절간고구마원료주정폐액을 이용하여 단세포단백질을 생산함과 동시에 폐액의 BOD를 제거할 목적으로 우수효모를 선발하고, 선발된 효모의 배양조건을 검토한 후 3$\ell$ -jar fermenter에 의한 통기 배양을 한 결과 다음과 같은 결론을 얻었다. 폐액을 여과한 여액의 조성은 BOD$_{5}$ 15700ppm, COD 36800ppm, 환원당 3300ppm, 총질소 710ppm, 고형물51800ppm, 조회분390ppm이었다. 우수효모로 선발된 Torulopsis candida FRI YA-15를 $25^{\circ}C$에서 48시간 진탕배양하였을 때, 배양폐액에 대한 균체수율은 3.38g/$\ell$, BOD$_{5}$ 및 COD제거율은 각각 38.9%, 31.8%이었다. T. candida의 최적생육초기 pH는 4.0이었으며, 최적배양온도는 35$^{\circ}C$였다. 설정된 초기PH 및 온도하에서 3$\ell$-jar fermenter를 사용하여 통기량 2vvm, 교반속도 100rpm으로 배양하였을 때, 배양 28시간후에 최대로 생육하였으며, 그 때 배양액에 대한 균체수율은 3.2g/$\ell$였다. 건조균체의 조단백질함량은 47.98%였다.
라만 분광법은 레이저가 분자의 공명에 의해 산란되는 특성을 이용하여 세포 내 지질, 핵산, 단백질 등의 구성물질을 신속하게 측정할 수 있어 단세포 수준의 세균 검측에 적합한 기술로 알려져 있다. 세포 구성물질에 대한 높은 특이성과 민감성 때문에 라만 스펙트라(spectra)만으로 일부 종 수준의 세균 계통분석이 가능하다. 또한 탄소-13, 수소-2 등의 동위원소를 동시에 사용하였을 경우 단세포의 생리적 활성 변화에 대한 정량평가에 활용 할 수 있다. 라만 분광법을 이용한 세균 검측 이후에도 광학핀셋과 미세유체칩과 연계하여 관심 있는 난배 양성 세균을 선택적으로 분리하거나 단세포 유전체 연구에 이용할 수 있을 정도로 응용 범위가 넓다. 본 총설에서는 라만 분광법을 활용한 미생물 분석 연구의 정확한 이해를 돕고자 기존의 연구를 중심으로 라만 분광법의 특성과 응용분야에 대해서 검토, 정리하였다.
위암환자에서 nm23 단백질이 예후인자로서의 영향을 규명하기 위해 위절제술로 얻어진 76명의 원발암 조직에 대해서 nm23 단백질의 단세포군 항체를 이용한 면역조직화학적 염색을 실시한 결과 nm23 단백질의 양성발현율은 53.9% (23/76)였다. 병리조직학적 소견들과의 비교에서 nm23 단백질의 양성발현율은 조기암보다 진행암에서, 림프절 전이 양성군에서, 그리고 암세포의 림프관 침습이 있을때 높게 나타났으며 유의한 차이가 있었다. nm23 단백질의 발현유무가 재발과 관련이 있는지에 때한 분석 결과 재발율에서 차이가 없었다. nm23 단백질 발현 유무가 생존기간에 영향을 끼치는가에 대한 단변량 분석결과 생존과 관련이 없는 것으로 나타났다. 이상의 결과로 nm23 단백질의 양성발현 여부를 예후인자로 사용하기는 어려울 것으로 사료된다.
스파르가눔 생리식염수 추출액 내에 포함되어 있는 성분단백질 중 스파르가눔증 환자 혈청내 특이 IgG항체와 민감하고 특이하게 반응하는 항원단벼질인 36, 29 kDa단백질을 단세포군 항체를 이용한 면역친화성 크로마토그 래피로 순수분리할 수 있음은 이미 보고하였다. 이 연구에서는 스파르가눔 추출액 내에 포함된 이 36, 29 kDa단백질이 젤라틴을 고리로 한 친화성 크로마토그래피로 훨씬 쉽게 순수분리할 수 있음을 증명하고자 하였다. 젤라틴을 고리로 부착시킨 Sepharose 4B column에 스파르가눔 추출액을 통과시키고 젤라틴에 부착한 단백질은 4 M urea/0.1M NaCl 용액을 분리완충액으로 분리하였다. 이렇게 분리한 단백질은 SDS-PAGE에서 36, 29 kDa band로 구성되어 있었고, SDS-PAGE/immunoblot 결과 환자의 polyclonal 항체는 이들 band에만 반응하였다. 스파르가눔증, 기타 기생충증 환자 및 건강대조군 혈청내 스파르가눔 특이항체가(IgG)를 면역효소측정 법으로 측정 한 결과 순수분리한 이 단백질은 특히 특이도가 95.8%로 생리식염수 추출액의 89%보다 우수하였고 민감도는 차이가 없었다. 이상의 결과는 젤라틴을 고리로 이용한 친화성 크로마토그래피는 스파르가눔 생리식염수 추출액 내의 36 및 29 kDa 단백질을 간편하게 순수분리할 수 있고 단백질의 항원성도 유지할 수 있음을 보이고 있었다.
본 연구는 세포질 액포의 수와 기능적으로 상호작용하는 정단세포막(丁端細胞膜)의 역동적(力動的) 변화로 인한 세포수송의 조절과 세포막의 재순환(再循環) 과정의 증거를 분석(分析)하였다. 주사전자현미경(走査電子顯微鏡) 관찰에 의하면 Turtle bladder 점막(粘膜)에는 다음 세 증류의 주요세포가 있다. 과립성세포(顆粒性細胞)는 방광점막(膀胱粘膜) 세포의 대다수를 차지하는 것으로서 총 세포수의 80%에 해당하며, 나머지 20%의 세포는 탄산탈수효소가 풍부한 A 및 B형으로 분류되는 상피세포(上皮細胞)가 특징이다. 탄산탈수효소가 풍부한 두 종류의 세포내의 관상액포(管狀液胞)나 대부분의 액포에서 horseradish peroxidase의 흡수를 조사한 결과, 세포막부분이 정단세포질(丁端細胞質) 액포에 내화(內化)되어 있었다. 마치 탄산탈수효소를 함유한 세포가 세포내(細胞內) 액포(液胞)를 소유하고 있는것 같으며 이 세포내 액포는 정단세포막으로 재순환(再循環)하는 proton 펌프를 지니는 것으로 생각된다. Turtle bladder에서 과립상세포는 두렷한 세포외분필(細胞外分泌) 기작에 의하여 다량의 mucin과 기타 단백질을 능동적으로 분비하는 constitutive pathway로서 믿어지며. 조절된 분비경로를 통해 방광상피세포(膀胱上皮細胞)가 mucin을 분비하는 가능성에 대해서는 엄밀하게 규명되어있지 않으므로 이러한 vesicular transport 상당부분이 미결상태로 남아있다.
Yoon Kong;Chi- Yong Park;Shin-Yong Kang;Seung-Yull Cho
Parasites, Hosts and Diseases
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제30권2호
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pp.91-100
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1992
폐홉충의 생리식염수 추출액 내에 있는 여러 가지 성분 단백질의 생화학적 성상, 면역학적 특징 그리고 충체 내에서의 생성위치 등의 단세포군 항체나 전기영동을 이용한 연구에서 일부 밝혀졌다. 이 실험은 폐흡충 성충의 생리식염수 추출액 내에 있는 각 성분단백질이 폐흡충의 어느 부위에서 유래한 것인지를 알기 위하여 실시하였다. 먼저 생리식염수 추출액을 8% disc-PAGE로 전기영동하여 성분단백질을 분리하고 각 단백질 대(대)를 포함하는 젤을 잘라 내었다. 이어 전기영동으로 젤에서 성분단백질을 용출(용출)하였다. 각각의 단백질을 토끼에 면역시켜 성분 단백질별 항폐흡충 면역혈청을 만들고 이 항혈청으로 폐흡충 및 감염 고양이 폐의 절편에 면역효소 염색법을 시행하였다. 그 결과 성충추출액으로 면역한 항폐흡충 면역혈청은 폐흡충 성충의 충란, 장관상피세포, 장관 내용물에 강한 반응을 보였고 실질조직에도 염색이 되었다. 그러나 표피, 표피하세포, 고환, 흡판등은 반응이 없었다. 1번 Band 단백질의 항혈청은 충란내 세포에 염색이 되었고 충체에서 배출되어 폐실질 조직에 들어있는 충란에 더욱 강하게 반응하였다. 2번 Band 단백질의 항혈청은 폐홉충의 실질조직에 반응하였다. 3번 Band 단백질의 항혈청은 2번 Band 단백질과 교차반응을 일으켜 염색 반응을 관찰하지 않았다. 4번 Band 단백질의 항혈청은 폐흡충의 장관 내용물과 강한 반응을 보였고 5번 Band 단백질의 항혈청은 장관상피세포에 반응하였다. 6/7번 Band 단백질과 8번 나and 단백질의 항혈청은 각각 실질조직에 반응하였다.
Monoclonal antibodies (MAbs) reacting with the plasmalemma of Amoeba proteus were produced. Specificity of the 3 MAbs was determined by transfer blotting of the SDS polvacryfamide gel. AMS antibody reacted with the mucopolysaccharide bands of the spacer gel, 220 KD and 50 KD proteins of the resolving gel. The maior glycoprotein bands (175 KD, 165 KD) and 50 KD protein of the plasmalemma were recognized by AUG antibody. A third, AMP antibody reacted with the 50 KD protein only. In immunofluorescence microscopy of the enzyme treated cells, the antigens of these MAbs were sensitive to proteases, but not sensitive to neuraminidase. In the assay of cell to substratum attachment after binding with the antibody, AMG and AMP antibodies exerted no effect, but AMS hindered the attachment and cell spreading. Thus the effective components of the plasmalemma in cell to substratum attachment appear to be the mucopolysaccharides and 220 KD protein. The membranes of latex particle infested phagosomes did not show any distinction from the plasmalemma in fluorescence microscopy. Phagosome membranes of amoebae appear to be derived from the plasma membrane without selection in terms of the antigen composition. Amoeba Proteus의 세포막과 반응하는 단세포군 항체를 생산하였다. SDS polyacrylamide gel을 transfer blotting하여 이들 항체의 반응 특이성을 조사해 본 결과 AMS 단항체는 PAS로 염색되는 spacer gel의 mucopolysaccharide 린드, resolving gel의 220 KD 및 50 KD 단백질과 반응하였으며, 세포막의 주요 당단백질인 175 KD 및 165 KD 빈드와 50 KD 단백질은 AMG 단항체에 의해서 인지되었다. 그리고 AMP단항체는 공통인 50 KD 단백질과 특이하게 반응하였다. 효소처리한 아메바의 면역형광칠미경적 조사에서 이들 항체에 대한 항원분자들은 모두 단백질분해효소에 민감하였으며 neuraminidase에 대해서는 변화가 없었다. 이들 항체를 결합시킨 아메바의 용기표면 부착 가능성을 분석한 결과 AMP 및 AMG 단항체는 아무런 영향을 미치지 못하였으며 AMS 단항체는 세포의 용기표면 부착 및 세포의 펴짐을 저해하였다. 따라서 아메바의 용기표면 부착은 mucopolysaccharide 및 220 KD 단백질에 의해서 매게되는 것으로 나타났다. 그리고 latex particle을 담고 있는 식포막은 면역형광형미경적 조사에서 세포막과 차이가 없었다. 따라서 겐포막은 항원 조성에 있어서 비 선택적으로 세포막에서 유도되는 것으로 나타났다.
섬유소 또는 이를 함유하는 물질을 원료로 당 혹은 단세포단백질을 생산하고자 하는 수 많은 연구가 시도되었다. 기질인 섬유소 혹은 이를 함유하는 물질이 구조가 복잡하여 수용성인 일반 효소기질과 달라서 이를 이용하고자하는 연구에 많은 문제점을 갖고 있으며 실험실 연구 결과를 실제 응용하는 면에서도 어려움을 주고 있다. 본고에서는 이를 물질의 생물학적 분해에 관계되는 물리 및 화학적인 성질을 간단히 살펴보았다.
Methanol이용 미생물의 집적배양을 통해 토양 및 하수로부터 분리하여 그 중에서 비교적 생육속도가 빠른 균주를 선별하였다. 이 균주는 형태적, 생리적 특성에 따라 Methylomonas methanolica로 동정되었으며 obligate methylotroph 이었다. 균체 생산량을 높이기 위한 배지조성과 배양 최적조건을 검토한 결과, 탄소원으로는 methanol 0.8%(v/v), 질소원은 $(NH_4)_2SO_4$ 0.6%, 금속이온은 $MgSO_4.$$7H_2O$ 0.1%이었고, 최적 pH는 6.3, 최적 배양온도는 $32.5^{\circ}C이었으며,$ 생육인자는 요구되지 않았다. 그리고 최적 배양조건에서 1ι용 fer-mentor를 사용하여 회분배양을 하였을 때 최대 비증식속도 0.19$hr^{-1}$, 균체수율은 0.47g dry cell/g-methanol이었다. Chemostat를 이용한 연속배양시 균체생산을 위한 최적희석률은 D=0.1 $hr^{-1}$이었고 이때의 균체생산속도는 0.21g- dry cell/hr이었다. 생산된 건조균체의 단백질과 핵산함량은 각각 73%, 12% 이었다.
본 연구는 생균제로 이용할 수 있는 균주개발을 목적으로 돈분에서 성장능력과 내산성이 우수한 Candida sp. 를 분리하였고, API kit를 이용하여 동정하였을 때 Candida utilis로 확인되었다. Candida utilis는 cellulase, phytase활성이 높은 것으로 관찰되었으며, PDB배지에서 18시간 배양시 $6.5{\times}109\;cfu/ml$로 최대로 성장하는 것으로 나타났다. 또, pH 1.5에서도 약 22%의 미생물수($1.34{\times}107\;cfu/ml$)가 잔존하여, 내산성이 강한 것으로 나타났다. 또, $60^{\circ}C$이상의 고온에서는 사멸하였으나 정상적인 생체온도에서는 열 안전성이 있는 것으로 나타났다. 이상의 결과로부터 분리한 Candida utilis는 생균제 및 단세포단백질 생산에 충분히 이용가치가 있는 것으로 확인되었다.
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[게시일 2004년 10월 1일]
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