• 한국동물학회지
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• 제31권1호
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• pp.21-28
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• 1988

dbcAMP에 의해 성숙이 억제된 생쥐난자의 수정능을 조사하기 위해 본 실험을 행하였다. dbcAMP로 일시 성숙이 억제되었던 난자를 배양액내에서 정자와 섞고 24시간 배양한 후 발생한 2세포기의 배아형성, 정자의 관입, 전액형성을 조사하여 2세포기로 배아발생이 진척된 것을 수정율의 기준으로 정하였다. dbcAMP를 처리하지 않은 난자는 약 53.3%의 수정율을 보였으며,dbcAMP가 함유되 배양액에서 배양한 후 기본 배양액에서 성숙시킨 난자들의 수정율은 dbcAMP의 처리시간에 비례하여 낮으나, 정자의 관입은 정상적으로 일어났다. 전자현미경적 관찰에 의하면 dbcAMP 처리는 난자의 미세구조에 어떠한 변화도 야기하지 않았다. 따라서 dbcAMP를 사전처리하여 성숙을 억제한 난자라할지라도 어느 정도의 수정능력을 보유하고 있다고 사료된다.

• 한국수정란이식학회:학술대회논문집
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• 한국수정란이식학회 2002년도 국제심포지엄
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• pp.72-72
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• 2002

조류는 발생학적 특성상 수정과 초기 배발생을 제외한 거의 대부분의 개체발생 과정이 난각 속에서 진행된다. 그러므로 수정란에 생명 공학적 기법을 적용하는데 있어서, 포유류의 경우 여러 생명공학 기법이 적용된 수정란은 초기발생을 위한 체외배양 이후 반드시 모체에 이식되어야 하지만, 조류의 경우 인공적인 체외배양 체계가 확립되어 있어야 생명공학 기법이 적용된 수정란을 개체까지 발생시킬 수 있게 된다. 닭의 난자는 난관 누두부에 배란 후 약 15분내에 정자의 침입을 받아 수정되어 난관 팽대부에 도달하면 1세포기 수정란이 된다. 그 후 수정란이 협부에 도달하면 최초로 분할이 일어나기 시작하여, 방란시에는 그 세포수가 60,000개에 이르게 된다. 한편, 계란의 형성 과정에서는 다량의 난황을 포함한 난자가 난관 누두부로 배란되어 정자와 만나게 되면 수정란으로서 계란 형성이 계속되고 정자와 만나지 못하게 되면 무정란으로서 계란 형성을 계속하게된다. 배란된 난자가 난관누두부를 거쳐 난관팽대부에 도달되면 난자는 농후난백에 의해 둘러싸이게 되고 난관혈부에 도달되면 난각막이 형성되고 수양성 난백이 침적하게 된다. 그 후, 난관협부를 지난 난자는 난관자궁부에 도달되면 20시간이상 그곳에 머물면서 난각형성이 진행된 다음 방란된다. 따라서 수정란에 외래유전자를 미세주입하여 형질전환 닭을 생산하기 위해서는 수정란을 암탉의 난관 내에서 최초 분할되기 전에 외부로 끄집어내어야 하며, 수정란에 외래 유전자를 미세주입한 다음에는 다시 암탉의 난관내로 이식해야 하지만 현재까지 그러한 기술은 확립되어 있지 못하다. 그렇기 때문에 모체의 난관 속에서 일어나는 배 발생과 그 이후 개체까지의 발생을 위하여 인공적인 체외배양 체계가 확립되어 있어야 한다. 따라서 본 발표에서는 형질전환 닭을 생산하기 위한 양질의 1세포기 수정란 획득 방법과 획득된 수정란의 체외 배양방법에 관하여 기술적인 측면에서 고찰 해보고자 하며, 그와 같은 배양 기술을 이용하여 외래유전자를 도입한 일련의 결과에 관하여 보고 하고자한다.

• 한국동물학회지
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• 제33권1호
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• pp.53-62
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• 1990

양서류의 여포난자를 생체외에서 배양하면서 호르몬을 처리하면 난자의 성숙(핵붕괴)을 일으킨다. 본 연구는 북방산개구리의 여포난자를 배양하면서 난자내 단백질 분해효소들의 활성변화를 유도하여 이것이 난자의 성숙에 어떠한 영향을 미치는가를 조사하였다. chymotrypsin의 저해제로 알려진 N$\alpha$ -tosyl-L-phenylalanine-chloromethyl-ketone(TPCK)을 배양액에 처리하면 비교적 낮은 농도(0.001-1 $\mu$M)에서는 호르몬의 도움없이도 난자의 성숙을 유도하나 높은 농도 (100 $\mu$M)에서는 호르몬에 의한 난자의 성숙까지도 억제하는 이중적인 효과를 나타내었다. Trypsin의 저해제인 N$\alpha$ -tosyl-L-phenylalanine-chloromethyl-ketone(TPCK)은 성숙유도능력이 없을 뿐 아니라 progesterone에 의한 난자의 성숙을 억제하였다. Trypsin을 직접 처리했을 때에는 농도에 의존하여(0.001-1$\mu$g/2ml) 호르몬의 도움없이도 난자의 성숙을 유도함을 발견하였다. TLCK나 TPCK의 억제효과는 성숙 초기에만 나타났다. 본 결과는 양서류 난자의 성숙조절 과정에 몇종의 단백질 분해효소들이 참여한다는 것을 시사해주고 있다.

• 농업과학연구
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• 제34권1호
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• pp.13-18
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• 2007

본 연구는 난자의 채취시기, 배양액에 BSA, cysteine, myoinositol 첨가가 난자의의 체외성숙에 미치는 영향을 조사하였다. 1. 휴지기, 난포기, 황체기로 구분한 난소로부터 채취한 난포란을 배양하였을 때 체외성숙율은 각각 $0.0{\pm}0.0%$, $10.0{\pm}4.1%$와 $5.7{\pm}1.6%$로서 난포기에 채취한 난자가 휴지기와 황체기의 난자에 비해 체외성숙율이 높게 나타났다. 2. 휴지기, 난포기, 황체기 난포로부터 회수한 난자를 5% BSA와 0.1 mM cysteine를 첨가한 TCM-199 배양액에서 배양했을 때 체외성숙율은 각각 $0.0{\pm}0.0%$, $15.8{\pm}4.7%$와 $5.6{\pm}1.5%$로서 난포기의 난자가 가장 높은 체외성숙율을 나타냈다. 3. 휴지기, 난포기, 황체기 난포로부터 회수한 난자를 5% BSA와 10mM myoinositol를 첨가한 TCM-199 배양액에서 배양했을 때 체외성숙율은 각각 $0.0{\pm}0.0%$, $18.4{\pm}4.6%$와 $5.7{\pm}1.9%$로서 난포기 난자의 체외성숙율이 가장 높게 나타냈다.

• 한국가축번식학회지
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• 제23권4호
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• pp.323-331
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• 1999

본 연구는 돼지난자의 체외성숙동안 insulin-like growth factor-I (IGF-I)과 난구세포의 영향을 검토하기 위하여 실시하였다. 미성숙난자를 0(60%), 1(61%), 5(62%) 및 l0ng/$m\ell$(72%)의 서로 다른 IGF-I의 농도로 첨가하여 배양했을 때 체외성숙율은 큰 차이를 나타내지 않았다. 또한 10ng/$m\ell$의 IGF-I이 첨가된 배양액내에서 난자를 배양한 경우, 난구세포부착시 (68%) 제거 (52%)된 난자에 비해 높은성숙율을 나타냈지만 유의적인 차이는 인정되지 않았다. 그러나 IGF-I이 첨가되지 않은 경우에는 난구세포 부착 (63%) 난자가 제거 (32%)된 난자에 비해 유의적 (P＜0.05)으로 높은 성숙율을 나타냈으며, IGF-I를 성숙 배양기간중 전반기 24시간 또는 후반기 24시간 동안만 첨가했을 때의 난구세포 부착시 (61과 49%) 제거된 (45 와 49%) 난자에 비해 높은 성숙융올 나타냈다. 한편, IGF-I의 존재 여부에 관계없이 FCS와 돼지난포액 (PFF)이 무첨가된 배양액에서 48시간동안 또는 배양전반기 24시간동안 난구세포를 제거한 경우 (16과 18%)로 난구세포 부착시 (46과 63%)에 비해 유의적 (P＜0.01)으로 낮은 성숙율을 나타냈다. 이와 같은 결과는 난구세포가 IGF-I의 존재 유무에 관계없이 난자의 체외성숙에 필수적이며, FCS와 PFF 첨가시 난구세포가 제거된 난자의 체외성숙을 촉진하는 것으로 밝혀졌다.

• 한국수정란이식학회지
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• 제22권1호
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• pp.21-26
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• 2007

본 연구는 mSOF(modified synthetic oviduct fluid medium) 배양액을 이용하여 $100{\mu}1$와 $10{\mu}1$ 배양 소적에서 일본 흑우의 수정란 생산 효율을 개선하기 위하여 수행하였다. 난구세포가 부착된 미성숙 난자는 각각 단독 배양조건($S;\;10{\mu}1$ 소적) 및 그룹 배양 조건 ($G;\;100{\mu}1$ 소적)에서 실시하였고 배양액은 TCM-199의 기본 배지에 10% FCS, 0.02IU/ml FSH와 $1{\mu}g/ml$ $estradiol-17{\beta}$를 첨가하여 사용하였다. 배반포 단계로 발육한 수정란은 1.5M ethylene glycol로 직접 이식법에 의한 동결 방법으로 동결을 실시하였고, 세포수는 융해 후 생존 수정란에 대해 조사하였다. 체외 배양 시간이 $16{\sim}17$시간 배양 조건에서 난자의 성숙율은 그룹 배양 조건$(27.1{\pm}16.8%)$보다는 단독 배양조건$(57.1{\pm}15.0%)$에서 성숙율이 높았다(p<0.05). 그러나 체외 배양 시간이 $18{\sim}19$ 시간과 $20{\sim}21$시간 배양시는 유사한 성숙율을 보였다. 난자의 체외 배양율은 체외 배양 시간의 증가에 의해 성숙도가 $86.3{\pm}9.9%$로 증가하였다. 접합체(zygote)의 분할율은 단독이나 그룹 배양 조건에서도 유사한 결과를 얻었다. 배반포 발달율은 배양 $7{\sim}8$일째에 조사한 결과 단독 배양 방법보다는 그룹 배양 방법에서 발달율이 높았으나, 분할된 접합체를 기준으로 한 경우 배반포 발달율$(S;\; 21.4{\pm}10.6%,\;G;\;39.0{\pm}13.1%)$에서는 유의적인 차이가 없었다. 단독 배양과 그룹 배양에서 $6.5{\pm}8$일 사이에 배반포로 발달된 수정란의 세포수 조사에서는 유사한 결과를 얻었다. 동결 융해 후 24시간 배양 후 배반포 생존율(5; 24.2%, G; 30.2%), 부화율(S: 20.9%, G: 12.7%) 및 생존 수정란수(S; 45.2%, G: 42.8%)에서도 배양 조건에 따른 유의적인 차는 없었다. 결론적으로 mSOF배양액을 이용하는 경우 미성숙 난자의 체외 성숙 유도 배양 시 단독이나 그룹 배양 시 배반포 발달율에서 그룹간에 유의적인 차가 인정되었다(p<0.01).

• 한국발생생물학회지:발생과생식
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• 제11권3호
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• pp.263-272
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• 2007

생쥐의 난자는 특별한 첨가물이나 난구세포 없이 체외 배양해도 성숙율이 높은 반면 돼지 난자의 체외성숙율은 매우 낮다. 본 연구는 이러한 차이의 원인을 연구하기 위하여 생쥐와 돼지 난자의 에너지 생성에 관여하는 유전자인 malate dehydrogenase(Mor2)의 기능을 RNAi를 이용하여 비교 분석하였다. 생쥐와 돼지 각각의 Mor2 double-stranded RNA(dsRNA)를 제작하고, 생쥐는 난구세포를 제거한 미성숙(GV) 난자의 세포질에 mMor2 dsRNA를 미세 주입한 후 16시간 동안 배양하였고, 돼지는 난구세포를 제거하거나(DO) 혹은 그대로인 상태(COCs)로 pMor2 dsRNA를 미세 주입한 후 48시간 동안 배양하였다. 사용한 배양액은 M199에 10%의 porcine follicular fluid, pyruvate, p-FSH, EGF, cystein, estradiol-$17{\beta}$ 등이 첨가된 배양액을 사용하였고, 배양 후 난자의 형태학적 변화를 관찰하고, Mor2 mRNA양의 변화를 RT-PCR로 확인하여 RNAi 결과, 염기서열 특이적으로 Mor2 발현이 억제됨을 확인하였다. 돼지 난자의 pMor2 RNAi 결과, DO 난자에서는 약 58%의 난자가 MI에서 성숙이 억제되었으나, COCs에선 84.4%가 MII로 성숙하는 것을 볼 수 있었다. 이는 돼지의 난구세포가 난자 성숙에 매우 중요하며, 특히 malate 공급에 관여할 것임을 시사한다. 선행 연구 Mor2 RNAi 결과, 생쥐는 GV에서, 본 연구에서 돼지는 MI에서 성숙이 정지되었기 때문에 이러한 차이가 배양액의 차이인지 다시 mMor2 RNAi 후 생쥐 난자를 M199 배양액에 16시간 동안 배양한 후 성숙율을 관찰하였더니 MII로의 성숙율은 62%로 대조군과 비교하여 큰 차이가 없었다(non-injected: 76.8%, buffer-injected: 73.3%). 이는 mMor2 RNAi 결과가 배양액의 조성에 의해 극복될 수 있음을 보여준 결과다. 생쥐와 돼지에서 서로 다른 대사과정을 갖고 있음은 바로 이 두 종에서의 체외성숙율 차이의 원인이 될 수 있을 것이며, 앞으로 두 종에서의 난자와 난구세포간의 상호작용 및 대사 경로 등에 관한 심도 깊은 비교 분석 연구를 통하여 돼지의 체외성숙율을 증가시킬 수 있는 배양 시스템의 개발이 가능할 것으로 기대된다.

• 한국수정란이식학회지
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• 제18권2호
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• pp.109-113
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• 2003

본 연구는 고양이의 불임 해결을 위한 방안의 하나로써 체외수정란을 생산할 목적으로 난자의 형태, 보존 및 번식주기별 난자의 체외발생에 미치는 영향을 조사하였다. 1. 신선 난소로부터 회수한 난구세포부착 및 나화 난자를 각각 배양했을 때 GV 및 MI으로의 체외성숙율은 74.3%와 25.7%와 및 28.6%와 11.4%,로써 난구세포 부착 난자가 나화 난자의 비해 높은 체외성숙율을 나타냈다. 2. 휴지기, 난포기 및 황체기 단계로 구분하여 채취한 난구세포 부착 난포란을 배양하였을 때 GV 및 MI기로의 체외성숙율은 각각 88.6%와 6.5%, 60.0%와 11.4%, 77.1%와 5.7%였다. 3. 신선 및 salt에 보존한 난소로부터 회수한 난구세포부착 및 나화 난자를 각각 배양했을 때 GV 및 MI으로의 체외성숙율은 74.3%와 25.7%, 37.1%와 11.4% 및 57.1%와 13.3%, 17.1%와 3.3%으로서 난구세포 부착 신선난자가 나화 또는 salt 보존 난자에 비해 높은 체외 성숙율을 나타냈다.

• 한국수정란이식학회지
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• 제17권3호
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• pp.195-201
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• 2002

본 실험은 원시난포의 체외배양 체계를 확립할 수 있는 가능성을 검토하기 위해 0, 5, 10, 15 및 20일령 마우스에서 분리한 난소를 20, 15, 10, 5 및 0일동안 organ culture 하여 난소의 성장률, 난자의 회수율과 성장률 및 난자의 핵성숙 단계를 조사하여, 비교 ·검토하였다. 그 결과를 요약하면 다음과 같다. 1. Organ culture 전과 후의 각 일령에 따른 난소의 면적 차이는 0일령 35.9%, 5일령 8.7%, 10 일령 1.2% 및 15일령 14.4%로 15일령을 제외 하고는 배양일령이 증가할수록 면적 차이는 감소하였다. 2. Organ culture 후 난자의 회수율과 난자의 직경은 배양일령이 증가할수록 증대되었다. 3. GV기 이상의 핵성숙은 organ culture 후 배양 일령이 증가할수록 진행되는 단계에 있는 것으로 나타났다.

• 한국수정란이식학회지
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• 제17권3호
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• pp.203-209
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• 2002

본 실험은 원시난포의 체외배양 체계를 확립할 수 있는 가능성을 검토하기 위해 10일과 20일령 마우스의 난소에서 분리한 난포를 체외배양하여 난포의 형태변화, 난자의 성장를 및 난자의 핵성숙단계를 조사하여 비교하였다. 그 결과를 요약하면 다음과 같다. 1. 10일령과 20일령의 마우스에서 분리한 난포는 배양 6일째부터 난포강이 형성되었다. 2. 10일령과 20일령 마우스의 난소에서 분리한 난포의 수는 평균 21.5와 33.3개였고, 배양하기 전에 투명대를 제외한 난자의 직경은 51.85 $mu extrm{m}$와 57.50 $\mu\textrm{m}$였으나, 10 일간 배양한 후 측정한 난자의 직경은 55.95 $\mu\textrm{m}$와 63.11 $\mu\textrm{m}$로 증가하였다. 3. 10일령과 20일령에서 M II까지 핵이 성숙된 난자는 각각 4.3%와 22.1%였고. GVBD기 이상은 각각 14.5%와 61.1%였다.