}$M의 에탄올 수용액에서는 acetaldehyde와 2,3-butanediol만이 얻어졌으나, 일산화탄소가 포화된 용액의 광반응에서는 이들 두 가지 생성물 이외에 carboxylation 및 carboxylation반응이 진행되어 ${\alpha}$-hydroxypropionaldehyde, formaldehyde, glyoxal, formic acid, oxalic acid and glyoxylic acid등이 생성되었다. 그러나 에탄올의 농도가 증가한 용액의 광반응에서는 일산화탄소의 존재유무에 관계없이 carboxylation과 carboxylation반응은 관찰되지 않았다. 반응의 결과 얻어진 각 생성물들에 대한 initial quantum yield의 값들을 결정하였으며, 산소가 제거된 에탄올 수용액의 광반응에서 얻은 결과와 비교하여 가능한 반응메카니즘을 제시하였다.
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[게시일 2004년 10월 1일]
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