카레분 및 카레 원료로 사용되는 주요 향신료들의 돌연변이 억제 효과를 보기 위하여 카레분 및 원료 향신료 14종의 추출물에 대한 돌연변이원성 및 항 돌연변이원성 실험을 하였다. 카레분 및 향신료 14종의 추출물에 대해 돌연변이원성 유무를 확인한 결과 돌연변이 원이 없는 것으로 확인되었다. 항 돌연변이원성 실험에서 직접 변이원 2-NF 처리 시Saimonella typhimurium TA 98에 대하여 향신료 추출물 중cinnamon(42%) 및 fenugreek(38%), fennel(32%), ginger(28%), clove(24%)는 p<0.00I 유의수준에서, 그리고 turmeric (23%) 및 celery seed(20%), coriander(16%)는 p<0.01 수준에서 항 돌연변이율을 나타냈다. 그리고 garlic(17%)이 항 돌연변이 활성을 나타냈으며 그 밖의 향신료 및 카레분 추출물은 항 돌연변이 효과가 없었다. 간접변이원 2-AT처리 시 돌연변이 수는 115.0$\pm$46.4에서 clove추출물 첨가에 의해 13.2$\pm$8.1로 감소하여 향신료 추출물 중 clove가 116%로 가장 높은 항 돌연변이율을 보였으며, celery seed(103%) 및 cardamon(100%) 역시 강한 항 돌연변이율을 나타냈다(p<0.01). 그밖에 red pepper, cinnamon, cumin, ginger, fennel, coriander, nutmeg, turmeric에서도 항 돌연변이 활성이 존재하였다(p<0.05). 간접변이원 2-AF에서는 clove추출물이 120%의 가장 높은 항 돌연변이율을 보였으며, cinnamon(113%) 역시 강한 항 돌연변이 활성을 나타냈다(p<0.001). 그리고 cardamon(93%) 및 celery seed (80%), ginger(58%), fennel(44%) 역시 항 돌연변이 활성을 보였다(p<0.05). 그밖에 coriander, black pepper는 항 돌연변이 효과가 나타나지 않았다. 카레분 추출물의 경우, 간접변이원인 2-AT와 2-AF에서 6~23%의 항 돌연변이 율을 나타냈으나 유의성이 없었으며 직접변이원인 2-NF 에서는 항 돌연변이성을 나타내지 않았다. 즉, 동일한 추출물이라도 변이원에 따라 항 돌연변이율이 다르게 확인되었으며, 카레분 및 원료 향신료의 추출물에서 항 돌연변이율은 직접변이원보다는 간접변이원에서 높게 나타났다.
사람 T-임파구에서 방사선 독성물질인 감마선과 화학적 독성물질인 PCP(pentachlorophenol)의 돌연변이 효과를 hprt (hypoxanthine phosphoribosyl transferase) 유전자의 돌연변이빈도로써 측정하였다. 감마선은 $^{137}$Cs원을 사용하여, 0 - 300 rads의 양으로 세포의 초기배양 시기에 조사하였으며, PCP는 역시 세포의 초기배양시 최종농도 0-100 ppm으로 24시간 투여 하였다. 양 돌연변이원은 hprt유전자를 돌연변이 시키어, 300rads의 조사는 대조군에 비하여 약 7.5배의 돌연변이빈도의 증가를 나타내었고, PCP 500 ppm의 처리는 대조군에 비하여 약 5배의 돌연변이빈도 증가를 나타내었다. 본 실험에 사용된 상이한 두 돌연변이원은 모두 비교적 정확한 용량-반응 관계를 보였으나, 환경독성물질들의 혼합효과에서 돌연변이원을 정성하기위하여 개선된 T-cell hprt clonal assay, 즉 reverse transcriptase/polymerase chain reaction 및 direct sequencing에 의한 mutational spectrum의 적용이 요구되었다.
Bacillus sphaericss 1593균주를 ultra violet light (366nm, 253.7nm)와 dimethyl sulfate으로 처리하여 다수의 감온성 돌연변이체를 분리하여 이중 25균주를 선택하였고 24개의 감온성 돌연변이체는 $42^{\circ}C$의 제한온도에서 전혀 성장을 하지 않았으며, 9개의 감온성 돌연변이체는 제한온도 $42^{\circ}C$에서 허용온도의 성장과 비교하여 1/2정도의 감소를 보였다. 기타 2개의 감온성 돌연변이체는 저온 민감성인 감온성 돌연변이체로서 허용온도($30^{\circ}C$)에서의 성장이 제한온도($42^{\circ}C$) 성장보다 감소를 보였다. 이러한 결과에 따라서 감온성 돌연변이체를 치사군과 비치사군 및 저온민감성 감온성 돌연변이체로 분리할 수 있었다. 또한 치사군의 제한온도에서의 발육은 고체배지 및 액체배지 양쪽에서 성장을 하지 않는 반면 비치사군들의 돌연변이체들은 제한온도 $42^{\circ}C$에서 고체배지 및 액체배지의 성장은 허용온도에서 배양한 결과보다 저조한 성장을 나타내었다. 감온성 돌연변이체들은 $42^{\circ}C$에서 12시간 배양한 후 허용온도인 $30^{\circ}C$ 액체배지로 이식하여 배양한 결과 치사군중 ts-U1112, ts-D1290, ts-D1342, ts-D1504 돌연변이체들은 성장을 계속하지 않았으며, ts-U351, ts-U828, ts-U892, ts-D1350, ts-D1479, ts-D2601과 ts-D2801 돌연변이체들은 성장이 계속됨을 관찰할 수 있었다.
여러 종류의 폐암과 췌장암 세포주를 배양하여 DNA를 분리하였다. 분리한 DNA는 PCR(Polymerase Chain Reaction)로 증폭하여 염기 서열화를 시행하여 K-ras와 p53 유전자들의 돌연변이 종류. 빈도 및 가능한 관계에 대하여 조사하였다. 연구한 암세포주 중 약 81%가 종양 유전자 K-ras와 암 억제 유전자 p53 중 적어도 하나의 돌연변이를 가지고 있었으며 두 유전자 각각에 대해서는 암 세포주 중 약 54.5%에서 돌연변이가 나타났다. 발견된 돌연변이의 종류는 1개의 세포주에 발견된 넌센스 돌연변이 이외에는 모두 미스센스 돌연변이가 일어났으며 2개의 세포주에서 일어난 염기 삽입이외에는 모두 염기 치환이 일어났다. 현재까지 p53 코돈 중 ras와 동시에 돌연변이가 일어난다고 보고된 코돈 이외에도 p53 코돈 164-165과 248이 K-ras와 동시에 돌연변이가 발생하였고, p53 유전자의 돌연변이의 위치에 관계없이 K-ras 유전자에서는 exon 1. 코돈 12개에서 돌연변이가 발생하였다.
이전 연구에서 Streptomyces sp. M3 균주로부터 polyguluronate에 기질특이성을 가지는 알긴산분해효소를 cloning하고 활성을 연구하였다. 이번 연구에서는 pColdI vector에 들어있는 M3 알긴산분해효소 유전자를 돌연변이시켜 알긴산분해효소의 활성을 증진시키고자 하였으며, 점-돌연변이 또는 무작위-돌연변이 방법을 사용하여 돌연변이를 실시하였다. Ser25Arg, Phe99Leu, Asp142Asn, Val163Ala, Lys191Glu 및 Gly194Cys 등 6 종류의 돌연변이 단백질을 얻을 수 있었다. Phe99Leu 및 Lys191Glu 돌연변이 단백질은 알긴산을 분해하는 능력을 완전히 잃었으나 Gly194Cys 돌연변이 단백질의 활성은 원래 단백질에 비하여 10배 증가하였다. 또한 돌연변이된 M3 알긴산분해효소 단백질의 3차 구조는 Swiss-Model 자동모델러를 이용하여 생성하였으며 다른 알긴산분해효소의 결정구조와 비교하였다. 194 번째 아미노산인 글리신은 알긴산의 C-말단 보존서열인 YFKAGXYXQ의 Gly193과 Tyr195 사이에 위치한다. 이 연구에서 돌연변이된 글리신과 페닐알라닌 잔기들은 활성자리로부터 많이 떨어져있음에도 불구하고 돌연변이에 의하여 알긴산 분해활성이 강하게 영향을 받는 것으로 나타났다.
S.typhimurium LT-2의 histidine auxotroph를 이용한 돌연변이 유발물질 검출방법으로 PA 및 NPA의 돌연변이 유발능을 실험했다. PA는 microsomal enzyme에 의해 강한 돌연변이 유발효과를 나타냈으며 NPA는 직접 처리했을 때 강한 돌연변이 유발효과를 나타냇고 microsomal enzyme에 의한 활성화로는 그 비율이 증가되지 않았다.
이전 연구에서 83명의 한국인 폐선암 환자의 차세대 염기서열 분석법(next generation sequencing, NGS) 분석 결과 돌연변이 빈도가 높은 상위 5개 유전자 TP53 (60%), EGFR (48%), KRAS (14%), PIK3CA (8%), CDKN2A (6%)를 확인했다. 본연구는 NGS 분석을 이용하여 최근 한국인의 폐선암에서 돌연변이 발생 빈도가 높은 상위 5개 유전자에 대한 돌연변이 핫스팟을 분석하여 폐선암을 유발하는 새로운 표지자를 확인하고자 했으며 가장 많은 돌연변이가 발생한 TP53 유전자의 돌연변이 유형과 패턴을 폐암의 주요 원인인 흡연과의 연관성을 분석했으며 TP53 P72R SNP가 발생한 폐선암 환자의 임상병리학적 특성을 분석하고자 했다. TP53, EGFR, KRAS, PIK3CA, CDKN2A의 돌연변이 핫스팟을 분석한 결과 이전에 보고된 결과와 일치했으나 TP53의 경우 약간의 차이를 나타냈다. TP53 돌연변이 핫스팟은 DBD에 집중하여 발생하는 점은 기존 연구 결과와 같았으나 코돈 72에서 발생하는 높은 돌연변이 빈도는 이전에 보고된 연구 결과와 다르게 나타났다. TP53 돌연변이가 발생한 폐선암 환자의 임상 특성을 분석한 결과 남성보다 여성, 흡연자보다 비흡연자에게 더 많이 발생했다. 또한, TP53 돌연변이 유형은 흡연 여부와 상관없이 전환의 비율이 가장 높았으며 전환 또는 결실 그리고 전환과 결실이 동시에 발생하는 비율이 전이의 발생 비율보다 높게 나타났다. 한국인의 폐선암 증례에서 흡연 여부와 상관없이 가장 발생 빈도가 높은 돌연변이 핫스팟은 TP53 코돈 72 뉴클레오타이드 염기가 C에서 G로의 전환되어 아미노산이 proline에서 arginine으로 치환되는 TP53 P72R SNP 발생 비율이 가장 높게 나타났다. TP53 P72R SNP가 발생한 폐선암 증례들의 임상병리학적 특성을 분석한 결과 환자의 연령, 성별, 흡연 유무 그리고 종양의 분화도와 유의한 상관관계를 보이지 않았지만 낮은 병기와 유의한 상관관계를 나타냈다(P-value=0.026). 본연구는 NGS를 통해 한국인의 폐선암에서 돌연변이 발생 빈도가 가장 많이 보고되었던 EGFR이 아닌 TP53의 증가를 확인했고 그중에서도 흡연 여부와 관계없이 TP53 P72R SNP의 발생 빈도가 가장 높음을 보고하는 바이다.
식품의 안전성 평가를 위한 기초자료를 얻기 위하여, 식품의 가공, 저장 및 조리중에 식품성분간의 상호반응인 Maillard 반응을 이용하여 당의 분해로 생성되는 각종 카르보닐화합물을 강력한 돌연변이원성물질로 알려진 Trp-P-1, Trp-P-2, Glu-P-1, Glu-P-2 및 IQ에 각각 작용시켜서 이들 물질의 돌연변이성 억제효과를 연구 검토하였다. 그 결과, 카르보닐화합물에 의하여 돌연변이원성물질의 돌연변이원 활성이 크게 억제되었다. 사용한 카르보닐화합물중 ${\alpha}$-hydroxycarbonyl 화합물의 경우, glyceraldehyde, glycolaldehyde 및 dihydroxyacetone에서 돌연변이원성 억제효과가 크게 나타났다. ${\alpha}$-dicarbonyl 화합물의 경우, diacetyl에서 그 억제효과가 우수한 것으로 나타서, 전반적으로 ${\alpha}$-dicarbonyl 화합물이 ${\alpha}$-hydroxycarbonyl 화합물보다 돌연변이성 억제효과가 높게 나타났다. 한편, 공시한 카르보닐화합물 단독으로는 돌연변이 성을 나타내었으나, Trp-P-1등의 돌연변이원성물질과의 상호반응로 이들 두 물질의 돌연변이성이 동시에 소실되는 것이 입증되었다.
Boiled, broiled, deep fried, pan fried 등의 방법으로 조리된 조기와 돼지고기의 50% methanol 추출물에 S9 mix를 첨가한 군, S9 mix를 첨가하지 않은 군, 그리고 nitrite를 처리한 군을 Salmonella typhimurium TA98과 TA100으로 Ames test를 실시하여 돌연변이원 형성을 검토한 결과는 다음과 같다. 1. S9 mix를 첨가하지 않은 조기와 돼지고기는 original weight 0.0125 g과 0.1 g사이의 농도 구간에서 돌연변이 원성을 보였다. 2. S9 mix 첨가시 조기와 돼지고기의 돌연변이원성은 모든 농도 구간에서 S9 mix를 첨가하지 않은 경우보다 2∼5배 정도 증가하여 간접 돌연변이원이 존재함을 확인하였다. 3. TA98과 TA100에 대한 돌연변이원성은 모든 조리법에서 조기보다 돼지고기가 더 높았고, 특히 pan fried법의 경우 S9 mix의 첨가시 돌연변이원성이 매우 높게 나타났다. 4. 조기와 돼지고기의 모든 조리법에서 nitrite 처리시 TA98과 TA100 모두 돌연변이원성이 증가하여 직접돌연변이원임을 나타냈고, 특히 TA100보다 TA98에서 돌연변이원성이 더 높은 것으로 나타났다.
Iks 칼륨 전류에 관여하는 KCNQ1유전자의 S140G 돌연변이는 심방세동에 영향을 미치는 대표적인 돌연변이 유전자로, 심방세동과 S140G 돌연변이의 상관관계를 밝히기 위한 연구들이 많이 진행되어 왔다. 하지만 S140G 돌연변이 유전자가 심방 세동 환자의 심실 반응에 영향을 미칠 수 있다는 선행연구를 비롯하여 심방과 심실의 활동전위에 영향을 미칠 수 있는 가능성이 있음에도 불구하고, KCNQ1 S140G 돌연변이 유전자의 심실세동에 대한 영향과 그 메커니즘에 대한 연구는 부족하다. 따라서 본 연구는 KCNQ1 S140G 돌연변이 유전자가 심실세동에 미치는 영향에 대한 컴퓨터 시뮬레이션 연구를 통해 그 상관관계를 밝히고자 하였다. 이를 위해 1차원 세포 모델을 비롯하여 2차원 심실세동 반응과 3차원 전기 생리학 및 기계적 수축 시뮬레이션을 진행하였다. 3차원의 전기생리학 및 기계적 수축 시뮬레이션에서는 심실의 박출 활동을 확인하기 위한 정상 박동 시뮬레이션과 심실 세동 발생시의 심실의 변화를 확인하기 위한 세동 시뮬레이션을 각각 진행하였다. 그 결과 KCNQ1 S140G 돌연변이로 인해 심실의 Iks가 증가되었으며, 그로 인해 심실의 활동 전위기간(APD)과 불응기(ERP)가 단축되는 것을 확인할 수 있었다. 또한 활동전위 지속 곡선(APDr)과 불응기 지속 곡선(ERPr)이 완만하게 나타났으며, 심근세포의 전도파장이 감소하였다. 3차원 정상 박동 시뮬레이션의 결과 표준형에서 보다 KCNQ1 S140G 돌연변이형에서 심실이 소모하는 ATP의 양과 박출계수가 감소하였다. 3차원 세동 시뮬레이션 결과 표준형에서는 심실세동이 종결되었으나, S140G 돌연변이 형에서는 심실세동이 종결되지않고 유지되었으며, 심실세동이 빠르게 발생하였다. 결론적으로, KCNQ1 S140G 돌연변이로 인해 증가된 심실의 Iks는 심실의 박출 효율을 감소시키고 심실세동을 발생시키고 유지시키며, 부정맥 발생의 위험성을 높일 수 있다.
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[게시일 2004년 10월 1일]
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