식물조직배양기술을 이용하여 인삼 root를 생산하고자, 식물생장조절물질로 유도된 인삼 root를 사용하여 최적액체배양조건을 RSM을 이용하여 조사하였다. 최적액체배양조건을 배지의 pH, sucrose 농도, nitrogen 농도, phosphate 농도의 3 level-4factor의 fractional factorial design에 의하여 조사한 결과, 인삼 root의 생장율은 최저 1.00g에서 최고 2.33g까지 나타났다. 다중회기분석으로 구한 model식을 가지고 등고분석과 3차원분석을 수행한 후 독립변수의 최저 또는 최고수준에서 조속변수가 최대치를 나타내지 않는 배지의 pH와 sucrose농도의 변수에 대하여 model식을 편미분한 결과 인삼 root의 최적액체배양조건은 pH5.6, sucrose 3.8%, nitrogen 50mg/L, phosphate 80.7mg/L로 예측되었다. 이렇게 결정된최적조건값들을 model식에 대입하여 얻은 예상치는 2.36g 이었다.
본 연구는 통성 혐기성 미생물인 K. pneumoniae DSM4799을 이용하여 순수 글리세롤과 국내 바이오디젤 생산공정에서 발생된 폐글리세롤로부터 1,3-PD을 생산하기 위한 연구로서, 혐기 및 호기 조건, 배양온도, 글리세롤 농도, pH에 따른 1,3-PD 생산성 비교를 통해 최적 배양조건을 찾고자 하였다. K. pneumoniae DSM4799를 혐기조건과 호기/혐기 2단계 배양을 한 결과, 혐기조건에서 더 효율적인 1,3-PD 생산이 이루어졌다. 배양 온도를 $26{\sim}37^{\circ}C$로 변화시키면서 배양한 결과, $30{\sim}33^{\circ}C$에서 높은 1,3-PD 생산성을 나타내었고, 글리세롤 농도는 글리세롤의 종류에 상관없이 60 g/L 이상에서 균주의 성장 및 1,3-PD 생산이 저해되는 현상을 관찰할 수 있었다. 폐글리세롤 사용시 순수 글리세롤에 비해 초기 1,3-PD 생산은 감소하였으나, 48시간 후에는 오히려 더 높은 농도의 1,3-PD를 생산하였다. 유가식 배양으로 글리세롤 농도를 40 g/L 이하로 조절하면서 pH 조절유무에 따른 1,3-PD 및 부산물의 변화를 살펴본 결과, pH를 7.0으로 유지시켰을 때 pH 조절을 하지 않은 경우보다 25% 향상된 1,3-PD 수율을 나타내었다(0.56 g/g vs. 0.45 g/g). 본 연구를 통해 K. pneumoniae DSM4799를 이용하여 1,3-PD 생산시 혐기조건, 온도 $30^{\circ}C$, 순수 또는 폐글리세롤 40 g/L 이하, pH 조절 등의 배양조건이 적합함을 알 수 있었으며, 최적화된 배양조건을 통해 보다 가격경쟁력이 있는 생물학적 1,3-PD 생산이 가능할 것으로 기대된다.
`Ailsa Craig` 토마토 품종의 기내배양시 신초재분화의 최적조건을 밝히고자 실험하였다. 본 실험에서 캘러스 형성 및 신초 재분화에 사용된 배지조성은 6가지 조건으로 하였다. 기본 MS 배지에 zeatin 2 mg/l, zeatin 2 mg/l+IAA 0.1 mg/l, zeatin 2 mg/l+IAA 0.5 mg/l, zeatin 4 mg/l, 4 mg/l+IAA 0.1 mg/l, zeatin 4 mg/l+1AA 0.5 mg/l을 첨가하여 캘러스 및 신초 재분화율의 조건별 차이를 살펴 보았다. 그 결과 zeatin 2 mg/l를 단독 배양한 조건에서 신초 재분화율이 가장 양호하였으며, 캘러스 형성률에 있어서는 큰 타이를 보여주지 못했다. 또한 조건별로 기내상태에 있는 캘러스의 형태적인 차이를 살펴보기 위하여 SEM을 이용하여 관찰하였다. 캘러스 조직의 표면을 관찰한 결과, zeatin 2 mg/l를 단독 배양한 조건에서 완전한 신초로 재분화 하기 위한 구형의 모형이 관찰되었으며, 나머지 조건의 캘러스는 쭈글쭈글한 형태의 캘러스가 확인되었다. 이 같은 결과들로 볼 때, 토마토 'Ailsa Craig'의 조직배양시 캘러스 모양이 찌그러지지 않는 완전한 구형의 캘러스 상태에서 신초재분화율이 더 높아지는 것으로 나타났다.
본 연구에서는 울릉도에서 수집한 자생 버섯 균주 5종의 평판배지 배양 특성과 액체배양에서의 특성을 확인하여 자생 균류의 이용을 위한 기초 정보를 확보하였다. 5종의 야생 균주의 최적 배양온도는 25-30℃이고, pH는 4.0-5.0의 산성임을 확인하였다. 특히P. brumalis는 35℃에서 생장 속도가 가장 빠른 것으로 보아 고온성 버섯으로 판단된다. 실험에 사용한 상용 배지 중 최적 배지는 F. punctata의 경우 MEPA 배지, P. ulleungus는 MMNA 배지, G. subnudus는 MEA 배지, T. kmetii는 MMNA 배지, 마지막으로P. brumalis는 모든 배지에서 빠른 생장 속도를 보였으며 6종류의 배지 중 MEA 배지는 모든 균주의 균사 밀도가 낮아 배양이 적합하지 않은 조성임을 확인하였다. P. brumalis는 5종의 균주중 가장 빠른 생육 속도를 보였으며, 반면에P. ulleungus는 가장 저조한 생장을 보여 같은 속(genus)의 종이지만, 생육특성의 차이가 극명함을 보였다. 액체배양을 통해 배양 기간에 따른 배양여액의 건조 중량을 비교한 결과 배양 기간이 길수록 건조량이 감소하는 양상을 보였으며, 특히 6개월 이전까지 큰 폭으로 감소하였다. 이 결과로 정치배양 조건에서의 액체배양은 한달 이상의 배양 시간이 주어져야만 배지 성분을 충분히 이용할 수 있다는 것을 확인하였다. 본 실험의 결과로 5종의 균주에 대한 최적 배양조건을 확립하고 향후 응용 연구에 기초 자료로 활용할 수 있을 것으로 기대한다.
도열병균(Pyricularia oryzae) 균사체의 esterase 동위효소 pattern이 배양조건에 의하여 변화되는가를 $10\~25\%$ polyacrylamide gradient slab gel을 사용하여 알아보았다. 배양기간에 따라 배양 24일까지 동위효소 pattern은 변하지 않았지만 특징 band의 효소량에는 차이가 있었다. 탄소원(glucose, fructose, maltose, sucrose, starch), 단포자분리균주간, 계대배양 및 세포벽재생균주간의 동위효소 pattern은 변함이 없었다.
형질 전환된 담배 seed에서 담배 식물체를 유도하여 White 액체 배지에서 기관 배양하였다. 암조건, sucrose 2%의 조건에서 좋은 growth pattern을 나타내었고, 계대 배양은 외마디법을 이용하여 2주마다 하였다. 기관 배양에서 hGM-CSF production pattern을 보면, intracellular에서는 큰 변화 없이 약 30 ng/g의 일정한 농도를 나타내었다. Extracellular에서 hGM-CSF 농도는 배양 6일 이후부터 급속하게 증가하기 시작하여 배양 12일째에 약 0.2ng/$m\ell$의 농도를 나타낸다. 기관배양은 다른 식물세포 배양 시스템에 비해 생산되어진 단백질의 안정성이 크다는 장점에 비해 세포 내에서 배지 내로의 단백질 분비가 적다는 단점이 있다. 이를 극복하기 위해 다양한 permeabilizing agents를 투여하여 담배 세포의 permeability를 증가시키고자 하였다. 그 결과, Pluronic F-68과 PEG8000을 첨가한 경우 담배 세포에서 배지 내로의 단백질 분비가 원활해졌음을 확인할 수 있었다.
Pleurotus sajor-caju를 각각 다른 영양원과 배양조건에 따라 배양했을 때 항보체 활성 다당 생산에 미치는 영향을 검토하였다. 그 결과 탄소원으로는 배양액에서는 lactose를 탄소원으로, 균사체로 부터의 열수 추출시에는 탄소원을 maltose로 사용했을 때 가장 높은 항보체 활성 다당을 얻을 수 있었다. 질소원으로는 ammonium phosphate(monobasic), amino acid로는 serine을 배양원으로 하였을 때 활성이 최대치를 나타내었다. 온도조건에서는 $25^{\circ}C$에서 최대활성을 나타내었으며 생산된 다당의 조성을 분석한 결과 Pleurotus sajor-caju의 배양액에서 분리한 다당은 peptidoglycan으로 나타났다.
Lactobacillus helveticus YM-1 과 Streptococcus thermophilus CH-1을 환원탈지유 배지에 접종하여 생육특성 및 배양조건을 검토한 결과 두 균은 전형적인 공생을 나타냈으며 혼합배양시 최적 pH와 온도는 각각 6.5와 4$0^{\circ}C$였다. 또한 두 균 사이에는 단백질 분해력의 차이가 현저하였고 L.helveticus의 배양여액에는 S. thermophilus의 생육을 촉진시키는 물질이 함유되어 있음을 관찰하였다.
본 연구에서는 Aspergillus niger 유래 TG의 최적 생산 조건을 연구하기 위해, A. niger 6 종을 이용하여 감자전분 1.5%, 효모추출물 1.0%, $KH_2PO_4$ 0.1%, 40%(v/v) volume의 배지를 기본 조성으로 하는 배지를 사용하였다. 기본 조성의 배지의 초기 pH를 달리하여 $30^{\circ}C$, 150 rpm의 조건으로 20일 동안 5일 간격으로 배양을 하여 TG 활성을 측정한 결과 초기 pH 5.0, 배양 15일, 그리고 A. niger KCTC6913 균주에서 가장 높은 TG 활성을 확인하였다. TG 생산에 유리한 탄소원, 질소원을 확립하기 위해 5 종의 다른 탄소원(감자 전분, 고구마 전분, 옥수수 전분, 밀 전분, 덱스트린) 또는 3종의 다른 질소원(효모추출물, 맥아추출물 및 쇠고기추출물)을 이용하여 초기 pH 5.0, 15일 배양한 후 TG 활성을 측정한 결과, 기본 조성 배지인 감자 전분 및 효모추출물에서 가장 높은 TG 활성을 확인 하였다. 또한 A. niger KCTC6913 균주는 호기적 조건 및 탄소원:질소원의 비율을 조절함에 따라 TG 생산이 증가함을 확인하였다. 확립된 최적 배지 및 배양 조건에서 TG 활성을 평가하기 위해 기본배지 및 A. niger 배양에 널리 이용되는 PDB 배지를 대조군으로 하여 비교한 결과 기본 조성의 배지에 비해 1.3배, PDB 배지에 비해 4배 높은 TG 활성을 확인 하였다. 종합적으로 이러한 연구결과는 A. niger 유래의 TG를 산업적으로 이용하기 위한 최적 배양 배지 및 배양 조건을 성공적으로 수립하였음을 시사한다.
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[게시일 2004년 10월 1일]
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