병윈성 비브리오균의 병원인자에는 hemolysin, protease, phospholipase A2, siderophore 외에도 콜레라균 만이 생산하는 cholera toxin 등이 있다. 이 중에서도 대부분의 병원성 비브리오균에서 생성되는 대표적인 인자는 hemolysin과 protease로 알려져 있다. Hemolysin은 혈액을 분해하는 독소로서 병원성 비브리오균의 분리ㆍ동정에 널리 이용 되고 있다. Hemolysin은 균의 배양초기에서 부터 서서히 생성되기 시작하여 대수증식기 말에 최대의 활성을 나타내며 안정기에 접어들면서 활성이 급격히 감소되는 것으로 보고되고 있다 (Kim et al., 1997). (중략)
비브리오균은 현재까지 약 30여종이 알려져 있는 그람음성의 종속영양세균으로, 이 중 12종이 사람에게 질병을 일으킨다고 보고되고 있으며, 우리 나라에서 문제가 종종 발생하는 비브리오균은 패혈증 비브리오, 장염 비브리오 그리고 V.cholerae non-O1을 들 수가 있다. V. cholerae O1과 형태학적, 생화학적, 생물학적 성상은 일치하지만, 콜레라균의 항혈청에는 응집하지 않는 일군의 세균을 V. cholerae non-O1이라고 부른다. (중략)
비브리오균(Vibrio vulnificus)은 심각하고 치명적인 감염을 일으킬 수 있는 호염성의 식중독균이지만, 숙주세포 내에서 염증반응을 일으키는 분자적 기작은 아직 잘 알려지지 않았다. 본 연구에서는 오염된 식품 섭취를 통해 유입되는 비브리오균의 소장 특이적 염증 반응 위치와 기작을 알아보기 위해, 7주령의 수컷 마우스에 비브리오균($1{\times}10^9CFU$)을 16시간 동안 경구 투여하였다. 그 결과 비브리오균은 주로 회장(ileum) 부위에서 비브리오균(WT) 수가 가장 많이 증가하였고, 공장(Jejunum), 근위부대장(proximal colon), 원위부 대장(distal colon)에도 유의적으로 군집현성이 이루어짐을 알 수 있었지만, 십이지장(duodenum)과 비장(spleen), 그리고 간(liver) 조직들에서는 관찰되지 않았다. 특히 비브리오균의 표적기관인 회장상피조직에서는 비브리오균(WT)이 침입 시 융모 안으로 다량의 염증세포들이 유입되었고, 융포의 폭이 넓어지고 길이가 짧아지는 전형적인 조직학적 염증 반응을 보여주었다. 비브리오균이 유도한 조직 특이적 염증반응기작을 알아보기 위해, 비브리오에 감염된 회장상피조직으로부터 단백질과 mRNA를 분리하였다. 비브리오균은 숙주세포의 중추적 신호전달 단백질인 protein kinase C (PKC)의 인산화 및 $PKC{\alpha}$의 세포막이동을 촉진시켰고, mitogen-activated protein kinase (MAPK) 중 extracellular signal-regulated kinases (ERK)와 c-Jun N-terminal kinases (JNK)의 인산화를 유도하였지만, p38 MAPK 인산화에는 영향을 미치지 않았다. 특히 비브리오균은 inhibitory factor-kappa B (I-${\kappa}B$)의 활성을 촉진시킴으로써 nuclear factor-kappa B (NF-${\kappa}B$)의 인산화를 유도하였다. 마지막으로 비브리오균(WT)에 감염된 회장의 경우, 정상마우스에 비해 염증성 cytokine인 interleukin (IL)-6, IL-8, tumor necrosis factor (TNF)-${\alpha}$의 mRNA 수준이 유의적으로 증가되었다. 염증매개 수용체인 toll like receptor (TLR)-4, TLR-5, TLR-9의 mRNA의 발현 또한 비브리오균 처리에 의해 증가되어 있음이 관찰되었다. 종합적으로 오염된 식품 섭취를 통해 유입되는 비브리오균은 회장상피세포를 표적으로 염증반응을 일으키며, 그 기작은 PKC, ERK1/2, 그리고 JNK의 인산화를 통한 NF-${\kappa}B$ 활성의 촉진이며, 이로 인한 다양한 염증 매개 단백질 발현의 증가를 통해 이루어진다고 할 수 있다.
장염비브리오균은 급성 설사와 같이 수인성·식품매개 질병을 일으키는 것으로 알려져 있다. 본 연구에서는 제주지역 해수, 수족관수, 유통 수산물에서 분리한 장염비브리오균을 real-time PCR을 이용하여 잠재적인 독소 유전자 또는 종특이성 유전자(tdh, trh, tlh, toxR)를 조사하고, 이 균주의 유전적인 특성을 PFGE로 분석하였다. 총 245개 시료 중 해수에서 33주, 수족관수에서 7주, 수산물에서 50주로 90주(36.7%)의 장염비브리오균을 분리하였다. 모든 장염비브리오균에서 tdh 유전자는 검출되지 않았지만, tlh 유전자 또는 toxR 유전자는 검출되었다. 또한, 해수에서 3주와 수산물에서 1주 분리된 균주에서 trh 유전자가 검출되었다. 매달 해수를 정량검사한 결과 장염비브리오균은 수온과 양의 상관관계를 가지고 있었다. 90주의 장염비브리오균은 64.0-97.3% 범위에서 유사한 유전자 상동성을 보였다. 이중에서 13개 유형에서 유전자 상동성이 100%였다. 이러한 결과는 일부 독소 유전자를 가진 장염비브리오균이 분리되었고, 해수, 수족관물, 유통 수산물에서 분리된 장염비브리오균 사이에 유전적 유사성이 있기 때문에 식중독 역학조사에 도움이 되도록 지속적인 모니터링이 필요함을 나타낸다.
비브리오패혈증균은 세계에서 치사율이 50%에 달하는 가장 치명적인 수인성식품매개 병원균으로 해수에서 흔히 있으며, 특히 따뜻한 계절에 발생한다. 본 연구는 제주도의 해수, 유통 수산물, 수족관물에서 분리한 비브리오패혈증균에 대해서 RT-PCR을 이용한 독소 유전자, Vitek을 이용한 항생제 내성, PFGE를 이용한 유전적 특성을 조사하였다. 총 487개의 시료를 조사한 결과 비브리오패혈증균 46주(중복 균주 포함)가 해수에서 44주, 유통수산물에서 1주, 수족관물에서 1주 분리되었다. rtxA, viu와 같은 독소 유전자는 각각 8주(17.4%), 9주(19.6%) 검출되었고, vvhA와 같은 독소 유전자는 모든 균주에서 검출되었다. 항생제 내성 실험결과 cefoxitin 항상제에 대해서 100% 내성이 나타났다. 비브리오패혈증균 46주에 대한 PFGE 분석 결과 총 6유형이 100% 상동성을 보였고, 유사도는 81.3-98.0%로 나타났다. 수산물과 수족관물에서 분리된 비브리오패혈증균은 해수와의 상동성 결과 유사도는 불일치로 나타났고 지역과 시료 사이에는 유사성이 없었다. 독소 유전자를 가진 비브리오패혈증균에 의한 식중독 환자가 제주도에서 발생한 점을 고려해볼 때, 해수, 유통 수산물, 수족관물에서 분리한 비브리오패혈증균에 대한 모니터링이 지속되어야 할 것으로 보인다.
넙치, 방어 어류 2종과 가리비, 참굴 패류 2종에 수산식품의 주요 식중독균인 장염비브리오균(V. parahaemolyticus)을 인위적으로 오염시킨 후, 강산성차아염소산수와 미산성차아염소산수의 살균효과를 조사한 결과를 요약하면 다음과 같다. 넙치에 장염비브리오균을 인위적으로 오염시킨 후, 강산성차아염소산수 및 미산성차아염소산수 공히 10배의 양으로 세정한 결과, 약 4.0 log가 감소하였으며, 30배의 양으로 세정한 경우, 검출한계 이하로 나타나 강력한 살균효과가 있는 것을 확인하였으며 방어에 있어서도 넙치와 비슷한 결과를 확인하였다. 가리비에 장염비브리오균을 인위적으로 오염시킨 후, 강산성차아염소산수 및 미산성차아염소산수 공히 10배의 양으로 세정한 결과, 약 4.2 log가 감소하였으며, 30배의 양으로 세정한 경우에는 장염비브리오균이 검출되지 않아 강력한 살균효과를 나타내었다. 참굴에 장염비브리오균을 인위적으로 오염시킨 후, 강산성차아염소산수 및 미산성차아염소산수 공히 10배의 양으로 세정한 결과, 약 3.8 log가 감소하였으며, 30배의 양으로 세정한 경우, 7.0 log가 감소하여, 강력한 살균효과가 있는 것을 확인하였지만 넙치, 방어, 가리비에 비해서는 살균효과가 다소 낮게 나타났다. 어류 근육이나 가리비에 비해 참굴에 오염된 장염비브리오균에 대한 차아염소산수의 살균효과가 다소 떨어지는 것은 참굴의 표면 구조의 복잡성 때문인 것으로 판단된다.
본 연구에서 소비-섭취 시나리오와 온도-시간의 장염비브리오 생육모델을 활용하여 국내 생굴의 병원성 장염 비브리오균의 위해평가를 실시하였다. 장염 비브리오균의 오염 수준 및 병원성 인자 데이터를 활용하였으며, 국민건강영양조사와 농촌진흥청의 표준레시피를 활용하여 섭취량을 조사하였고 용량반응관계는 Beta-Poisson모델을 활용하였다. 국내 소비자가 생굴을 섭취할 때 병원성 장염 비브리오균으로 발생하는 위해는 식중독이 주로 발생하는 4월, 10월, 11월에 $5.71{\times}10^{-5}$ (5퍼센타일 $2.71{\times}10^{-8}$, 95퍼센타일 $1.03{\times}10^{-4}$로 추정되었다. 본 연구에서 생굴의 장염비브리오 위해의 영향인자는 소비시점 생굴의 장염비브리오균의 오염수준, 생굴 섭취량, 병원성 인자(tdh or trh 유전자)의 존재 여부, 상온의 노출온도 및 시간으로 나타났으며 위해관리방안을 제시하였다.
생선회에 사용되는 선어육중에 오염된 장염비브리오균이 저장온도와 시간에 따른 균의 증감정도를 파악하여 식중독 예방대책에 필요한 기초자료를 얻고자 가다랭이와 방어의 마쇄육에 Kanagawa현상 양성인 장염비브리오균을 접종하여 $30^{\circ}C,\;18^{\circ}C,\;4^{\circ}C$ 및 $-20^{\circ}C$에서 24시간 저장하면서 매 2시간마다 균수의 변화를 실험한 결과는 다음과 같다. 1. 가다랭이나 방어의 마쇄육에 장염비브리오균을 접종하여 상온에 방치하여 두었을때 처음 2시간까지는 균수감소 경향을 나타내었으며 그 이후부터 급격한 균의 증식현상이 나타났다. 2. 생선 마쇄육에 장염비브리오균을 $10^3/g$ 정도 오염시켜 $18^{\circ}C$에 10시간정도 보관하여 두었을때 $10^4/g$ 정도로 증가하는데 반하여 $30^{\circ}C$에 같은 시간 보관하였을 경우에는 $10^6/g$인으로 증가하였다. 3. 장염비브리오균을 생선마쇄육에 오염시켜 $-20^{\circ}C$에서 24시간 저장했을 때에 약 $20\%$의 생잔율을 나타내었다. 4. 생선회를 $4^{\circ}C$ 냉장고에 보관했을에 4시간후에는 약 $10\%$ 감소하였고, 24시간 후에는 약 $50\%$ 감소하였다. 5. 용선회를 $4^{\circ}C$에 냉장보관할때 신선한 방어육에 오염된 장염비브리균이 동결해동한 가다랭이육에 오염된 경우 보다 균 감소율이 $10{\sim}15\%$정도 높았다.
장염비브리오균 검사에 있어서 검출방법에 따른 검출율은 차이를 알아보기 위하여 부산지방을 중심으로 해수 298개 시료, 112개 시료, 패류 169개 시료 어류 80개 시료 총 659개 시료를 단일 시험관을 사용하였을 때와 다수의 시험관을 사용하였을 때, 원시료 또는 일단계희석하였을 때의 검출율를 비교 실험한 자료를 분석 검토하여 그 결과를 요약하면 다음과 같다. 1. 해수에 있어서 10 ml를 접종 배양할 때에 장염비브리오균 음성인데도 같은 시료에서 1/100 는 1/1000로 희석한 시료에서 장염비브리오균 양성으로 나타나는 경우가 많았다. 이러한 현상은 이토, 패류, 어류에서도 같은 경향이었다. 2. 총 659개 시료 중에서 $52\%$에 해당하는 343개 시료가 장염비브리오균 양성으로 판정되었는데 이중희석하지 않은 시료에서 이 균이 검출된 것은 $22.5\%$인 149개 시료에 불과하였다. 시료별로 보면 해수는 $50\%$ 중 $24.5\%$, 이토의 경우는 $65.2\%$ 중 $28.6\%$, 패류에서는 $56.2\%$ 중 $22.5\%$에 불과하였다. 3. 최확수법에 의한 장염비브리오균 검출율은 단일희석법으로 측정했을 경우의 2배 이상이었다. 4. 3개 시험관을 사용한 최확수법에 있어서 제일 낮은 희석단계에서 양성으로 판정된 것은 $28.9\%$, 3개의 시험관 모두가 양성인 것은 $9.4\%$뿐이었다.
본 연구에서는 패혈증비브리오균에 대한 PEM, RCM, RRM과 CTM 메탄올 추출물의 항균 활성을 평가하였다. 96-well microplates를 사용한 액체 배양법 실험 결과 4가지 천연물은 200 ㎍/mL 농도에서 80%이상의 항균 효과를 나타내었다. 또한 페이퍼디스크 확산법을 사용하여 항균 활성을 평가한 결과 4가지 천연물은 20, 40 mg/disc의 농도에서 농도 의존적으로 패혈증비브리오균의 성장을 억제하였다. 다음으로 4가지 천연물의 안전성을 평가하기 위해 MTS assay를 통해 HeLa 세포에 대한 독성을 확인한 결과 100, 200 ㎍/mL의 농도에서 세포 독성을 나타내지 않았다. 또한 LDH assay를 사용하여 패혈증비브리오균의 HeLa 세포에 대한 세포막 손상 억제 효과를 평가한 결과 PEM, RCM, RRM과 CTM 메탄올 추출물은 200 ㎍/mL 농도에서 세포막 손상억제 효과를 나타내었다. 다음으로 바닷물과 조개를 사용한 수족관 모델에서 4가지 천연물의 메탄올 추출물 혼합액 200 ㎍/mL 농도는 colony 생성을 현저하게 감소시켜 패혈증비브리오균의 증식을 억제 하는 결과를 나타내었다. 이와 같은 결과를 통해 4가지 천연물의 메탄올 추출물은 바닷물과 해산물에 존재하는 패혈증비브리오균에 대해 뛰어난 항균효과를 나타내면서 인체에는 무해한 천연소독제로 응용할 수 있을 것으로 판단된다.
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[게시일 2004년 10월 1일]
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