계지에서 분리한 보체계 활성화 다당의 보체 활성화양식과 다당의 당쇄결합에 관하여 검토하였다. 계지 보체계 활성화 다당획분들(CC-IIIa, CC-IIIb, CC-IIIc)들은 정상인의 혈청중에 존재하는 주요 보체성분인 C3를 활성화하여 C3a와 C3b 보체 산물을 생성 시켰는데 이 과정은 anti-human C3를 이용한 면역전기영동을 실시하여 확인하였다. $Ca^{++}$ 유무시의 보체계 활성을 측정한 결과 계지에서 분리된 CC-IIIa-3는 고전적 경로(classical pathway)와 부경로(alternative pathway)를 동시에 활성화시킴을 확인하였다. CC-IIIa-3을 메틸화하여 GC/MS로 분석한 결과 비환원 말단의 galactopyranose와 glucopyranose가 확인되었고 1,2-linked rhamnopyranose, 1,6-linked mannopyranose, 1,3-linked glucopyranose, 1,6-linked galactopyranose 등이 확인되었다.
고추잎의 열수추출을 행하여 추출물의 보체계 활성을 측정한 결과 열수추출물에서 높은 항보체 활성이 나타나 고추잎의 열수추출물을 대상으로 활성 다당을 분리하여 특성을 조사하였다. 즉 열수추출물의 메탄을 환류, 에탄을 침전, 투석 및 동결건조를 통하여 고추일 600 g으로부터 186g의 조다당(CAL-0)을 얻었다. CAL-0는 당 51.8%, 산성당 8.2%, 단백질 16.8%를 함유하고 있었으며 주로 arabinose, glucose, galactose로 구성되어 있었다. 조다당 CAL-0는 pronase 처리에서 활성의 변화가 없었으나 과요오드산 산화에 의해서 급격히 활성이 감소하였다. 또한 CAL-0의 항보체 활성은 $Ca^{2+}$이온 존재 유무시의 항보체 활성과 교차면역 전기영동 결과 고전경로와 부경로를 통하여 보체계를 활성화하는 것이 관찰되었다. 이 조다당 CAL-0를 DEAE Sepharose CL-6B을 사용하여 0$\longrightarrow$1 M NaCl로 이온교환 크로마토그래피를 행하여 1개의 비흡착획분과 6개의 흡착획분을 얻었다. 이중 증류수(CAL-1)와 0.1 M NaCl에서 용출된 획분(CAL-2)이 다른 획분에 비해 높은 보체계 활성을 보였으며 활성 획 분들에서는 주로 arabinose, galactose, glucose가 다양한 비율의 몰비로 구성되어 있었다. CAL-2 획분은 Sepharose CL-6B의 gel filtration에서 고분자 peak와 저분자 peak로 분리되었으며 항보체 활성은 분자량 61,000 정도의 고분자 획분에서 높게 나타났다.
돈단독(豚丹毒)에 대한 돼지 항체(抗體)를 검출(檢出)할 수 있는 실용적(實用的)인 혈청학적(血淸學的) 방법(方法)은 아직까지 없다. 그리고 보체결합반응(補體結合反應)은 가장 우수(優秀)하고 예민(銳敏)한 혈청학적반응(血淸學的反應)이긴 하지만 돼지 혈청(血淸)이 항체(抗體)이면 면양적혈구항가토혈청(緬羊赤血球抗家兎血淸) 및 기니픽 보체(補體)로 구성되는 용혈계하(溶血系下)에서는 돼지 혈청(血淸)의 친보체작용(親補體作用) 때문에 보체결합반응(補體結合反應)이 불가능하다. 이 연구(硏究)에서는 정상가토혈청(正常家兎血淸)이나 다른 정상소(正常素)를 반응계(反應系)에 첨가하여 친보체작용(親補體作用)을 없애는 개량보체결합반응(改良補體結合反應)으로 돈단독(豚丹毒) 항체(抗體) 1 항원(抗原)의 특이적(特異的)인 결합(結合)을 가능하게 하였다. 즉, 1/2 단위(單位)의 항원(抗原), 2정확단위(正確單位)의 기니픽보체(補體), 2단위(單位), 2% 감작면양적혈구(感作緬羊赤血球) 그리고 0.04 ml의 가토정상소(家兎正常素)는 돈단독(豚丹毒) 항원일항체결합물(抗原一抗體結合物)에 보체(補體)가 특이적(特異的)으로 결합(結合)되게 하였다.
김치 및 발효유 제품으로부터 분리한 유산균과 공시균주 12종을 대상으로 보체 용혈 분석법을 이용하여 면역계에서 중요한 역할을 담당하고 있는 보체계 활성화(항보체 활성, $TCH_{50}$) 정도를 측정한 결과, 김치로 부터 분리한 Lactobacillus plantarum이 타 유산균 종에 비해 높은 활성을 나타내었다. 이들 균주로 부터 조제된 세포벽 획분의 경우 세포질 획분보다도 높은 활성을 보였으며 각 획분의 활성은 농도 의존적 경향을 나타내었다. L. plantarum의 세포질 획분과 세포벽 획분의 경우 pronase 소화 후에는 활성의 변화가 없는 반면, 과요오드산 처리에 의해서는 급격한 활성의 감소를 나타내는데 이들 결과로부터 L. plantarum의 세포질과 세포벽 획분에 의한 보체계 활성화가 주로 다당 영역에 기인함을 알수 있었다. 한편 anti-human C3를 이용한 2차원 면역전기영동에 의해, $Ca^{++}$ 이온을 제거한 상태에서도 세포질과 세포벽 획분에 의한 C3 활성화 산물을 동정할 수 있었다. 또한 L. plantarum의 세포벽 획분에 의한 항보체 활성은 동일 조건에서 활성을 유지한 반면, 세포질 획분에 의한 활성화 정도는 동일 조건에서 상당히 감소하였다. 이상의 결과로부터 L. plantarum 세포벽 획분의 보체계 활성화 양식은 주로 alternative pathway의 활성화에 의한 것이며, 세포질 획분에 의한 활성화는 classical pathway와 alternative pathway 양 경로를 경유함을 알 수 있었다.
현재 우리나라에서 시판되고 있는 대부분의 양조간장은 일본의 $koji$ 방식으로 제조되고 있는 반면, 재래식 조선간장은 자연적으로 미생물이 접종 및 발효된 메주를 이용하여 제조되고 있다. 본 연구는 일본식으로 만들어진 양조간장과 우리나라 전통방식으로 만들어진 재래식 조선간장으로부터 얻어진 다당의 특성과 면역증진활성을 비교하였다. 조선간장 유래 다당인 KTSP-0는 2-keto-3-deoxy-D-$manno$-2-octulosonic acid(KDO)(1.1%)의 구조를 가지는 rhamnogalacturonan II(RG-II)가 있음을 확인하였다. 양조간장 유래 다당 CSP-0와 KTSP-0의 보체계 활성화능을 측정한 결과 두 시료 모두 농도의존적으로 증가하는 보체계 활성을 가지고 있었으나, $1,000{\mu}g/mL$ 농도에서 KTSP-0는 64.7%, CSP-0는 56%의 활성을 나타내었다. C3의 보체계 활성 경로를 확인하기 위해 2차원 면역전기영동을 행하였다. 그 결과, CSP-0는 고전경로로만 보체계를 활성화 시키는 반면, KTSP-0는 고전경로와 부경로 모두를 통해 보체계를 활성화 시키는 것으로 나타났다. CSP-0와 KTSP-0는 비장 유래세포와 macrophage에 대한 세포독성이 없음이 확인되었으며, KTSP-0는 활성화된 복강유래 macrophage에서 IL-6는 $8-1,000{\mu}g/mL$의 비교적 넓은 범위에서, IL-12는 $40{\mu}g/mL$의 농도에서 cytokine의 분비를 증가시켰다. 본 연구를 통해 양조간장보다 조선간장이 보체계 활성화를 통해 높은 면역 증강 효과를 가지고 있는 것으로 확인되었다.
수막구균(Meningococcus) 질환은 보체계의 이상과 관련이 있을 수 있다. 보체 7번은 5개의 말단 보체 단백질(terminal complement protein) 중 하나로 이것이 결핍되면 보체의 세포를 용해하는 작용을 잃게 되어 반복적인 감염, 특히 수막구균 감염에 대한 감수성이 증가한다. 2003년 9월 고열, 하지 동통, 두통과 점상 출혈로 외래에 내원한 11세 된 여자 환자가 입원 후 급격히 혼수 상태로 빠졌으나 즉각적인 치료로 결국 완전히 회복되었다. 환자의 최종 진단은 수막구균성 패혈증과 관절염이었다. 환자의 오빠도 비슷한 세균성 뇌수막염 가족력이 있어 저자들은 보체계 검사와 유전자 돌연변이(gene mutation)에 대해 분석하였고, 환자와 환자의 오빠는 보체 7번 유전자의 exon 4에 G394C에 돌연변이가 있는 선천성 보체 7번 결핍 환자였고, 아빠는 보인자로 밝혀졌다. 저자들은 예방적으로 4가 수막구균 백신(tetravalent polysaccharide meningococcal vaccine, $Menomune^{(R)}$ A/C/Y/W-135, Aventis Pasteur, Canada)을 3년마다 접종하기로 하였고 2004년 10월에 처음으로 접종하였다. 그러나 2006년 9월 오빠는 급성 세균성 뇌수막염(meningoencephalitis)으로 사망하였다. 이에 저자들은 2년마다 예방적 접종을 하기로 하였고, 환자는 2008년 9월에 3번째로 접종하였으며 16세 된 환자는 현재까지 건강한 상태이다. 저자들은 수막구균 감염과 보체 7번 유전자 네번째 intron의 3' 말단 splice acceptor 위치에 G to T 돌연변이(g.IVS4-1G> T)가 있는 선천성 보체 7번 결핍을 가진 한국인 한 가족을 보고하는 바이다.
닭의 혈청으로 구성되는 항혈청과 이에 특이한 항원과의 결합물에는 기니픽의 보체가 결합되지 못해서 직접보체결합반응이 불가능하다. 따라서 이 연구에서는 개량보체결합반응으로 아직 실현되지 못한 계두의 보체결합반응을 가능케 하였다. 이 연구에서 얻은 실험성적은 다음과 같다. (1) 계두의 개량보체결합반응에 관한 방법을 발전시켰다. (2) 계두독에 감염된 계태아의 장뇨막으로 만든 항원의 성상을 밝혔다. (3) 계두 및 구두독의 독주별 특이성과 닭에 있어서의 항체형성과정을 밝혔다.
계피나무의 어린가지인 계지의 열수추출물에서 높은 보체계 활성효과(항보체 활성)를 발견하여 대량으로 열수추출한 추출물(CC-O)에 대하여 메탄올 환류, 에탄올 침전, 투석, 동결건조를 실시하여 메탄올과 에탄올에 비가용성인 고분자 획분(CC-1)에서 증가된 활성을 보였다. 60.3%의 당과 32.8%의 단백질로 구성되어 있는 CC-1 획분에서 보체계 활성화 본체를 파악하기 위하여 pronase처리에 의한 단백질 분해 및 periodate를 이용한 다당부위를 선택적으로 산화시킨 후, 각각의 활성을 조사한 결과 pronase 처리한 CC-1에서는 보체계활성 효과를 그대로 유지한 반면, CC-1의 periodate 산화물은 CC-1에 비하여 활성이 50% 이하로 감소한 사실로부터 보체계 활성화 물질이 다당임을 확인하였다. CC-1을 양이온 계면 활성제인 cetavlon으로 처리 후 CC-2, CC-3, CC-4 및 CC-5의 4획분으로 분리하였으며 수율과 활성이 가장 높은 CC-2분획을 음이온 교환 수지인 DEAE-Toyopearl 650C column에 흡착시켜 비흡착획분(CC-2-1)과 7개의 흡착획분$(CC-2-II{\rightarrow}CC-2-VIII)$으로 분획하였다. 이 중 0.2 M NaCl로 용출된 CC-2-III 획분을 Sephadex G-100 및 Sepharose CL-6B 겔여과 크로마토그래피를 행하여 주요 활성다당체인 CC-2-IIIa-3를 최종적으로 정제하였다. HPLC상에서 거의 순수한 단일 peak로 확인된 CC-2-IIIa-3는 41.1%의 산성당을 함유하는 산성다당체로서 분자량은 240,000으로 확인되었다. CC-2-IIIa-3의 항보체 활성$(ITCH_{50})$은 1 ㎎/ml의 농도에서 대조군의 94%를 나타내었으며 구성당 조성은 arabinose, xylose, glucose, galactose, galacturonic acid 및 glucuronic acid가 5.56 : 3.77 : 1.87 : 1.00: 5.12 : 3.13의 비율로 존재하였다.
영지가 면역계에 미치는 영향을 살펴보기 위해, 국내에서 자생하는 자실체로부터 분리된 균사를 액내배양하여 얻은 균사체를 알칼리로 추출하였다. 영지의 알칼리 추출물은 in vitro에서 alternative 경로는 물론 classical 경로에 의해 보체계를 활성화시켰으며, 알칼리 추출물에 의해 활성화된 C3는 면역전기영동에서도 확인 되었다. 또한, 영지의 알칼리추출물은 mouse의 망내계에 존재하는 macrophage를 활성화 시켜 이물질인 carbon에 대한 탐식기능을 증진시켰으며, 항체생산을 자극하여 mouse의 용혈반 형성세포수를 증가시킴을 알 수 있었다. 알칼리 추출물의 성분을 분석한 결과, 당 10%와 단백질 58%로 4종의 단당류와 16종의 아미노산으로 이루어진 단백다당류로 추정되었다.
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[게시일 2004년 10월 1일]
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