Phosphatidylcholine (PC) 인지질로 이루어진 모델 지질막은 세포막을 대신하여 지질막과 여러 분자간의 상호 작용을 연구하는 생물리 연구에 흔히 이용된다. 이들 모델 지질막을 제조하는 과정에서 지질 분자나 지질막과 작용하는 분자를 용해하는데 여러 가지 유기 용매가 이용된다. 용해 과정에 사용된 용매는 물론 제거되거나 소량 사용되기 때문에 실험 결과에 미치는 영향이 미미한 것으로 간주되어 보통 무시된다. 하지만 용매의 종류에 따라 소량의 용매가 용질 분자에 남아서 실험 결과에 영향을 미칠 수 있다. 본 연구에서는 시차열분석기와 인($^{31}P$) 고체 핵자기 공명 실험을 통하여 유기 용매가 지질막의 상변이와 지질막의 물리적 성질에 미치는 영향을 조사하였다. 클로로폼에 용해한 지질의 경우 비교적 쉽게 제거되었으며, 에탄올, trifluoroethanol(TFE) 또는 trifluoroacetic acid (TFA)에 용해한 분자들의 경우 용질에 잔류하여 지질과 용질의 상호작용시 지질의 물리적 성질에 영향을 미치는 것이 확인되었다. 따라서 지질막과 상호작용하는 분자들의 연구에서 용매의 선택이 중요하며 비록 미량이 사용되었을지라도 시료 제조와 실험 결과의 해석에 각별한 주의가 필요함을 보여 준다.
세포막지질의 산화는 심각한 세포막의 기능저하를 유발하고 심하면 세포를 죽음에 이르게하여 생물학적으로 중요한 지표이다. 세포막지질의 산화는 간접적인 화학적 방법으로 측정하거나, 지질을 추출해내어 질량분석기나 핵자기공명분광기 같은 물리적 방법으로 분석한다. 우리는 이온유도 이차전자 방출계수(${\gamma}$) 변화를 측정하여 세포막지질의 산화를 지질추출 없이 측정할 수 있는지 조사해 보았다. 세포막분리가 쉬운 적혈구를 모델세포로 사용하였고, 다양한 라디칼을 발생시키는 대기압 공기 DBD플라즈마 장치를 이용하였다. 적혈구를 플라즈마에 노출하는 시간으로 산화의 정도에 차이를 만들어 측정값과 비교하였다. ${\gamma}$값은 Auger의 중화이론에 바탕을 둔 이온유도 이차전자 방출빔(${\gamma}$-FIB)장비를 이용하여 측정하였다. 측정결과 적혈구가 산화됨에 따라서 ${\gamma}$값이 증가함을 볼 수 있었고, 동시에 workfunction값이 변화함을 보았으며, 그 결과를 화학적 방법과 비교해 보았다.
1-Palmitoyl-$d_{31}$-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphatidylcholine (POPC_$d_{31}$)로 이루어진 지질 이중막에 항균성 펩타이드 magainin 2와 aurein 3.3이 작용했을 때 일어나는 상변화를 중수소 고체 핵자기 공명 스펙트럼을 관측하여 탐구하였다. 측정된 중수소 고체 핵자기 공명 스펙트럼의 선모양을 이론적 모델 구조를 통하여 모사함으로써, 펩타이드-지질 혼합상태의 기하학적 구조상수 및 동력학적 표면 확산 계수 등을 구하였다. 펩타이드의 혼합 이후 5일 이내의 짧은 작용시간에는 지질 이중막의 정렬이 파괴되는 현상이 나타났으나, 100일 이후에는 magainin 2에 의해서는 타원형 원환체 기공 (elliptic toroidal pore)이, aurein 3.3에 의해서는 6각형 단면 막대구조 상(hexagonal phase)이 관측되었다. 지질 이중막 표면의 전하밀도가 항균성 펩타이드의 작용에 미치는 효과를 보기 위해 산성 지질인 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphatidylglycerol (POPG)를 함유한 POPC_$d_{31}$/POPG 지질 이중막에 대해서도 동일한 실험을 수행하였다. 동일한 ${\alpha}$-나선형 구조를 가지는 두 펩타이드가 두 종류의 지질 이중막에 작용하는 과정의 차이를 확인할 수 있었다.
산소라디칼-질병모델을 보다 간편한 방법으로 만들어 생화학적 발병 기전을 추구하므로서 신약창출에 필요한 기초자료를 제시하고자 본 실험을 실시하였다. 미세혈관의 혈류이상은 과잉의 활성산소를 생산하게되며 이로 인해 여러 종류의 난치성 질환 및 염증을 수반하는 많은 질병이 발병하게 된다. 일반적으로 흔히 이용되어지는 허혈-재관류모델이 아닌 환경독성물질을 활용한 병태모델을 만들어 이 모델조건에서 활성산소생성과 밀접한 관계를 갖는 잔틴 옥시데이즈(Xanthine Oxidase)의 변화와 과산화지질생성정도를 연관지어 검토하였다. 수은, 구리, 몰리브덴등의 금속이온들은 잔틴 디하이드로저네이즈(Xanthine dehydrogenase)로 부터 옥시데이즈(Oxidase)형으로의 전환을 촉진시켰으며 막독성의 지표로 이용되어지는 과산화지질의 생성도 현저히 증가시켰다. 또한 알데하이드류의 첨가실험에서도 잔틴산화효소의 형전환이 촉진되었으며 첨가한 알데하이드의 탄소수와 수소수 그리고 탄소와 탄소의 결합상태와도 밀접한 관계가 있음이 관찰되었다.
In vitro와 in vivo에서 양조간장과 glucose-lysine 모델 멜라노이딘의 항산화효과를 조사하여 다음과 같은 결과를 얻었다. In vitro에서 양조간장과 멜라노이딘의 항산화효과를 linoleic acid emulsion계를 이용하여 비교하였을 때 양조간장과 멜라노이딘은 대조군에 비해 우수한 항산화활성을 나타내었고 특히 양조간장의 효과가 더 우수한 것으로 나타났다. DPPH 라디칼 소거활성 역시 멜라노이딘에 비해 양조간장의 효과가 큰 것으로 나타났다. 지방산 조성이 상이한 옥수수기름과 어유를 섭취시킨 흰쥐에 10% 양조간장 및 멜라노이딘을 5주간 섭취시켰을 때 간의 지방산 조성은 섭취 지방산에 따라 차이가 뚜렷하였으나 양조간장과 멜라노이딘의 효과는 대조군과 유사하였다. 지질 과산화물 생성정도를 TBARS로 측정하였을 때 불포화지방산 함량이 높은 어유 섭취군에서 지질과산화가 증가하였으며 간장과 멜라노이딘은 지질과산화를 억제하는 효과를 나타내었다. CL(chemilurninescence)-HPLC 방법을 이용하여 간과 혈장의 막 인지질 PCOOH 함량을 측정한 결과, 어유의 섭취는 옥수수기름 섭취 군에 비해 지질 과산화를 월등히 증가시켰고 양조간장과 멜라노이딘의 섭취는 유의적으로 지질 과산화를 억제한 것으로 나타났다. 특히 양조간장의 효과가 멜라노이딘 보다 우수하여 이는 콩유래 항산화물질인 수용성 펩티드나 저분자 단백질들이 효과적으로 항산화활성을 나타낸 것으로 여겨지며, 불포화지방산이 높은 식품의 섭취시 간장을 소스로 이용하는 것이 지질의 과산화를 억제할 것으로 기대되어진다.
피부의 장벽 구조는 표피의 각질 형성세포의 분화과정에 의해서 생성된다. 이 구조는 케라틴 단백질로 구성되는 각질세포와 그 사이를 채우고 있는 세포간 지질로 구성된다. 이때 표피의 기저층의 세포의 막을 이루던 인지질 등의 성분은 분해되어 없어지고, 세라마이드 등이 성분이 신규로 합성되어 각질층의 세포간 지질을 구성한다. 본 연구에서는 피부 장벽의 세포간 지질 구조의 패킹과 장벽기능에 진세노사이드 Rg3성분이 미치는 영향을 확인하였다. 이를 위해 3D피부 세포의 분화과정에 Rg3성분을 처리하였다. 3D피부를 대상으로 FT-IR 및 TEWL를 분석한 결과, 각질 세포간 지질의 orthorhombic패킹이 강화되고 장벽기능이 강화되는 것을 확인하였다. 또한 HaCaT세포에 Rg3를 처리한 경우, 긴 체인 길이의 지질을 합성하는 EVOL1 및 EVOL4의 발현 증가와 짧은 길이의 세라마이드의 합성을 당하는 CERS6의 감소 그리고 피토스핑고신을 사용하는 세라마이드를 분해시키는 ACER6의 증가를 검출하였다. 이를 통해 Rg3가 표피 분화 과정 중 지질의 합성에 영향을 주어 장벽 기능 변화를 가져올 가능성을 제시하였다.
노화과정에 산소라디칼이 관여할 가능성을 난소를 절제한 횐 쥐를 동물모델로 하여 알아보았다. 난소를 절제한 쥐와 난소를 절제하지 않은 정상 쥐에서의 생리활성 및 항산화 효과를 알아보기 위하여 CS를 사용하였다. 난소를 절제한 횐 쥐에 각각 CS를 각 100 mg/kg과 200 mg/kg을 투여하고, 이것과 비교하기 위해 난소를 절제한 대조군과 난소를 절제하지 않은 정상군으로 하여 항산화 효과에 관한 실험방법으로 진행하였다. 노화 유도된 쥐의 각 조직에서 지질 과산화가 증가되었고 유리기 반응이 더 심하게 일어난 간 조직에서 노화 진행이 그만큼 촉진되었음을 알 수 있었다. 산소라디칼 반응이 항진된 원인을 규명코자 간 조직에서 항산화 효소의 활성을 조사한 결과, SOD와 GSH의 활성이 감소되었으며, 노화나 지질과산화가 심하게 진행되었던 간 조직에서 이들 항산화 효소의 활성감소가 심한 경향을 나타내었다. AST의 활성은 OVX 군이 Sham 군에 비해 2.1배 높게 나타났으며, ALT 활성은 크게 변화하지 않았다. 과산화지질한량은 OVX 군이 Sham 군에 비해 1.4배 높게 나타났으며, CS를 투여한 군에서는 31%-38%의 저해율을 보였다. 항산화 효소들은 Sham 군에 비해 OVX 군에서 낮게 나타났으며, 물질 투여 군에서는 정도의 차이는 있지만 대체로 증가하는 경향을 보였다. 이러한 결과에서 보듯이, 난소절제로 생성된 유리기는 물질 투여로 인한 항산화 효소의 증가를 가져오고 이는 결국 유리기로 손상된 막의 지질과산화 정도를 완화시켜 세포를 보호하는 효과를 가져왔다고 할 수 있다. 따라서 CS는 여러 가지 측면에서 난소절제로 인해 유도된 지질과산화 및 활성산소에 의한 공격으로부터 세포를 보호하고 회복시켜주는 효과가 있다고 사료되어진다.
실험 계획법을 활용하여 세라마이드가 고함량으로 함유된 수화 액정형 베시클의 입자 사이즈에 영향을 미치는 인자를 분석하고 혼합물 조성의 최적화를 시도하였다. 베시클 입자 사이즈에 영향을 주는 주요 변수로 제조 온도, 에탄올 양, 초음파 시간을 각각 정하고, 다구찌 방법의 S/N비 산출과 ANOVA 분석을 통해, 이들 변수들이 입자 사이즈에 미치는 영향을 살펴보았다. 또한 혼합물 실험 계획법의 심플렉스 중심 설계에 따라, 베시클 막을 구성하는 세 지질 성분, 인지질(HPC), 콜레스테롤(Chol), 세라마이드(Cer)의 혼합 조성 실험을 수행하였다. 실험에서 얻어진 데이터로부터 회귀분석을 실시하여 모델식을 구하고, 베시클 입자 사이즈를 최소로 만들기 위한 세 지질 성분의 최적 혼합 조성은 HPC(0.6), Chol(0.1), Cer(0.3)으로 구해졌다.
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[게시일 2004년 10월 1일]
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