• 한국수정란이식학회지
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• 제18권3호
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• pp.171-178
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• 2003

복제수정란 생산에 있어서 수핵란 내 체세포 주입 후 전기적인 융합은 필수과정인데, 이 과정을 거치는 동안 많은 수의 체세포 주입 난자가 융합에 실패하거나 lysis가 일어나게 된다. 본 실험에서는 한우 체세포를 이용하여 핵이식을 실시한 후 수핵세포질과 응합을 시도할 때 전기융합 방법에 따른 융합율과 배발달율을 검토하고자 실시하였다. 공여세포는 한우 귀 세포조직을 채취하여 0.05% trypsin과 EDTA가 첨가된 D-PBS로 세포를 분리한 후 DMEM 배양액으로 계대배양을 실시하여 사용하였다. 핵이식을 위하여 체외성숙시킨 난자를 탈핵용 micro pipette을 이용하여 투명대를 절개하고 수핵 난자의 극체 와 핵을 제거한 후 공여세포를 주입하였으며, 핵이식 수정란은 직접, 간접적인 전기적 자극으로 융합을 실시한 후 calcium iono-phore와 6-DMAP를 이용하여 활성화를 유도하였다. 활성화된 수정란은 38.5$^{\circ}C$, 90% $N_2$, 5% $CO_2$로 조정된 배양기에서 처음 3일은 0.3% BSA가 첨가된 CR1-aa 배양액에서, 배양 4일째부터는 10% FBS가 첨가된 CR1-aa 배양액에서 배양을 실시하였다. 본 연구결과를 요약하면 다음과 같다. 전기자극 융합방법에 따른 수핵난자의 융합율과 lysis율은 electric chamber를 이용하여 간접융합을 실시하였을 경우 51.6%와 10.7%를 보였고, needle을 이용하여 직접 융합을 실시하였을 경우 68.9%의 융합율과 11.5%의 lysis율을 보임으로써 needle을 이용한 직접융합 방법이 유의적으로 높은 융합율을 보였다(P<0.05). 융합 후 체외 발달과정을 살펴보면 난할율에 있어서 needle을 이용했을 시 80.3%로 chamber를 이용했을 시 73.2%보다 유의적으로 높은 난할율을 보였다. 초기배 발달단계인 2∼4세포기의 발달율 역시 needle을 사용한 구가 61.1%로 chamber를 사용한 구 54.1%보다 유의적으로 높은 차이를 보였다. 상실배 단계는 chamber를 사용한 구가 6.7%로 needle을 사용한 구 6.2%보다 약간 높았지만 유의적인 차이는 없었다. 하지만 이식 가능한 단계인 배반포배 발달율에 있어서는 needle을 사용하여 융합을 시도한 구가 26.3%로 chamber를 사용한 구 18.4%보다 유의적으로 높은 발달율을 보였다(P<0.05). electric chamber를 이용하여 전기융합을 시도시전류가 흐르는 wire와 주입된 체세포가 직각을 이루도록 정렬을 시키느라 많은 시간이 소요되고, 주입한 체세포가 세포질과 떨어진 난자는 전기자극을 주어도 융합이 일어날 수 없으며, 높은 전압을 사용하기 때문에 융합된 복제란의 lysis가 많이 발생하는게 가장 큰 단점으로 꼽을 수 있다. 하지만 미세조작기와 needle 방법을 이용하면 낮은 전압을 이용하여 융합을 시도하기 때문에 복제란의 lysis를 줄일 수 있고, 전극과 체세포 주입란을 정렬시키는 과정이 생략되어 시간이 절약되며, 결정적으로 주입된 체세포가 세포질과 떨어져 있더라도 미세조작기로 약간의 압력을 가하여 전기자극을 가할 수 있어서 보다 높은 융합율과 배반포배 발달율을 얻을 수 있기 때문에 needle을 이용한 직접적인 전기융합 방법이 체세포 복제수정란 생산에 효과적이라고 사료된다.

• 한국가축번식학회지
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• 제26권2호
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• pp.125-132
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• 2002

본 연구는 돼지 복제수정란의 생산성 향상에 기여하기 위한 기초연구로써 핵이식 수정란의 융합과 활성화 과정에 있어서 전기적 조건이 핵이식 수정란의 융합 및 체외발달에 미치는 요인들을 조사하기 위하여 실시하였다. 공여세포는 Landrace종의 귀 세포조직을 채취하여 0.05%의 trypsin과 EDTA가 첨가된 D-PBS로 세포를 분리하여 TCM-199 배양액으로 계대배양을 실시하여 사용하였다. 핵이식은 laser system으로 투명대를 drilling하여 수핵난자의 극체와 핵을 제거한 후 공여세포를 주입하였으며, 핵이식 수정란은 전기적 자극으로 융합과 활성화를 실시하여 분할을 유도하였다. 분할이 이루어진 핵이식 수정란은 10% FBS가 첨가된 NCSU-23 배양액으로 $CO_2$ 배양기에서 6~8일 동안 체외배양을 실시하여 배반포기로 발달을 유도하였다. 본 연구결과에서 얻은 결과를 요약하면 다음과 같다. 1.90kv/cm, 30$\mu$sec 1회의 전기자극으로 융합을 실시하였을 때 핵이식 수정란의 융합율은 1.90kv/cm의 조건이 49.5%로써 2.10kv/cm(25.8%)와 2.50kv/cm(30.3%)의 조건보다 유의적(P<0.05)으로 높았으며, 융합 후 활성화가 유기된 핵이식 수정란의 분할율은 2.50kv/cm 전기자극이 70.3%로써 가장 높게 나타났다. 핵이식 수정란을 30$\mu$sec 동안 1회와 2회의 전기자극으로 융합을 실시하였을 때 융합율은 모두 50%였으며, 60$\mu$sec 동안 1회와 2회의 조건에서도 각각 58.4%와 50.8%로써 전기의 자극시간과 횟수에 따른 차이는 없었다. 융합이 이루어진 핵이식 수정란의 전기활성화 유도 후 융합시의 전기적 조건에 따른 분할율은 30$\mu$sec동안 1회와 2회에 있어서는 49.1%와 56.5%로써 차이가 없었으나, 60 $\mu$sec 동안 2회(76.3%) 실시하였을 경우에는 1회(56.1%)에 비해 유의적(P<0.05)으로 높은 분할율을 보였다. 전기자극 후 융합이 이루어진 융합란의 분할율은 1.50kv/cm의 전기적 활성화 조건에서는 72.8%로써 유의적(P<0.05)으로 높았으며, 단위발생란의 분할율 60.9%와는 차이가 없었다. 핵이식 수정란의 배반포기로의 발달율은 1.50kv/cm의 융합조건에서는 9.8%가 배반포기로 발달하였으나, 1.25kv/cm 조건에서는 배반포기로의 발달이 전혀 없었다. 단위발생란의 배반포기로의 발달율은 6.4%로써 핵이식란(1.5kv/cm)과 유의적(P<0.05)인 차이가 없었다. 이상의 결과를 볼 때 핵이식 수정란의 배반포기로의 발달은 융합 및 활성화 과정에 있어서 세포종류, 전기자극의 세기 및 통전시간 등이 영향을 미치는 것으로 생각되며, 돼지 핵이식 수정란의 전기적 융합조건은 1.90kv/cm, 60$\mu$sec., 2회, 융합란의 활성화 조건에 따른 배반포기로의 발달율은 1.50kv/m가 적합한 것으로 생각된다. 따라서 적정 전기적 융합 및 활성화 조건을 확립한다면 핵이식 수정란의 융합율과 체외발달율을 보다 더 높일 수 있을 것으로 생각된다.

• Journal of Plant Biotechnology
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• 제29권3호
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• pp.179-183
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• 2002

상사화의 기내 대량증식에 미치는 배지의 조성을 구명하기 위하여 생장조절물질의 첨가량을 달리한 MS기본배지에 disk, 인경구내의 잎과 인편조직을 배양한 후 캘러스의 발생과 shoot 및 뿌리의 재분화양상을 조사하였다. Disk조직의 배양에서는 인편 사이의 기부조직에서 shoot가 발생하였으며, 2,4-D 혹은 NAA 1.0 mg/L ＋ BA 혹은 kinetin 2.0 mg/L가 혼용첨가된 배지에서 절편체당 4∼6개의 shoot가 발생되어 가장 좋은 반응을 보였다. 인편 내측의 잎절편을 배양한 경우 NAA 1.0 mg/L ＋ TDZ 2.0 mg/L 혼용구와 2,4-D 1.0 mg/L ＋ BA 1.0∼2.0 mg/L 혼용구에서는 잎조직의 기부에서 캘러스가 왕성하게 발생한 후 3∼6개의 shoot가 재분화하였다. 인편조직은 기부조직에서 캘러스가 발생하였으며 2,4-D 1.0mg/L와 BA 1.0∼2.0 mg/L처리구에서 왕성하였다 NAA 1.0mg/L와 TDZ 2.0 mg/L의 혼용처리구와 2,4-D 1.0 mg/L와 BA 1.0∼2.0 mg/L 혼용구에서는 최고 10∼12개의 shoot가 분화하여 가장 양호한 결과를 보였다. 뿌리는 각 배양체 모두 NAA 1.0 mg/L와 kinetin 2.0 mg/L 혼용구에서 가장 왕성하게 발생되었다. Shoot의 재분화는 disk나 잎조직에 비해 인편 조직을 배양한 경우가 적합한 배양부위로 조사되었는 바 유식물체의 대량증식에 가장 바람직한 방법은 인편조직을 이용하여 shoot를 재분화시킨 후 뿌리발생 배지에 계대배양하는 것이 적합하다고 판단되었다.

• Laboratory Medicine Online
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• 제7권1호
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• pp.13-19
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• 2017

배경: 저자들은 FLT3-ITD (fms-like tyrosine kinase-internal tandem duplication) 돌연변이의 정량 및 반복 염기 길이를 동시에 측정하는 정량 절편 분석법(fragment analysis)의 민감도를 평가하고, 분석적 성능을 검증하였다. 방법: FLT3-ITD 돌연변이의 정량과 수는 절편분석법으로 측정하였다. 변이 대립유전자와 정상 대립유전자를 혼합한 계대희석 표준물질로 절편 분석법, 일반 PCR법, 염기서열분석법의 FLT3-ITD 변이 검출한계를 측정하였다. 정상 공여자 50검체를 이용하여 특이도를 평가하였다. 급성골수성백혈병 환자의 481검체에 대하여 절편 분석법과 일반 PCR법으로 검사를 시행하고 그 결과를 비교 분석하였다. 결과: 절편 분석법의 돌연변이 최소 검출 농도는 5%였으며, 일반 PCR 검사법과 직접염기서열분석법은 각각 10%, 20%의 결과를 보였다. 급성골수성백혈병 환자의 481 검체를 분석한 결과, FLT3-ITD는 40.1% (193/481)에서 양성이었다. 변이 대립유전자의 정량값은 1.7-94.1% (중앙값 28.2%)로 다양하였으며, 반복 염기의 길이의 범위는 14bp-153 bp (중앙값 49bp)였다. 일반 PCR 검사법과 비교한 결과 방법간 일치도는 97.7% (470/481)였다. 절편 분석법이 일반 PCR 검사법에 비해 더 높은 민감도를 보였고, 11건의 돌연변이가 더 검출되었다. 이 중 7검체는 변이 대립유전자의 양이 10% 미만으로 일반 PCR 검사에서 검출되지 않았다(3.3-9.5%). 또 다른 불일치 세 검체에서는 PCR inhibitor의 영향으로 일반 PCR 방법에서 위음성 결과를 보였으며, 다른 한 검체는 돌연변이 중복 길이가 14 bp로 매우 짧아 일반 PCR에서 정상 밴드와 구별되지 않는 경우였다. 결론: 본 연구에서 저자들이 사용한 절편 분석법은 FLT3-ITD 돌연변이의 정량값과 중복된 길이를 동시에 측정할 수 있는 검사법으로, 민감하고 정확하여 급성골수성백혈병 환자에서 FLT3-ITD의 진단 및 추적 검사에 유용할 것으로 기대된다.

• 생물환경조절학회지
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• 제31권2호
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• pp.133-141
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• 2022

Bulbophyllum auricomum Lindl.은 희귀 난초이며 매력적인 향기가 지닌 꽃이 피어난다. 본 연구는 미세 증식을 위한 조직 배양 방법을 조사하였다. 인공 자가 수분으로부터 파생된 캡슐은 MS 기본 배지에서 최상의 종자 발아를 위해 얻어진다. 식물 성장 조절제(1.0 mg/L의 BAP 및 2.0 mg/L의 NAA)는 원괴체 유래 유사구근 절편체의 캘러스 유도에 영향을 받았다. 캘러스 계대배양을 위해 10가지 처리 배지에서 다른 천연물 추출물을 테스트하였다. 이 중 150ml/L 코코넛 워터를 첨가한 MS 배지는 일반적으로 1개월 및 2개월에 생중량(1.75 ± 0.08) 및 (3.01 ± 0.20) 캘러스 증식 및 PLB 유도에 효과가 있었고, 그 다음으로 바나나 30g/L와 감자 추출물 20g/L의 MS 조합이 뒤를 이었다. 식물 생장 조절제와 천연 추출물을 함께 첨가한 MS배지와 천연 추출물만 첨가한 MS 배지를 비교 연구한 결과, 천연 추출물(코코넛 워터 150ml/L)과 식물 생장 조절제(BAP 2.0 mg/L 및 NAA 1.0 mg/L)를 혼합하여 MS 배지에 첨가한 결과 배양 1개월 및 2개월 후에 각각 가장 높은 새싹 재생수로 (3.37 ± 0.17) 및 (6.41 ± 0.68)을 얻었다.

• 한국가축번식학회지
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• 제24권4호
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• pp.407-417
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• 2000

본 연구는 태아 섬유아세포를 이용한 소 핵치환 난자의 융합에 있어서 여러 조건의 전기자극 처리 후 그에 따른 발달율을 조사하였다. 임선 45 일령 태아로부터 섬유아세포를 분리하여 3~4 차례 계대배양후, 이들 단일 섬유아 세포들을 미세조작기를 이용하여 제핵된 난자의 위란강 내에 주입하였다. 본 실험에서는 첫째로, 다른 전기자극 조건의 적용에 따른 융합율 및 발달율을 비교 조사하였다. 180 V/mm 의 조건하에서 다른 조건의 전기자극 시간 (15, 30, 45 $\mu$see)을 처리하였을 때, 15 (45.5%, 120/264)나 30 $\mu$see (43.9%, 106/241) 처리구가 45$\mu$see (23.2%, 58/250) 처리구 보다 높은 융합율을 나타내었다 (P＞0.05). 그러나, 융합된 난자의 발달율에 있어서는 처리구 간에 차이가 나타나지 않았다. 다음 실험으로, 핵치환 난자의 체외발달에 있어서 15 $\mu$see 의 전기자극 시간의 조건하에서 다른 전장 (1.5, 1.8, 2.1 kV/cm)에 따른 효과를 조사하였다. 핵치환 난자의 융합이나 발달율에 전장에 따른 차이는 나타나지 않았다 (P＞0.05). 마지막으로, 체세포 핵치환과 체외수정에 의한 수정란의 체외 발달율을 비교 조사하였다. 태아 섬유아세포로 재구성된 수정란의 배반포로의 발달율은 27.4% (75/274) 로 나타났으며, 이는 체외수정에 의해 발달한 배반포의 비율(24.5%, 58/237)과 유사하다는 것을 알 수 있었다. 그러나, 핵치환에 의해 유도된 배반포의 평균 세포 수는 체외수정에 의해 유도된 배반포 보다 낮게 나타났다. 결론적으로, 본 실험에서는 체세포로 핵치환된 소 난자의 전기적 융합에 대한 조건 (1.8 kV/cm, 15 $\mu$see)을 확립하였다. 또한, 본 실험에서 나타난 결과들은 체세포로 재구성된 소 난자들이 비록 체외수정에 의해 생산된 배반포보다는 적은 세포수를 보여주었지만, 체외에서 정상적으로 배반포 단계까지 발달할 수 있다는 것을 제시하고 있다.

• 한국가축번식학회지
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• 제24권1호
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• pp.49-57
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• 2000

본 연구는 소 태아섬유아세포를 이용하여 핵이식 후 세포의 휴면처리, 세포의 passage 수 및 세포의 기원이 복제란의 발육에 미치는 영향을 검토하였다.3.57개 월령 한우 수컷 태아의 피부 및 간 조직에서 세포를 채취하여 체외에서 4∼6 회 계대배양 후 동결하였다가 핵이식에 사용하였다. 세포는 핵이식 전에 혈청기아처리를 하였으며, 대조구로는 활발히 분열 중의 무처리 세포를 사용하였다. Donor 세포는 미수정란의 탈핵세포질에 이식 후 전기융합 및 활성화를 실시하였고, 재구축배는 7∼9 일간 체외배양하여 발육농을 검토하였다. 배반포로 발육된 일부 복제란은 발정 7∼8 일째의 수란우에 이식하였다. 복제란의 배반포 발육율은 혈청기아 처리구 (25.3%)가 무처리구 (15.9%)에 비하여 유의적으로 높았으나 (P＜0.05), 세포의 passage 수 (4∼6회) 에 관계없이 23.1∼25.0%로 나타났고, 피부 및 간유래 복제란의 배반포 발육율도 23.8∼25.2% 로 두 조직세포 간에 차이가 없었다. 복제란의 이식 후 60일 및 120일에 수란우의 34.4% 및 15.6%가 각각 임신이 확인되었으며, 초자화동결된 태아 피부세포 복제란으로부터 1두의 수컷 송아지가 생산되었다. 본 연구의 결과는 복제란의 체외발육능이 세포의 휴면처리에 의하여 향상되었으나, 세포의 passage 수 (4∼6 회) 및 세포의 두 기원 (피부 및 간) 에 의해서는 영향을 받지 않으며, 태아 피부세포 유래 복제란으로부터 산자가 생산될 수 있음을 확증한다.

• 대한토목학회논문집
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• 제29권3B호
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• pp.303-310
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• 2009

천연 제올라이트는 효과적인 다공성 구조와 높은 양이온 교환능력을 가지고 있을 뿐 만 아니라 비교적 저렴한 가격으로 인하여 흡착제 및 생물막 담체 등으로 널리 사용되는 물질이다. 본 연구에서는 천연 제올라이트를 이용한 생물막 형성시 제올라이트에 흡착된 금속 양이온$(Na^+,\;Ca^{2+},\;Mg^{2+},\;Al^{3+})$이 미생물의 흡착량에 어떠한 영향을 미치는지에 대하여 검토하였다. 본 실험을 위하여 천연 제올라이트의 양이온 교환능력(cation exchange capacity; CEC)의 10%, 20%, 100%를 금속 양이온으로 치환하여 개질시킨 Metal-modified zeolite(MMZ)를 사용하였고 미생물은 Pseudomonas putida를 계대배양하여 사용하였다. 미생물 흡착실험 결과 MMZ로의 미생물의 흡착량이 천연 제올라이트로의 흡착량 보다 일반적으로 증가하는 경향을 나타내었다. 즉, 10% CEC의 경우 미생물의 흡착량은 $Mg^{2+}>natural>Na^+>Al^{3+}>Ca^{2+}$, 20% CEC의 경우 $Mg^{2+}>Ca^{2+}>Al^{3+}>natural>Na^+$, 100%의 CEC의 경우 $Ca^{2+}>Mg^{2+}>natural>Al^{3+}>Na^+$의 흡착량을 나타내었다. 특히, 마그네슘으로 개질된 Mg-modified zeolite(Mg-MZ)의 경우 가장 높은 미생물 흡착량을 보였으며 10% CEC로 개질한 경우 천연 제올라이트보다 60% 이상 증가된 흡착량을 나타내었다. 그러나 제올라이트에 흡착된 양이온의 양이 증가할수록 미생물의 흡착량은 감소되는 경향을 나타내었는데, 즉, 10% CEC Mg-MZ의 경우 미생물의 흡착 증가량이 60% 이상이었으나 20% CEC의 경우 50%, 100% CEC의 경우 10%로 흡착 증가량이 감소되었다. 또한 제올라이트에 흡착된 $Mg^{2+}$와 수용액 상에 존재하는 $Mg^{2+}$가 미생물의 흡착량에 미치는 영향을 비교한 결과 제올라이트에 흡착될 수 있는 미생물의 최대흡착량은 큰 차이가 없는 것으로 조사되었다.

• Journal of Plant Biotechnology
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• 제50권
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• pp.82-88
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• 2023

순도가 균일한 원종을 대량생산하기 위해 원원종 종자를 이용하여 조직배양 기술 중 경정배양을 이용하였다. 실험 재료로는 원원종 계통 RA2와 RA4 계통을 사용하였다. BA 호르몬 사용의 경우 RA2 계통의 유묘에서는 BA 1.33 uM 첨가 배지에서 평균 14.67개로, 성묘의 경우 BA 1.78 uM 첨가 배지에서 평균 11.33개로 가장 많은 개수의 multi-shoots이 형성되었으며, RA4 계통 경우 유묘에서는 BA 2.22 uM 첨가 배지에서 평균 11.67개로, 성묘에서는 BA 1.33 uM 첨가 배지에서 평균 13.67개로 가장 많은 multi-shoots이 형성되었지만 BA 농도별로 유의수준에서 거의 차이가 없는 것으로 나타났다. TDZ 호르몬 사용의 경우 RA2 계통은 TDZ 농도가 증가할수록 multi-shoots의 수가 증가하여 TDZ 0.45 uM 첨가 배지에서 가장 많은 multi-shoots가 형성되었으나(유묘 7.0개, 성묘 3.0개), TDZ 2.25 uM 부터는 거의 multi-shoots가 형성되지 않았다. RA4 계통은 유묘의 경우 거의 multi-shoots이 생성되지 않았고 성묘의 경우 TDZ 0.23, 0.45 uM 첨가 배지에서 3.7개의 multi-shoots이 생성되었으나 그 이상의 농도에서는 유묘에서와 같이 생성되지 않았다. 생성된 multi-shoots를 계대배양하여 생장한 조직배양묘를 SSR marker를 사용하여 원종계통과 비교분석한 결과 생성된 조직배양묘에서 변이의 양상이 약하게 보인 것이 있었으나 돌연변이체로 나타난 것은 없었다. 또한 뿌리 발근에 있어서는 RA2, RA4 계통 모두 대체적으로 IBA 4.9 uM 첨가된 배지에서 발근율, 뿌리 수, 뿌리발달 정도 등이 가장 좋았다.

• Journal of Plant Biotechnology
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• 제50권
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• pp.155-162
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• 2023

무(Raphanus sativus L.)는 전세계적으로 재배되고 있는 뿌리 채소 중 하나로, 다양한 방법으로 소비되고 있다. 무의 F1종자 생산을 위한 원종 계통의 교배 과정에서는 화분 혼입으로 인해 순도가 떨어지는 문제가 발생할 수 있다. 따라서 본 연구에서는 무의 기내 대량증식을 위해 캘러스 재분화를 통한 대량증식 조건을 확립함으로써 기내배양 식물체를 증식시키고 원종 증식에 이용될 수 있도록 하는 것을 목표로 하였다. 무의 하배축을 이용한 캘러스 유기에서 다양한 농도의 2,4-D와 TDZ, kinetin 조합 중 가장 효과적인 조합을 선정하고, 유기된 캘러스를 두 종류의 배지(5H+1B, 1 mg/L NAA + 0.1 mg/L 2,4-D + 1 mg/L IPA + 0.02 mg/L GA3 + 2 mg/L zeatin + 1 mg/L BA; 5H+0.1T, 1 mg/L NAA + 0.1 mg/L 2,4-D + 1 mg/L IPA + 0.02 mg/L GA3 + 2 mg/L zeatin + 0.1 mg/L TDZ)에 치상함으로써shoot 재분화에 적합한 호르몬 조건을 탐색하였다. 무의 캘러스 배양 결과, RA2 계통과 RA10 계통은 1 mg/L 2,4-D + 0.05 mg/L kin 조합에서, RA4 계통은 1 mg/L 2,4-D + 0.1 mg/L kin + 0.025 mg/L TDZ 조합에서, RA30 계통은 1 mg/L 2,4-D + 0.2 mg/L kin 조합에서 캘러스의 형성이 효과적이었다. RA4 계통에서 유기된 캘러스의 shoot 재분화는 두 종류의 shoot 재분화 배지에서 모두 일어났지만, 그 빈도는 5H+1B 배지에서 훨씬 더 높았으며 재분화된 shoot를 발근배지에 계대배양하여 뿌리를 유도하고 기내 순화 과정을 거쳐 재분화된 소식물체를 얻을 수 있었다. 이 연구에서 확립한 조건들을 무의 기내 대량번식에 활용한다면, F1 종자 생산을 위한 원종 증식에 도움이 될 것으로 판단된다.