고추 역병이 발생한 충주, 안면, 태안, 안동, 음성 그리고 괴산지역의 고추밭 토양에서 전체 10,753균주의 저영양 미생불을 분리하였다. 이들 중 Phytophthora capsid를 포함하여 식불체의 주요 병원성 곰팡이에 대해 길항작용을 보이는 균주들을 일차적으로 선발하였다. 최종적으로는 온실 고추유묘 검정을 통해 고추 역병에 대해 탁월한 방제가를 보이는 7F 균추가 선발되었다. 이 균주는 16SrDNA염기서열 분석과 API20 NE 키트를 통한 생리, 생화학적 분석을 통하여 Bacillus subtilis로 동정 되었다. 고추 역병균 포자를 처리한 고추 유묘 화분 검정에서, 처리25일 후 대조구는 고추 역병 이병 비율이 87%에 이르는 반면에 7F 균주를 처리한 처리구에서는 단지 6%의 이병율을 보였다.
국내의 고추 포장에서 나타나는 시듦 증상의 원인을 규명하기 위하여 2010년부터 2014년까지 5년 동안 충북 괴산의 고추 재배 포장에서 시듦 증상을 보이는 고추의 발병도를 조사하였다. 조사한 연도에 따라서 시듦 증상에 대한 발병에는 차이가 있었지만, 조사하는 시기가 6월과 7월을 지나 8월이 되면서 발병도가 높게 상승하였다. 이 시기 동안 시듦 증상을 보이는 고추에서 Ralstonia solanacearum이 Phytophthora capsici보다 4배 높은 비율로 분리되었다. 충북 괴산과 경북 안동의 포장에서 2013년과 2014년의 2년 동안 채집한 시든 고추에서 병원균을 분리하여 보아도, 조사한 전체 포장 중의 20.3%에서 R. solanacearum이 분리되었으며, 역병균인 P. capsici는 3.8%의 포장에서만 분리되었다. 시듦 증상이 높은 비율로 나타났던 해에는 평균기온이 높았으며, 고추 풋마름병 예찰 모델로 추정된 풋마름병의 초발생일도 빨라짐을 알 수 있었다. 역병 발생 위험 일수와 실제 시듦 증상 발생 빈도의 결과가 부합하지 않는 것은 재배 현장에서 역병 저항성 품종의 사용이 일반화되어 있기 때문이라고 생각한다. 이런 결과를 통해서 역병 저항성 고추 품종이 재배 현장에 도입된 이후, 포장에서 관찰할 수 있는 시듦 증상의 원인은 P. capsici에 의한 역병보다는 R. solanacearum에 의한 풋마름병이었다.
점액세균은 토양에서 식물 병원균의 활성을 억제하는 2차 대사산물들을 분비하는데, 이들은 기존의 길항균들의 항생물질과는 전혀 다른 생리활성물질이므로 생물방제에 활용이 기대되는 미생물이다. 고추 역병 생물학적 방제를 위해 토양 미생물인 점액세균의 길항능력을 기내에서 검정한 후, 자실체 및 액체배양 여액을 엽권과 근권에 처리하여 온실에서 생물 검정하였다. 점액세균 생리활성 물질이 남아있는 PDCY 배지에 역병균을 접종한 결과 점액 세균 Myxococcus spp. 세 균주 중 KYC 1126과 KYC 1136은 균사생장을 완벽히 저해하였다. 토양 내 점액세균 생리활성물질 분비를 극대화하기 위해 기내에서 다량의 자실체 형성을 위해 먹이인 E. coli를 먼저 배양 후 점액세균 KYC 1126을 치상하는 방법을 확립하였다. 이 방법으로 토양에 자실체를 먼저 투입하고 역병을 관주접종한 결과 방제 효과가 없었다. 한편 시험관에서 역병균 유주포자 현탁액과 점액세균 CYE 액체배양여액을 혼합한 후 고추 뿌리에 침지 접종한 결과 역병 발병을 지연시켜 배양여액의 길항능력을 확인하였다. 점액세균 배양여액을 엽권에 살포하거나 근권에 침지한 방제가는 각각 88%와 40%로서 dimethomorph+propineb의 100%와 propamocarb의 44%에 버금가는 결과였다. 배양여액을 기존 처리의 약 2배인 24시간 이상 뿌리에 침지하면 약해가 발생하였는데, 그 증상은 고추 묘에서 줄기가 잘록해지고 잎이 말려 들어가며 점액성의 물질이 뿌리를 덮어 썩는 것이었다. 선발된 점액세균 KYC 1126의 대량 생산 방안이 확보되면, 배양여액을 엽권에 예방적으로 정기 살포함으로써 고추 역병의 생물학적 방제를 달성할 수 있을 것으로 기대된다.
비경작 산림 토양으로부터 고추역병 억제와 초기생육 촉진 효과를 보이는 방선균을 분리하였다. 분리된 Streptomyces griseofuscus 200401은 역병균 뿐만 아니라 탄저병에 대하여 항균활성을 보였다. 분리 미생물 배양액과 그 제제의 생육초기단계 처리로 식물체의 엽수, 생물 중 및 건물 중 등이 대조구에 비해 증가하였다. 공시균주 배양액 중 유기질소원의 분해에 의한 ammonium chloride의 농도는 배양 후 0.13 ${\mu}g/ml$로 나타났다. 분리균주의 온실에서 고추역병 발생억제 효과를 검정한 결과, 1주일 간격으로 3회 처리한 경우 최종방제가가 37.3%로 대조약제와 유사하게 나타났다.
3가지의 식물체 추출액을 공시하여 P. capsici에 대한 항균 활성 검정, 고추 역병에 대한 방제효과 및 고추에 미치는 약해를 조사한 결과는 다음과 같다. 1. 3가지 식물체 물 추출액 중에서 일황련 추출애기 균새장 억제효과가 가장 뛰어났으며, 2배의 희석농도에서 70% 이상의 억제 효과가 있었고, methanol 추출액의 경우 1,000배 이상의 희석농도에서도 74.4%의 억제 효과가 있었다. 지모 및 일황련 추출액의 2개 희석농도와 황백나무의 추출원액 처리에 의해 P.capsici의 유주자낭의 발아는 완전히 억제되었다. 2. Methanol에 의한 추출액이 상온에서 물에 의해 추출하거나, 끓여서 추출한 액보다 항균력이 우수하였다. 3. 세 가지 식물체 추출액 모두 저장기간이 길어짐에 따라 고추 역병균에 대한 항균력은 감소하는 경향을 보였다. 4. 세 가지 추출액 모두 고추 역병에 대해서 방제효과가 있었고, 그 중 일황련 추출액이 가자 효과적이며 황백나무 및 지모의 순이었다. 5. 수경 재배형식의 유모검정에서는 고추묘에 약해가 있었으나, pot시험에서는 약해가 없었다. 또한 고추 종자에 추출액을 처리했을 때 발아가 저해되거나 유근의 신장이 억제되는 등 약해가 유발되어쓰나, 고추 잎과 고추 과실에 추출애글 엽면살포 하였을 때에는 아무런 해가 나타나지 않았다.
Bacillus velezensis HKB-1가 표고버섯 수확후배지 퇴비로부터 분리되었으며 고추역병균(Phythopthora capsici), 인삼모잘록병균(Rhizoctonia solani), 고추탄저병균(Collectotrichum coccodes) 및 시들음병(Fusarium oxysporium)의 균사체 성장을 70% 이상 억제하는 항 진균 활성을 보였다. B. velezensis HKB-1은 표고버섯 수확후배지 퇴비 물 추출물과 당밀 1% 첨가배지에서 다른 상업용 세균배지보다 10~100배 더 높은 세균증식률을 보였으며 고추 역병균의 균사체 생장을 90% 억제하였으며 고추생육 촉진효과 및 고추역병에 대하여 70% 이상의 방제효과가 있었다.
고추 역병은 그 동안 우리나라 고추 생산에 있어서 심각한 수량감소의 피해를 주어 왔으며, 2004년 처음으로 고추 역병 저항성 품종이 보급되기 시작하면서, 국내 건고추 육종에 있어서 역병 저항성의 도입은 필수불가결한 것으로 되었다. 그러므로 저항성 식물체 선발의 정확성 제고 및 육종의 효율 향상을 위하여 역병 저항성과 연관된 분자표지의 개발이 요구된다. 지금까지 고추 역병 저항성 주동 유전자에 연관된 분자표지가 일부 개발되어 있지만, 부분적으로 밖에 사용할 수 없다는 문제점이 있다. 따라서 본 연구에서는 역병 저항성 소재에 상관없이 저항성을 구별해 낼 수 있는 분자표지를 개발하고자 하였다. 이를 위해 '수비초' ${\times}$ 'CM334' 조합의 $F_2$ 분리집단($SF_2$)과 역병 저항성 시판 $F_1$품종('독야청청')을 자가수정한 $F_2$ 분리집단($DCF_2$)을 만들었다. BSA-AFLP 방법으로 총 1,024 프라이머 조합을 사용하여 역병 저항성과 연관된 세 개의 AFLP 분자표지(AFLP1, AFLP2 및 AFLP3)를 선발하였으며, 이를 CAPS 분자표지(M1-CAPS, M2-CAPS 및 M3-CAPS)로 전환하였다. 이 중 M3-CAPS 분자표지를 10개의 역병 저항성 계통, 14개의 이병성 계통, 'CM334'를 화분친으로 사용한 5개의 $F_1$ 조합, 그리고 53개의 시판 $F_1$ 품종에 적용해 본 결과, 역병 저항성 표현형과 M3-CAPS 분자표지의 마커형이 잘 일치하였고, P5-SNAP과 Phyto5.2-SCAR 분자표지보다 높은 실용성을 보이는 결과를 얻었다. 따라서, M3-CAPS 분자표지는 역병 저항성 고추 계통 육성에 많은 도움을 줄 수 있을 것으로 생각한다.
본 시험은 고추의 육종을 위한 병 저항성 고추를 선발하고자 하였다. 국내에서 시판중인 역병 저항성 품종인 PR계통 21품종, 미국에서 도입해온 36품종과 역병감수성 품종인 '슈퍼마니따'를 사용하여 역병, 탄저병, 흰가루병의 병 저항성 검정을 수행하였다. $Phytophthora$$capsici$에 의해 발병하는 고추역병의 유묘검정은 서로 다른 교배형(A1, A2, Sterile)을 가지는 3 균주를 사용하여 접종하였다. 그 결과 대부분의 PR계통 고추들은 각각의 교배형에 대하여 저항성 또는 중도저항성을 나타내는 것으로 조사되었다. '역강홍장군'은 서로 다른 교배형의 세 가지 균주에 대하여 저항성을 나타냈으며, 'PR-다따'와 'PR-마니따'는 각각의 교배형에 저항성 또는 중도저항성을 보였다. 외래종의 경우, 'NuMex J.E.Parker', 'Omni Color'과 'SCM-334' 품종은 세 가지 균주에 저항성을 나타냈고, 'Sweet Banana'와 'Tabasco'를 포함한 몇몇 품종들은 각각의 균주에 중도저항성을 나타냈다. 흰가루병에 대하여 'Orange Habanero', 'black Cuban'은 저항성을 나타냈으며, '슈퍼마니따'와 'PR 금동'은 중도저항성을 나타냈다. 'Santa Fe Grnade', 'NuMex Pinata' 품종은 흰가루병에 매우 심한 감수성인 것으로 조사되었다. 탄저병의 경우, 'Aji Limon'과 'C. baccatum var. pendelum 3-4' 품종은 저항성인 것으로 조사되었다. 'Pobalno', 'Omni Color', 'Negro', 'Mesilla', 'Mulato', 'Bhut Jolokia', 'Big Dipper', 'Black Cuban', 'NuMex Pinata'와 'NuMex Big Jim'은 중도저항성을 나타내는 것으로 조사되었다. '태산'을 제외한 대부분의 PR계통들은 탄저병에 대하여 감수성 내지 심한 감수성인 것으로 확인되었다. 본 연구에서 확인된 저항성 개체는 이후에 고추 병저항성 육종에 유용한 유전자원으로 이용될 수 있다.
경북 경주지역의 저병해 고추경착지역의 토양으로부터 생물학적 방제기작중의 하나인 항생물질을 생산하는 길항미생물을 분히하기 위하여 70여종의 세균을 분리하였으며 이들을 대상으로 고추역병균 Phytophthora capsici를 가장 강력하게 길항하는 균주를 최종 선발하였다. 선발균주는 Chryseomonas luteola로 동정되었고 방제 기작은 약한 siderophore 생산성과 cellulase 생산성도 기인되었으나 항생물질 생산성이 주요 기작임을 확인하였다. 항진균성 항생물질의 대량생산의 기초자료로 활용하고자 항생물질 생산의 최적배지 조건 및 배양조건을 조사하였는데 길항균주의 항생물질 생산에 미치는 탄소원의 영향은 0.45% N-acetyl-D-glucosamine과 0.15% D(+) cellobiose에서 81%와 89%의 P. capsicivh자의 성장 억제율을 나타냈다. 질소원의 경우는 0.55% $NH_4$CI 첨가시 69%의 억제율을 나타냈고 무기염의 영향에 있어서는 0.01% KCI을 사용했을 때 63%의 억제율을 나타냈다. 또한 배양 조건에 있어서는 pH 7.0m $30^{\circ}C$에서 84시간 배양시 가장 높은 항진균성 항생물질 생산성을 나타내었다. 토양내에서 실제로 생물방제력을 발휘하는지를 확인하기 위하여 고추를 이용한 in vivo pot test를 실시한 결과 P capsici 만 처리한 것은 고추역병 현상을 나타냈고, P capsici 와 길항균 C luteola 5042를 함께 처리한 것은 역병 현상이 나타나지 않았다. 이것으로 길항균주는 C luteola 5042 P capsici 의 성장을 저해하여 고추 역병의 발병을 억제한다는 사실을 확인할수 있었다.
토양 우점능이 강한 생물학적 방제제 제조를 위해 경북지역 토양에서 길항균주를 분리하고 이들 중 Fusarium oxysporum, Phytophthora capsici 에 강력한 길항능을 보이는 Pseudomonas sp. 4059 를 선발, 동정하였다. Pseudomonas sp. 4059 의 시들음 병균 Fusarium oxysporum, 고추 역병균 Phytophthora capsici 에 대한 길항기작은 내열성 저분자의 항생물질과 철이온을 특이적으로 흡착하는 siderophore의 생산에 의한 것이다. Pseudomonas sp. 4059 는 항진균성 항생물질 Phenazine 생산 유전자를 소유하며 Salkowski test에 양성인 옥신류 생산도 한다는 것을 확인하였다. Pseudomonas sp. 4059 는 bioochemical tests, API test, MicroLogTM system을 통해 Pseudomonas fluorescens (biotype A)으로 98% 상동성을 보였으므로 이를 Pseudomonas fluorescens (biotype A) 4059 로 명명하였다. 선발된 길항균 Pseudomonas fluorescens (biotype A) 4059는 고추를 기주식물로 하였을 때 고추역병균인 Phytophthora capsici가 원인이 되는 고추역병을 in vivo 상에서도 충분히 억제할 수 있는 생물방제능을 나타내었다.
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[게시일 2004년 10월 1일]
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