galangin은 1차 발암물질인 MNNG, EMS, 2차 발암물질인 B(a)P 및 DMBA에 의해 유도된 소핵생성에 대하여 억제효과를 나타내었으나 ADM에 대해서는 억제효과를 나타내지 않았다. 한편, S-9 mixture 존재하 benzo(a)pyrene에 의한 자매염색분체교환 빈도에 대해서도 억제효과를 나타내었다. 또한, radiomimetic agent인 BLM 유도 염색체 이상에 대해서도 억제효과를 나타내었다. 이같은 결과를 종합하면 galangin은 DNA alkylation이나 adduct를 형성하는 발암물질에 대하여 억제효과가 큰 것으로 보아 DNA alkylation 및 DNA adduct를 형성을 차단하거나 방향족 탄화수소의 대사 활성화를 방해하여 특정 발암물질들의 염색체 손상작용을 억제해주는 Anticlastogen으로서의 가능성을 보여주었다.
벼 유묘와 상자묘의 생육억제 효과를 검토하기 위해서 일본청품종을 공시하여 5가지의 생장억제제를 사용종자 침종하여 생장억제 효과를 검토하는 한편 묘의 에칠렌 생성량을 측정하여 생장과 에칠렌 생성량과의 관계를 검토하여 다음과 같은 결과를 얻었다. 1. 생장억제제의 종류에 의해 묘의 억제효과에 차이가 있으나, 어느 약제나 처리농도가 높을 수록 억제 효과가 컸다. 2. 약제의 종류에 따른 억제효과는 S-327> BAS-106 >NTN -821>PP-333 >CGR-811의 순이었다. 3. 묘의 에칠렌 생성량에 미치는 영향은 억제효과가 큰 S-327, BAS-106의 고농도에서 현저히 많았다. 4. 생장억제제 처리에 의한 묘의 초장과 에칠렌 생성량 사이에는 유의성이 높은 부의 상관관계가 인정되었다. 5. BAS-106과 NTN-821의 종자 처리에 의한 억제효과는 다비 조건에서는 제3엽기 이후에는 효과가 없었다.
본 연구에서는 먼저 14종의 flavonoid화합물을 대상으로 발암물질로서 잘 알려져있는 benzo(a)pyrene[B(a)P]에 대한 소핵생성억제효과를 관찰하였다. 소핵시험을 이용한 유전독성억제실험에서 비적적 큰 활성을 보이는 flavonoid는 2,3 이중결합과 3,5,7-trihydroxyl기를 갖는 polyhydroxy flavonol화합물들이었다. 이중에서 galangin은 활성이 비교적 컸으며, 이같은 유전독성억제효과는 galangin투여시 B(a)P의 대사활성화가 감소되고 활성본태산물들의 DNA binding을 저해함으로서 나타났다. 한편, galangin은 대사활성화가 필요없는 1차 발암물질인 N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine(MNNG)에 의한 소핵생성도 감소시켰다. 이러한 galangin의 alkylating agent에 대한 유전독성억제효과는 calf thymus DNA를 이용한 실험에서 DNA의 메칠화를 저해하는 기전으로 나타나는 것으로 판단되었다. galangin은 mitouycin과 같은 DNA cross-linking agent에 의한 소핵생성에도 억제효과를 나타내었다. 특히 동시투여(simultaneous treatment)나 사후투여(post-treatment)시보다 사전투여(pre-treatment)시에 소핵생성억제효과가 컸으며 사전연속투여(multiple Pre-treatment)시에는 낮은 용량에서도 효과가 컸다. 이러한 저용량의 사전연용투여에 의한 유전독성억제효과들은 B(a)P나 MNNG에 대해서도 잘 나타났다.
상황(Phellinus linteus) 및 아가리쿠스(Agaricus blazei Murill) 버섯으로부터 얻어진 메탄올 추출물과 이들 용매분획물에 대하여 마우스의 골수세포를 이용한 소핵 실험을 행하여 MNNG에 대한 유전독성 억제효과를 실험 하였다. 상황버섯 메탄올 추출물은 MNNG에 의한 소핵생성에 대하여 10.6~75.6%의 억제효과를 나타내었다. 또한 각각의 분획물의 경우 80mg/kg에서 에틸 아세테이트, 디에틸에케르, 부탄올, 클로로포름 그리고 물층이 각각 81.3,78.1,75.6,72.4 그리고 63.4%의 유전독성 억제 효과를 나타내었다. 아가리쿠스버섯 메탄올 추출물의 유전 독성 억제효과에서 양성대조군에 비하여 80mg/kg 투여시 86.2%의 억제효과를 나타내었으며, 디엘티에테르, 에틸 아세테이트, 클로로포름, 부탄올 그리고 물층 분획물의 경우 80mg/kg 투여시 86.2,81.3,78.1,69.9 및 61.8%의 억제효과를 나타내었다. 이상의 연구 결과에서와 같이 상황버섯과 아가리쿠스버섯의 추출물과 분획물들은 높은 유전독성억제효과를 나타냄으로서 건강식품으로서의 개발과 고부가가치의 의약품으로서 개발가능성을 가진 대단히 유용한 버섯임을 알 수 있었고, 다음 단계의 실험으로 이러한 생리활성을 나타내는 부분만을 분리, 정제하여 추가적인 검색 및 활용방안에 대하여 충분한 연구가 이루어져야 한다고 사료된다.
생체내 부정적 영향을 미치는 물질로 알려진 과산화지질의 생성을 억제하는 물질로서 지질대사 개선작용, 간보호작용, 혈소판응집능 억제작용 등 생체내 지질과산화 현상과 밀접한 상관성을 가지고 있을 것으로 사료되는 일련의 생리활성이 확인되었으나 아직 항 과산화지질 활성이 검토 보고된 바 없는 Brazilin 및 그 hydroxy 유도체인 hematoxylin을 대상으로 생체내 지질과산화 유도제로 $CCl_4$와 ethanol을 사용하여 지질과산화 억제효능 및 in vitro에서의 효소적, 비효소적 지질과산화에 대한 억제효능을 검토하였다. Brazilin 및 hematoxylin이 $CCl_4$로 유도된 과산화지질의 억제효과를 보면 간 homogenate에서 각각 90%, 94%, mitochondria 분획에서 각각 68%, 82%, microsome 분획에서 각각 65%, 81%의 억제효과를 보였다. 이에 반해 혈장에서의 억제효과는 각각 37%, 68%로 간에서 낮은 억제효과를 나타내었으나 이 두 물질은 간 뿐만 아니라 혈장에서도 과산화지질 억제효과가 유의성 있게 나타났다. Ethanol로 유도된 과산화지질의 억제효과를 보면 간 homogenate에서 각각 93%, 99.8%, mitochondria 분획에서 각각 74%, 98%, microsome 분획의 경우 각각 70%, 94%의 효과를 보였다. 이에 반해 혈장에서의 억제효과는 Brazilin 및 Hematoxylin이 각각 43%, 80%로 나타났다. 간조직중에서는 Brazilin과 Hematoxylin이 유사한 수준의 지질과산화 억제활성을 나타내고 있으나 혈장 과산화지질치는 현저한 차이를 나타내고 있어 Brazilin과 Hematoxylin은 간으로부터 혈액중으로의 지질의 방출에 상이한 정도로 영향을 미치거나 순환지질 기질의 보호에 의한 지질과산화 억제효과에 차가 있거나 혹은 두 가지 인자의 복합적인 작용에 의한 것으로 추정할 수 있다. 세포하수준에서의 항 지질과산화 활성을 알아보기 위해 실시한 간 misosome 및 mitochondria 분획에 대해 검토해 본 결과 양분획 모두에서 Hematoxylin이 Brazilin보다 강한 항산화 활성을 나타내었고 저지율은 양분획에서 유사한 수준이었다. Brazilin 및 hematoxylin이 효소적 지질과산화 반응인 NADPH 유도 지질과산화 반응에 미치는 영향을 검토한 결과 Brazilin의 경우 88.5%, Hematoxylin의 경우 91.0% 억제효과를 나타내었고 비효소적 지질과산화 반응인 ascorbate 유도 지질과산화 반응에서도 Brazilin이 75.7%, Hematoxylin이 81.9%의 지질과산화 억제효과를 나타내었다. 위의 결과에서 지질과산화 억제효과는 주로 자체의 항산화 작용에 의하나 microsome 약물대사활성에 의한 효소적 과산화 현상에도 억제작용이 있는 것으로 추정된다.
본 연구는 널리 알려져 있는 항산화제들의 세포 수준에서의 anti-oxidative stress 효과 및 그 기작을 알아보기 위한 연구이다. 연구에 사용한 항산화제로는 지용성인 retinol, $\alpha$-tocopherol, propyl gallate(PG) 및 butylated hydroxy toluene(BHT)과 수용성인 ascorbic acid, $\alpha$-glucosyl rutin 및 green tea extract를 사용하였으며 이들 항산화제들의 시간별 세포 생존율을 NR assay 로 측정한 후 적정 농도에서 DCFH-DA(2', 7'-dichlorofluorescin-diacetate) 를 이용하여 항산화제들의 anti-oxidative stress 억제 효과를 시간별로 측정하였다. 또한 이들 항산화제의 항산화 기작을 알아보기 위하여 NBT(Nitro-blue-tetrazolium) 및 DPPH(Diphenyl-picry-hydrazl)도 병행하여 실시하였다. Anti-oxidative stress 실험에서 지용성 항산화제들은 전반적으로 수용성 항산화제에 비하여 세포에 대한 독성이 상대적으로 강하여 retinol 의 경우에는 0.01%에서 oxidative stress 억제 효과를 관할할 수 있었으며 1 시간경과 후 측정시 53.1%의 억제 효과를 보여 주었다. PG 의 경우에는 0.1%에서 2 시간 경과 후 측정시 50%의 oxidative stress 억제 효과를 보여주었다. 수용성 항산화제인 green tea extract 및 $\alpha$-glucosyl rutin의 경우에는 1%에서 1시간 경과 후 측정시 각 각 51.6% 및 69.7%의 oxidative stress 억제 효과를 관찰할 수 있었다. 또한 시료처리 후 자외선 조사시 oxidative stress 억제 효과의 경우 수용성 항산화제인 ascorbic acid, $\alpha$-glucosyl rutin 및 green tea extract 와 지용성 항산화제 중에서는 $\delta$-tocopherol 에서만 oxidative stress 억제 효과가 관찰되었으나 자외선을 조사 하지 않았을 때 보다 약 20%-40%까지 억제 효과가 감소되었다. 그리고 PG 및 retinol 의 경우에는 자외선 조사시 독성이 증가하여 oxidative stress 억제 효과를 측정할 수 없었다. NBT실험에서 $\alpha$-glucosyl rutin, $\alpha$-tocopherol 및 PG 1%에서 70%이상의 superoxide anion 생성 억제 효과를 보였으며 DPPH 실험에서는 ascorbic acid 와 PG 1%에서 98%의 hydroxyl radical 생성 억제 효과를 보여 주었다. 본 실험을 통하여 BHT 를 제외하고 전반적으로 세포 수준에서의 oxidative stress 에 대한 억제 효과를 확인해 볼 수 있었으며 특히 수용성 항산화제들에서 두드러진 효과를 보여 주었다.
일부(一部) 식품항산화제(食品抗酸化劑)를 주로하는 항산화제(抗酸化劑)들, 즉 BHA, BHT, PG, ${\alpha}-tocopherol$, ascorbic acid (As.A), pyrogallol, 및 antage 3C를 식용대두유(食用大豆油)에 각각(各各) 0.05%의 농도(濃度) 첨가(添加)하여, 일사광선조사(日射光線照射) 조건하(條件下) 및 암소저장(暗所貯藏) 조건하(條件下) $(45.0{\pm}0.5^{\circ}C)$에서의 이들 항산화제(抗酸化劑)의 식용대두유(食用大豆油)에 대한 과산화물형성(過酸化物形成) 억제효과와 유리지방산형성(遊離脂肪酸形成) 억제효과를 비교(比較) 검토(檢討)하였다. 암소저장(暗所貯藏) 조건하(條件下)에서 저장(貯藏)할 때는 ${\alpha}-tocopherol$ 을 제외(除外)한 다른 항산화제(抗酸化劑)들은 비교적 강(强)한 과산화물형성(過酸化物形成) 억제효과를 보였으며, 특히 PG, BHT, antage 3C, As.A 등의 억제효과는 매우 강(强)하였다. 일사광선조사(日射光線照射) 조건하(條件下)에서도 BHT, PG 등은 강(强)하고 지속적(持續的)인 효과를 나타냈었다. 한편 동일조건하(同一條件下)에서의 pyrogallol, antage 3C의 억제효과는 BHA, BHT, PG 등의 식품항산화제(食品抗酸化劑)의 효과를 훨씬 능가하였었다. ${\alpha}-Tocopherol$의 억제효과는 상기의 두 조건하(條件下)에서 다 같이 저장일수(貯藏日數)가 경과(經過)함에 따라 급속(急速)히 상실(喪失)되었다. 일반적(一般的)으로 암소저장조건하(暗所貯藏條件下)에서의 각(各) 항산화제(抗酸化劑)의 과산화물형성(過酸化物形成) 억제효과는 일사광선조사(日射光線照射) 조건하(條件下)에서보다 훨씬 더 효과적인 듯하였다. 각(各) 항산화제(抗酸化劑)의 유리지방산형성(遊離脂肪酸形成) 억제효과는 암소저장(暗所貯藏) 조건하(條件下)에서 더 강력(强力)하고 효과적인 듯하였다. 특히 pyrogallol 은 상기의 두 조건하(條件下)에서 다 같이 강력(强力)한 억제효과를 보여주었다. 또한 모든 항산화제(抗酸化劑)의 일사광선조사(日射光線照射) 조건하(條件下)에서의 유리지방산형성(遊離脂肪酸形成) 억제효과는 동일조건하(同一條件下)에서의 과산화물형성(過酸化物形成) 억제효과와 비교할 때 매우 현저하였다.
고혈압 치료제의 하나로 사용되고 있는 Angiotensin Converting Enzymc (ACE) 억제제를 본 실험실에서 개발한 $\alpha$-hydroxy ketomethylene isostere를 핵심요소로 하여 합성하였다. 합성한 억제제 후보물질의 억제효과는 Rabbit Ling으로 부터 단리된 ACE를 사용하여 분광학적인 방법에 의해 결정되었다. 화합물 1은 우수한 억제효과를 나타내었다.
여러 가지 생약재와 녹용이 첨가되어 보혈 강장제, 활력강화 및 성장촉진 효과가 있는 전통 한약탕제인 녹용대보탕에 대하여 in vitro에 의한 전자 공여작용과 지질과산화 억제효과 등의 항산화 활성과 아질산염 소거효과, tyrosinase 억제효과 그리고 혈소판 응집 억제활성 등을 분석하였다. 본 실험에서 사용한 한약탕제의 총 페놀함량은 151.3$\pm$2.6 mg%로 확인되었으며, 80.9%의 전자 공여효과를 나타냈다. 리놀레산을 이용한 지질과산화 억제효과는 88.1%로 나타났으며, pH에 따른 아질산염 소거효과를 비교 검토한 결과 시료의 아질산염 소거 효과는 산성 pH에서 70%정도의 활성을 나타냈으며 pH 1.2에서 가장 높고, pH 6.0에서 가장 낮은 소거효과를 나타내 pH가 높아질수록 그 활성이 낮았다. Tyrosinase 억제효과는 80%이상으로 나타났으며, SD rat의 혈소판을 ADP로 자극하였을 때 일어나는 혈소판 응집 에 대한 저해활성을 측정한 결과 약30%의 혈소판 응집 억제효과를 보였다. 또한 이들 억제효과는 농도 의존적으로 일어남을 알 수 있었다.
각 균주에 대하여 씀바귀 분말 시료들이 독성을 나타내지 않는 범위에서 강력한 발암물질로써 직접 변이원으로 사용된 $MNNG(0.4{\mu}g/plate)$의 경우 S. typhymurium TA100 균주에서 시료농도 $100{\mu}g/plate$에서 메탄올 추출물이 84.51%로 가장 높은 억제효과가 나타났으며, $4NQO(0.15{\mu}g/plate)$에 대한 S. typhymurium TA98 균주에서 시료농도 $100{\mu}g/plate$에서는 물 분획물이 86.73%로 가장 높은 억제효과를 나타내었다 또한, TA100균주의 경우에는 부탄올 분획물에서 88.93%로 가장 높은 억제효과를 나타내었다. 간접변이원인 B(a)P를 사용한 실험에서 TA98 균주에서는 메탄올 추출물이 86.98%로 가장 높은 억제효과를 보였으며, TA100 균주에서는 부탄올 분획물이 75.35%로 가장 높은 억제효과를 나타냈다. 암세포주(A549, Hep3B, MCF-7)에 대한 씀바귀 분말의 증식 억제효과를 알아보기 위하여 실험한 결과, 폐암세포주인 A549세포에서는 핵산 분획물$(500{\mu}g/ml)$이 87.91%로 가장 높은 억제효과를 나타내었으며, 간암 세포주인 Hep3B 에서는 핵산 분획물$(375{\mu}g/ml)$이 70.64%로 가장 높은 억제효과를 나타냈다. 유방암 세포주인 MCF-7에서도 핵산 분획물$(375{\mu}g/ml)$이 82.89%로 가장 높은 억제효과를 보였으며, 인간 정상 간세포 293에 대해서는 24% 이하의 생육억제율을 보였다. 이는 암세포주에 대한 높은 억제효과에 비해 정상세포에 대해서는 비교적 낮은 증식 억제효과를 나타냄을 알 수 있었다.
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[게시일 2004년 10월 1일]
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