한국미생물생명공학회 2000년도 Proceedings of 2000 KSAM International Symposium and Spring Meeting
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pp.193-198
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2000
PCBs를 분해하는 bphABC유전자를 plasmid vactor pMFB2에 유전자조작한 Pseudomonas putida AC30(pMFB2)를 PCBs에 오염된 연안해역의 해수와 저니로 만든 microcosm에 도입한 결과, 각각 도입 4일과 7일만에 사멸하였다. 그러나, 도입한 P. putida AC30(pMFB2)는 사멸하였지만, 연안해수와 저니 microcosm에서 plasmid pMFB2가 전이한 토착미생물이 검출되었다. 도입한 P. putida AC30(pMFB2)의 생잔실패의 원인을 분석한 결과 공경 0.2$\mu\textrm{m}$의 filter를 통과하는 물질과 생물이 가장 크게 영향을 미치는 것으로 나타났다. 유전자조작 P. putida AC30(pMFB2)의 도입과 bphABC유전자의 토착미생물로의 전이에 따른 토착미생물군집에 미치는 영향을 개체수 변동으로 조사한 결과, 토착미생물 군집에 미치는 영향은 보이지 않았다. P. putida AC30(pMFB2)의 도입에 의한 PCBs의 생분해성을 분석하였다. 그러나, 도입한 유전자조작 균주가 생잔에 실패함으로써 잔류하고 있는 PCBs의 농도변화는 보이지 않았다.
숙주 동물과 동물의 장내 미생물의 건강 또는 생산성에 대한 연구결과를 미루어 볼 때, 가축 동물의 장내 미생물에 대한 연구는 매우 중요하다. 본 연구는 국내에서 사육되는 젖소 중 홀스타인 종과 저지종 젖소의 장내 미생물을 분석하고 차세대 염기서열 분석을 통해 젖소 종에 따른 장내 미생물 군집 구조의 차이를 규명하고자 하였다. 젖소의 원유 생산과 관련있는 것으로 알려진 종 풍부도와 종 다양성 지수 분석 결과 대부분의 풍부도 및 다양성 지수가 홀스타인 종 보다 저지 종에서 유의한 수준으로 높은 것으로 나타났으나, 종 간의 계통학적 거리를 합산하여 산출되는 phylogenetic diversity 지수는 낮은 것으로 나타났다. 미생물 분포 분석 결과 홀스타인과 저지 종의 두 집단 장내 미생물 군집 구조가 다른 것으로 나타났다. 두 종의 젖소에서 과(family) 수준의 다양한 장내 미생물간의 분포에 상관관계가 있는 것으로 나타났으며, 특히 저지 종의 장내 미생물은 다양한 미생물 분포 사이에 매우 유의한 수준의 상관관계가 있는 것으로 나타났다. 두 종의 젖소 장내 미생물 구조에 차이가 있는지 확인하기 위해 beta-diversity 분석을 수행하였으며, PCoA 분석과 UPGMA clustering 분석 결과 두 그룹의 cluster가 명확히 분리되는 것을 시각적으로 확인하였으며, PERMANOVA 분석 결과 두 종의 장내 미생물 군집 구조가 통계적으로 매우 유의한 수준의 차이가 있는 것으로 나타났다. 두 젖소 종의 장내 미생물 군집 구조 차이에 기여하는 미생물을 확인하기 위해 LEfSe 분석을 수행하였으며, 그 결과 Firmicutes, Bacilli, Moraxellaceae, Pseudomonadales 등의 상대적인 미생물 분포 차이가 두 그룹간 장내 미생물 군집 구조 차이에 가장 큰 영향을 미치는 것으로 나타났다.
BIOLOG GN microplate를 이용한 유일탄소원의 이용능 비교를 통한 대사적 유사성과 16S rDNA 의 PCR 증폭산물의 제한효소 지문 분석에 따른 유전적 유사성을 5종의 식생토양에 따른 토양미생물 군집을 대상으로 비교하였다. 16S rDNA를 증폭하여 제한효소 지문을 분석한 결과, 토양으로부터 직접 추출하여 증폭한 토양세균 군집의 16S rDNA의 유전적 유사도는 BIOLOG GN microplate를 이용한 대사적 구조와 일치하는 경향을 보았다. 그러나 배양된 종속영양세균 군집의 다양성과는 유전적 유사도가 매우 낮게 나타났다.
본 연구의 목적은 Bt 배추의 토양미생물 군집에 미치는 영향을 조사하기 위한 것이다. 토양미생물 조사에 앞서 토양 화학성분을 분석한 결과, Bt 배추와 일반품종 배추 근권토양간 화학성분의 유의성 있는 차이는 없는 것으로 조사되었다. 생육 최대 성숙기의 토양미생물 군집밀도를 조사했을 때 Bt 배추 근권토양의 미생물 군집밀도 범위가 일반 배추 근권토양의 미생물 군집밀도 범위내에 속하는 것으로 나타났다. 월별 DGGE 분석결과 일반품종 배추 근권토양 미생물 군집에 비해 Bt 배추 근권토양 미생물 군집의 변이는 없었다. 형질전환 벡터 유래 유전자부위를 이용하여 유전자의 수평이동성을 조사했을 때 Bt 근권토양 유래 DNA에서는 벡터 유래 유전자가 검출되지 않았다.
토양과 작물근계에 있어서 유용미생물의 농업적 이용을 위해서는 토양-근계의 미생물군집구조를 명확히 이해하고 파악하는 것이 무엇보다도 중요하다. 따라서 본 연구는 비닐하우스내에서 재배한 고추와 토마토의 생육이 건전한 지점과 역병이 이병되어 생육이 불량한 지점에서 토양과 작물근계의 미생물군집을 분석하여, 앞으로 생물비료 생물농약의 실용화를 위한 미생물의 농업적 이용에 대한 기초 자료로 활용하고자, 다각적인 측면에서 미생물 군집을 분석한 일련의 연구를 수행하는 데 있어서 배양이 되는 세균군집구조 결석의 결과를 보고 하고자 한다. 세균군집 구조를 분석한 결과 전세균 및 방선균의 개체군은 토양, 근면시료에 있어서 큰 변동을 보이지 않은 반면, 형광성 pseudomonas의 개체수는 토양보다는 근면(rhizoplane)에서 큰 변동을 보였으며 특히 근면에서 높은 개체군을 보였다. 또한 근면에 있어서는 건전한 근면이 역병이 이병된 비건전한 근면보다도 높은 개체군을 보였다. 그리고 고추와 토마토작목간에는 큰 차를 보이지 않았다. MIDI system을 이용한 지방산조성 분석에 의한 세균 285균주에 대하여 각각을 동정한 결과, 크게 두 그룹으로 뚜렸하게 나타났다. 가장 높은 것이 주로 Bacillus 속인 저(低) G + C 그램양성세균군이 52%를 보였고, 방선균 등의 고(高) G + C 그램양성세균군이 33%를 보였다. 따라서 토양 및 근권세균의 농업적 이용에 있어서 형광성 pseudomonas. Bacillus spp., 방선균등의 적절한 활용이 기대된다.
미생물 연료전지의 전극소재는 전기발생량에 영향을 미치는 중요인자이다. 본 연구에서는 탄소전극의 두께 구조가 미생물 연료전지의 전력밀도 미생물 형성 미생물 군집의 다양성에 미치는 영향에 관해 연구를 수행하였다. 산화 환원 전극조합의 능률적인 구성을 위해 다양한 형태의 탄소전극으로 이루어진 7개 실험실 규모의 반응기가 연속식 공정으로 운전되었다. 반응기의 안정화 상태에서 구멍이 있는 흑연펠트(6 mm 두께) 조합이 전기발생량 238 mV, 그리고 쿨롱효율이 37%로 가장 높은 셀 성능을 나타내었다. 산화전극 표면에 미생물의 생성을 관찰하기 위해 SEM 촬영을 실시한 결과, 니트형태의 탄소섬유와 흑연펠트의 표면에 미생물양의 생성이 증가함을 관찰할 수 있었다. 식종 슬러지와 산화전극 부착성장 미생물의 우점종 변화를 관찰하기 위해 PCR-DGGE를 통한 미생물 군집해석 결과, 식종슬러지내의 미생물 군집과 운전 후 각 전극에 우점화 된 미생물의 군집에는 차이를 보였다. 특히 흑연펠트의 탄소섬유에 전기활성 박테리아로 알려진 eobacter 종이 우점화 된 것을 확인할 수 있었다.
울산, 여수 등 공단지역의 토양, 하천의 저니, 해양의 준설토 둥을 이용하여 난분해성 염소화합물인 PCE (perchloroethylene)및 TCE (trichloroethylene)의 혐기성 탈염소화에 관련하는 미생물을 탐색하고 이들의 탈염소화 효율을 조사하였다. 혐기성 상호대사에 의한 탈염소화 효율을 조사하기 위해 전자공여체로 acetate를 사용하여 혐기성 회분식 실험을 실시하였으며, 이와 병행하여 분자생물학적인 기법인 16S rDNA의 PCR-Double Gradient DGGE (DG-DGGE)를 이용하여 미생물의 군집을 분석하였다. 그 결과 울산 태화강 및 여수 하남천의 저니를 접종한 경우 PCE는 $70\%,\;65\%$, TCE는 $50\%,\;45\%$의 높은 탈염소화 효율을 나타내었다. 또한 16S rDNA의 PCR을 이용한 DG-DGGE로 미생물 군집을 분석한 결과, 탈염소화 효율이 높은 지역의 저니에는 Desulfovibrio sup.의 미생물이 주로 존재함을 확인하였다.
화학적 산화처리와 bioremedation 기법을 개별적 또는 복합적으로 동시에 적용함으로써 한 개별 기법의 단점을 보완하고 현장적용성을 증대시킬 수 있는 통합기법을 개발하고자 하였다. 펜톤유사 반응을 통해 고농도의 유류를 산화분해 시킨 후 미생물 처리를 통해 잔류 유류 오염물질을 제거하고자 하였다. 유류 오염토양의 화학 생물학적 통합처리 공정의 현장 적용성 및 토양 미생물에 미치는 영향을 검증하기 위해 처리과정 전 후의 미생물 군집구조를 분석하였다. 또한 토양 내 유류 분해균을 분리하기 위해 탄소원으로 경유와 벙커C를 이용하여 농화배양을 수행하였다. 경유 분해균 10여종, 벙커 C 분해균 6종을 분리하여 분해능 및 동정을 시도하였다. 또한 유류 분해미생물의 consortia를 분자생물학적 기법으로 분석을 시도하였다.
들잔디(zoysia japonica)에 제초제를 살포 한 다음, 아미노산을 포함한 액비(LFcAA)를 처리한 들잔디 토양의 미생물 군집구조 및 다양성을 비교하기 위하여 16S rDNA서열에 기초한 T-RFLP (terminal restriction fragment length polymorphism)분식과 클론의 염기서열 분석을 실시하였다. 제한효소 HaeIII을 이용한 T-RFLP 분석결과 아미노산 액비를 처리한 실험구 KD3과 KD4에서, 32, 38개의 유효한 피크를 가진 T-RFs가 나타났다. 23개를 나타낸 아미노산 무처리구인 KD2가 KD3,4에 비해 미생물군집구조가 단순한 것으로 조사되었다. 네 개의 실험구 KDl (대조구), KD2 (무처리구), KD3 (LFcAA 1X)., KD4 (LFcAA 2X)에서 각각 110개의 클론의 16S rDNA부분 염기서열 분석결과 대부분이 $91{\sim}99%$ 유사도 수준에서 GeneBank에 등록된 염기서열 중 대부분 uncultured bacterium으로 BLAST결과 조사되었다. 이외의 대부분의 클론들은 Proteobacteria, Acidobacteria, Actinobacteria, Sphingobacteria, Planctomycetes 그룹들의 클론들이 조사되었고, 특히 LEcAA 2X 처리구인 KD4에서는 KD2에서와는 다르게 Alphaproteobacteria의 Rhizobiales, Shigomonadales,그리고 Caulobacterales목에 속하는 미생물들의 클론이 조사되었으며, Gammaproteobactetia의 Pseudomonas 속의 세균들이 주로 나타났으며, Betaproteobaderia 의 Nitrosomonadales 목의 Nitrosospira 속들이 주로 조사되었다. 이 외에도 Acidobacteria 그룹, Actinobacteria 그룰, Planctomycetacia, Sphingobacteria 그룹들이 다양하게 조사되었다. 이러한 결과는 제초제를 살포한 미생물 군집구조가 LFcAA 첨가로 들잔디의 미생물 군집 구조에 큰 영향을 주고 있음을 시사하였다.
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[게시일 2004년 10월 1일]
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