Yang, Peilong;Shi, Pengjun;Wang, Yaru;Bai, Yingguo;Meng, Kun;Luo, Huiying;Yuan, Tiezheng;Yao, Bin
Journal of Microbiology and Biotechnology
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제17권1호
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pp.58-66
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2007
Isolation, expression, and characterization of a novel $endo-{\beta}-1,3(4)-D-glucanase$ with high specific activity and homology to Bacillus lichenases is described. One clone was screened from a genomic library of Paenibacillus sp. F-40, using lichenan-containing plates. The nucleotide sequence of the clone contains an ORF consisting of 717 nucleotides, encoding a ${\beta}-glucanase$ protein of 238 amino acids and 26 residues of a putative signal peptide at its N-terminus. The amino acid sequence showed the highest similarity of 87% to other ${\beta}-1,3-1,4-glucanases$ of Bacillus. The gene fragment Bg1 containing the mature glucanase protein was expressed in Pichia pastoris at high expression level in a 3-1 high-cell-density fermenter. The purified recombinant enzyme Bg1 showed activity against barley ${\beta}-glucan$, lichenan, and laminarin. The gene encodes an $endo-{\beta}-1,3(4)-D-glucanase$ (E. C. 3.2.1.6). When lichenan was used as substrate, the optimal pH was 6.5, and the optimal temperature was $60^{\circ}C$. The $K_m,\;V_{max},\;and\;k_{cat}$ values for lichenan are 2.96mg/ml, $6,951{\mu}mol/min{\cdot}mg,\;and\;3,131s^{-1}$, respectively. For barley ${\beta}-glucan$ the values are 3.73mg/ml, $8,939{\mu}mol/min{\cdot}mg,\;and\;4,026s^{-1}$, respectively. The recombinant Bg1 had resistance to pepsin and trypsin. Other features of recombinant Bg1 including temperature and pH stability, and sensitivity to some metal ions and chemical reagents were also characterized.
엿기름의 적정 제조조건을 설정하기 위하여 발아조건를 달리하여 제조한 엿기름의 ${\beta}-glucanase$, ${\alpha}-amylase$ 및 ${\beta}-amylase$의 활성을 조사하였다. 보리는 발아가 진행됨에 따라 ${\beta}-glucanase$의 활성이 증가하였으며, 이로 인해 세포벽의 주요 구성다당류인 ${\beta}-glucan$이 분해되어 감소하였다. ${\beta}-Glucanase$ 활성은 $15^{\circ}C$의 발아온도에 비해 $18^{\circ}C$와 $21^{\circ}C$에서 발아초기에 급격히 증가하였으며 발아 6일경에는 최고값에 달하였다. 6조보리인 올보리의 ${\beta}-glucanase$ 활성이 2조보리인 진양보리에 비해 높게 나타났다. 올보리의 ${\alpha}-amylase$ 활성 역시 진양보리에 비해 현저히 높았으며 6일간의 발아일수에서 증가하는 경향이 있었다. 발아보리의 ${\alpha}-amylase$ 활성은 발아온도 $15^{\circ}C$에서 가장 낮았고 $18^{\circ}C$에서 가장 높았으며 $21^{\circ}C$에서는 약간 감소하였다. ${\beta}-Amylase$는 원맥에서 상당한 활성이 있었으며 발아과정중에 지속적으로 증가하는 경향을 보였다. $15^{\circ}C$에 비해 $18^{\circ}C$와 $21^{\circ}C$에서 발아일수에 따른 ${\beta}-amylase$ 활성의 증가폭이 컸으며 발아 5일 이후부터는 효소활성도에 있어서 크게 변화를 보이지 않았다. 엿기름의 당화력(diastatic power)은 올보리가 진양보리에 비해 $1.4{\sim}1.9$배 정도 높았으며 $18^{\circ}C$에서 $5{\sim}6$일의 발아가 당화력이 가장 우수한 것으로 나타나 발아조건으로서 적합한 것으로 제시되었다.
대표적인 식물병원성 곰팡이 인 Phytophthora infestans와 Fusarium oxysporum의 생장을 저해하는 근권세균들을 토양에서 분리하여 동정하였으며 이 균주들이 분비하는 항진균성 물질인 siderophore, $\beta-1$,3-glucanase, hydrogen cyanide와 chitinase의 생성능을 조사하였다. 분리균주 중 Bacilus sp. RFO41은 F. oxysporum의 생장을 가장 효율적으로 억제하였으며, siderophore 생성능과 $\beta-1$,3-glucanase의 활성이 가장 우수하였다. 또 다른 분리균주인 Bacilus sp. PS2는 P. infestans의 생장을 가장 많이 억제하였으며, chitinase 활성과 hydrogen cyanide 생성능이 가장 우수하였다. F. oxysporum과 P. infestans에 대한 항진균 효과는 근권세균이 생산하는 siderophore, $\beta-1$,3-glucanase, hydrogen cyanide와 chitinase의 활성에 따라 차이가 있음을 알 수 있었다.
A bacterium K-4-3, producing $\beta$-glucan hydrolyzing enzyme, was isolated from soil and identified to be Bacillus subtilis by its morpholohical and physiological characteristics. $\beta$-glucan was coloured using cibacron blue 3G-A and cross linded by the addition of 1, 4-butanedioldiglycidyl ether. This substrate was used for the isolation of $\beta$-glucanase producing microorganism. The $\beta$-glucan hydrolyzing enzyme actibity from isolated K-4-3 strain was also measured using the modified substrate. Bacillus subtilis K-4-3 produced the highest extracellular $\beta$-glucan hydrolyzing activity in the basal medium containing $\beta$-glucan as a carbon source, peptone and tryptone as a nitrogen source, and magnesium sulfate as an inorganic salt. The optimum temperature and initial pH for $\beta$-glucanase production by Bacillus subtilis K-4-3 were $37^{\circ}C$ and pH6. The highest enzyme activity was obtained at the culture age of 54 hrs with rotary shaking at $37^{\circ}C$. The crude enzyme showed the highest activity at pH 7.5-8.0 and $65^{\circ}C$.
Three types of xylanases (EC 3.2.1.8) were detected in the strain Aspergillus niger A-25, one of which, designated as XynIII, also displayed ${\beta}-(l,3-1,4)-glucanase$ (EC 3.2.1.73) activity, as determined by a zymogram analysis. XynIII was purified by ultrafiltration and ion-exchange chromatography methods. Its apparent molecular weight was about 27.9 kDa, as estimated by SDS-PAGE. The purified XynIII could hydrolyze birchwood xylan, oat spelt xylan, lichenin, and barley ${\beta}-glucan$, but not CMC, avicel cellulose, or soluble starch under the assay conditions in this study. The xylanase and ${\beta}-(l,3-1,4)-glucanase$ activities of XynIII both had a similar optimal pH and pH stability, as well as a similar optimal temperature and temperature stability. Moreover, the effects of metal ions on the two enzymatic activities were also similar. The overall hydrolytic rates of XynIII in different mixtures of xylan and lichenin coincided with those calculated using the Michaelis-Menten model when assuming the two substrates were competing for the same active site in the enzyme. Accordingly, the results indicated that XynIII is a novel bifunctional enzyme and its xylanase and ${\beta}-(l,3-1,4)-glucanase$ activities are catalyzed by the same active center.
Effects of the addition of \beta-glucanase to barley-based layer diets were examined by feeding 200 Leghorn layers with corn-based (Control) and \beta-glucanase supplemented diets (Barley+ Enzyme). The results obtained are sumrrarized as follows. 1. There were no siginificant (P>0.05) differences in hen-day egg production(%) and average egg weight between two treatments, indicating that the \beta-glucanase supplemented barley could successfully replace the commonly used corn in the layer diets. 2. Although there was no statistical difference (P>0.05) between two treatments, the daily feed consumption was numerically high in layers fed the barly diet compared to the corn-based diet. 3. Availabilities of crude fat and crude fiber of the barley diet were significantly poor (P<0.05) as compared to corn diet. 4. The \beta-glucarase supplementation depressed the viscosity of barley diets and excreta from therm. 5. Both serum and egg yolk cholesterol were not significantly affected by the addition of \beta-glucarase in the barley based diet. Our data indicate that the barley grain supplemented with \beta-glucarase can be sucessfully used as an energy source of layer diet when there is a price advantage. Although some possibilities to produce low cholesterol egg were recognized in this study, further studies pertaining to long-term feeding experiment and elucidaton of the metabolic interrelationship between serum and yolk cholesterol, are required to confirm the result.
The degree of autolysis and presence of cell-wall degrading enzymes in an anaerobic ruminal fungus, Piromyces communis OTSI, grown in liquid medium, was monitored to evaluate the effect of self-digestion on fungal biomass. After a 30 days incubation period fungal dry weight decreased by 45% and the cell wall component chitin decreased by 22%. Chitinase activity detected in the supernatant was mainly of the endotype and peaked at day 6 of the incubation. ${\beta}-1$, 3-glucanase was detected from day 4 and increased throughout the incubation period. Autolysis was a slow process, and under natural conditions it is unlikely that it plays a significant role in the degradation of the spent fungal vegetative stage in the rumen.
한국형 잔디에서는 다른 병에 비해 진전 속도가 빠르고 주로 뿌리에서부터 발병하여 잔디를 고사시키고 발병 후 구제하기 매우 어려운 라이족토니아잎마름병(라지패취)이 큰 문제로 대두되고 있다. 라이족토니아잎마름병(라지패취)은 Rhizoctonia solani AG2-2 (IV)병원균에 의해 발생하는데, 이 병원균에 강한 내병성 들잔디를 개발하기 위해 식물방어반응에 중요한 역할을 하는 것으로 알려진 PR-Protein 중 하나인 ${\beta}-1,3-glucanase$를 들잔디로부터 클로닝 하였다. ${\beta}-1,3-glucanase$는 바이러스나 균의 감염으로 인해 식물조직이 과민반응을 일으킬 때 세포내에서 생성되고 세포 외로 분비되어 세포 사이 공간에서 주로 병원균 저항성기능을 하는 것으로 알려져 있다. ${\beta}-1,3-glucanase$ 단자엽식물 중 내병성에 대한 연구가 되어있는 옥수수, 밀, 보리, 벼의 염기서열에서 공통으로 보존되어 있는 부분을 이용해 degenerate PCR을 수행하고 얻어낸 sequence를 통해 Full-length의 cDNA를 클로닝 하였다. E.coli overexpression을 수행하여 목표 단백질을 대량 정제하여 in vitro 활성 측정 및 항균테스트를 진행하였다. 또한, ZjGlu1 유전자의 기능을 해석하기 위해 각각의 유전자를 도입한 식물형질전환용 벡터를 제작하여 잔디 형질전환체 제작을 하였다. ZjGlu1 단백질을 이용하여 9개의 균주에 대해 항균활성 테스트를 진행 한 결과 R. cerealis, F. culmorum, R.solani AG-1 (1B), T. atroviride 에서 항균활성을 보였으며, 형질전환체를 이용해 18s 유전자의 발현량을 상대로 한 각 유전자의 기관별 발현량은 크게 차이없이 모든기관에 발현되는 것을 확인할 수 있었다.
지렁이 (Eisenia andrei)의 중장에서 내생의 endoglucanase 유전자의 전체 염기 서열을 동정하였다. ORF의 길이는 1,371 bp이며, 456개의 아미노산으로 번역된다. NCBI에 등록된 가재와 흰개미의 cellulase 및 endo-$\beta$-1, 4-glucanase와 50-51%의 유사성을 보이며, 활성 부위가 잘 보존되어 있었다. 계통수 분석에서는 다른 동물 분류군에서 밝혀진 GHF9 그룹의 cellulase와 근연관계가 없음이 확인되었다.
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[게시일 2004년 10월 1일]
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