Development of Genetic Selection Marker via Examination of Genome in Bacillus velezensis K10

Bacillus velezensis K10 유전체 분석을 통한 균주 선발 마커 개발

Abstract

This study was done to develope genetic markers with the unique characteristics of genes according to the genomic information of Bacillus velezensis K10. B. velezensis K10 maintained a total of 4,159,835 bps, which was found to encode 5,136 open reading frames (orfs). B. velezensis K10 was found to have much more gene migration due to external factors overall compared to standard strain B. velezensis JS25R. In order to discover genetic selection markers, orfs on the genome to be easily induced to gene mutation were surveyed such as recombinase, integrase, transposase, and phage-related genes. As a result of the investigation, 9 candidate markers were isolated with high possibility as genetic selection markers. Although a part in the various origin's areas showed specificities in comparison with homology, the selected markers were all existed in phage-related areas because they were relatively lower homologies in phage-related genes. PCR analysis was done on B. licheniformis K12, B. velezensis K10, B. subtilis, and B. cereus to establish them as inter-species candidate selection markers. As a result, it was confirmed that B. velezensis K10-specific PCR products were formed in a total of 6 primer sets such as BV3 and BV5 to 9. On the other hand, analysis at the subspecies level observed the formation of B. velezensis K10-specific PCR products in 4 primer sets such as BV3, 5, 8, and 9. Among them, since BV5 and BV8 were detected by very specific results, we suggest that BV5 and 8 can be used as B. velezensis K10 gene selection markers at the species and sub-species level.

본 연구는 Bacillus velezensis K10의 유전체 분석결과에 따른 유전자의 고유한 특성을 이용하여 유전자마커를 탐색하고 확립하여 산업현장에서 활용하기 위해서 수행하였다. B. velezensis K10은 총 4,159,835 bps를 유지하였으며, 5,136개의 단백질을 발현하는 것으로 조사되었다. B. velezensis K10은 표준균주에 비교하여 전반적으로 외부요인에 기인되는 유전자의 이동이 훨씬 많은 것으로 나타났다. 이와 같은 양상에 기인하여 B. velezensis K10은 특유의 유전적 서열을 유지할 수 있는 것으로 추정되었다. 선발마커 발굴을 위해 recombinase, integrase, transposase, phage-related genes, 등 유전자 변이 유발이 쉬운 게놈상의 영역에 대해 탐색을 실시하였다. 그 결과, 선발마커로써 가능성이 높은 9개 부위를 확보하였다. 후보마커는 일부 다른 영역에서 특이성을 보이는 영역들이 존재했지만, phage 연관 유전자들에서 매우 특이성이 높았기 때문에, 모두 phage 관련 부위에서 모두 탐색되었다. 종간 후보 선발마커로써 B. licheniformis K12, B. velezensis K10, B. subtilis, B. cereus 등에 대해 PCR 분석을 실시하였다. 그 결과 BV3, BV5~9까지 총 6 프라이머 세트에서 B. velezensis K10 특이적인 PCR 산물이 형성되는 것을 확인하였다. 다른 한편으로, subspecies 수준에서 분석 결과, BV3, 5, 8, 9 등 4 프라이머 세트에서 B. velezensis K10 특이적인 PCR 산물이 형성되는 것을 관찰했다. 분석된 마커 중에서 BV5와 8가 가장 특이성이 높았기 때문에 종(species) 및 아종(sub-species) 수준에서 B. velezensis K10 유전자 선발마커로써 BV5와 8을 활용 가능할 것으로 제의된다.

서론

살아있는 생명체의 장내에는 다양한 미생물이 생존하고 있으며, 생체내의 특이성 및 외부 환경의 변화에 영향을 받아 군집이 천이 되어진다[16]. 때때로 오염된 외부 섭취물에 의해 심각한 장내 질병이 유발되는 경우도 있다[17]. 이와 같은 질병을 사전에 예방하기 위해서는 장내에 외부 질병균에 대해 저항할 수 있는 유익균의 존재가 반드시 필요하다[10]. 그러나 유익균 만이 높게 존재하고, 기타 공생 되는 균주가 결여되면 장내 밸런스의 약화에 기인하여 장내 기능성이 악화될 수 있는 가능성이 있기 때문에 다양한 미생물의 존재가 필요하다[20].

바실러스 균주는 다양한 세포 외 효소 생산 및 점질다당류 등을 생산하기 때문에 된장, 간장, 청국장 등 전통적인 식품 제조에 있어서 활용되어 오고 있으며[11, 15, 18],또한, 이런 기능성에 Bacillus 균주들은 generally recognized as safe (GRAS) 균주로 분류되어 프로바이오틱스로서도 활용되고 있다[9, 12]. Bacillus polyfermenticus는 16S rDNA 서열 분석결과 B. velezensis와 가장 근연적인 것으로 나타나고 있으며, 최근 B. polyfermenticus로 분류되었던 균주가 B. velezensis로 분류되는 경우도 있다(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/). B. velezensis는 바이오계면활성제인 7 아미노산으로 구성된 surfactin이 quorum sensing 기작의 조절을 위한 산물로서 생성이 되며, 추가적으로 10개 내외 아미노산으로 구성된 바이오계면활성제가 생성되는 예가 있다[5]. 이들은 non-ribosomal peptide synthetase (NRPS)에 의해 수행되며, D-amino acid가 포함되는 특이성이 있다. 이외에도 Antimicrobial peptides (AMPs), 항균 단백질 및 항생물질 등이 생산되는 것이 알려져 있다[5, 19].

진핵생물에서 초위성체(microsatellite or simple sequence repeats)가 유전자 마커로써 활용되어 집단 유전, 개체 분류 및 친자확인 등의 수단으로 사용되고 있다[6, 7]. 미생물 체에 tandem repeat들이 존재는 하지만, 대부분 전사 조절 영역에 위치하여 유전자의 발현과 연관성 또는 고유의 특성을 보유하고 있기 때문에 개체 확인의 수단으로 사용하는 것은 불가능하다[4]. 따라서 원핵생물에 있어서는 다른 방식에 의해 유전자마커로써 활용할 수 있는 수단이 필요하다. 가장 가능성이 높은 수단 중의 하나가 수평적 전달에 의해 전달되어 염색체에 삽입되는 외부 유전자들이 가능성이 높은 것으로 판단된다. 다양한 박테리오 파아지, transposon, integrase, recombinase, insertion element (IS) 등에 의해 미생물이 환경에 서식하는 동안에 유전자의 전달을 받아 염색체 내에 고유의 흔적을 남기는 것이 가능하기 때문에 유전자마커로써 활용 가능성이 있다. 따라서 이와 같은 특성은 종(species) 안에 특정 개체에서 유래된 라인을 추적하는 수단으로 사용하는 것이 가능할 것으로 판단된다[1].

본 연구에서는 B. velezensis K10의 유전체를 분석하고, 미생물에 유입된 외부 유전자의 특성을 이용하여 유전자 마커를 개발하는 것이다. 본 연구를 위해 유전체를 분석하고, 외부 유입된 유전자의 흔적을 분석하여 후보유전자를 선정하고, 종(species) 및 아종(subspecies) 수준에서 후보 마커의 특성을 분석하여 유전자 마커를 개발하였다.

재료 및 방법

B. velezensis K10은 굼벵이 장내에서 분리된 생리활성 물질 생산 균주이다. B. licheniformis K12는 바위 게 내장에서 분리한 균주이며, Bacillus subtilis KCTC2217와 Bacillus cereus ATCC11778는 생물자원센터(Korean Collection for Type Cultures)와 ATCC (American Type Culture Collection)로부터 각각 분양 받았다. B. velezensis K10 표준균주인 KACC10334는 씨앗은행으로부터 분양 받아 본 연구에 사용하였다. 분양된 균주들은 LB 혹은 NB 액체 또는 한천배지에서 37℃에서 16~24시간 배양하여 본 연구에 사용하였다.

유전체 분석

Bacterial Genomic DNA Extraction Kit Ver.3.0 (TaKaRa Korea, Seoul, Republic of Korea)을 사용하여 Bacillus velezensis K10에서 게놈 DNA를 분리하였고, 이 DNA를 DNASeq (DNA sequencing)에 사용하였다.

분리된 DNA는 Covaris S2 ultra sonicator system을 이용하여 fragmentation 단계를 거친 후, Truseq Nano DNA sample prep kit (Illumina, Inc., San Diego, CA)을 이용하여 350 bp의 DNA 단편으로 구성된 라이브러리를 구축하였다. 이러한 최종 산물은 2100 BioAnalyzer를 이용하여 확인하였고, Illumina HiSeq platform (Illumina, Inc., San Diego, CA)을 이용하여 서열 해독을 진행하였다.

확보된 sequence reads은 sickle (v1.33)와 BWA ver. 0.7.12을 사용하여 고품질의 reads만 필터하여 얻었고, 이것은 B. velezensis에 대해 mapping 및 genome assembly을 하는데 사용되었다. mapping 이후, local realignment는 GATK ver. 3.1-1을 사용하여 수행하였고, duplicates는 Picard ver. 1.98(http://picard.sourceforge.net)을 사용하였다. 서열 상의 변이들은 GATK ver 3.1-1을 통해 calling을 수행했고, 변이에 대한 annotation은 SnpEff (v.4.1)에 의해서 수행되었다.

선발 부위 탐색 및 상동성 비교

분석된 B. velezensis K10 유전체 서열을 바탕으로 변이가 자주 유발될 수 있는 recombinase, integrase, transposase, phage related gene 등의 부위 유전자들을 탐색하였다. 탐색된 유전자들은 NCBI (National Center for Biotechnology Information; https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)를 이용하여 상동성 조사를 수행하였고, 선발 마커로써 가능성이 높은 후보 유전자들을 선발하였다.

유전자 조작 방법

본 연구에서 수행된 유전자 조작은 일반적인 방법에 의해 수행되었다[14]. 유전체 정보 및 후보 선발 마커 분석을 통해 확보된 유전자들은 PCR 증폭을 위해 프라이머가디자인 되었고 합성되었다(Table 2; 바이오니아, 한국). PCR을 위한 게놈의 확보는 colony PCR를 수행하였다. 필요할 경우에는 genomic prep kit (SolgTM Genomic DNA prep kit; SolGent co., Ltd.)를 이용하여 게놈을 분리하여 PCR을 위한 주형으로 사용하였다. 합성된 프라이머 세트와 PCR PreMix (AccuPower PCRMix, Bioneer)를 통해 증폭된 각 후보 DNA 단편은 agarose gel에 loading에 의해 단편 길이를 확인하였고, 필요할 경우 유전자 서열 분석을 통해 확인하였다.

결과 및 고찰

유전체 분석 결과

본 연구에 사용된 Bacillus spp. 균주는 16S rDNA 분석결과 B. velezensis K10으로 명명되었다(data not shown). 유전체 분석결과 B. velezensis K10은 4, 159,835 bps로 구성되었다(Table 1). 본 결과는 유전자은행(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)에 등록되어 있는 참조 유전체인 B. velezensis JS25R GCF_000769555.1에 비교하여 145,395 bps가 더 많이 존재하였다. 또한, Open reading frame (ORF)도 1,352개가 더 많이 존재했다. B. velezensis K10 및 JS25R은 810과 1,061 bps당 각각 하나의 orf를 형성하는 것으로 나타났다. 따라서 B. velezensis K10은 B. velezensis JS25R보다 유전자의 활용도가 조밀하게 형성되어 있는 것으로 평가되었다.

Table 1. Genotype information examined for the genetic marker

B. velezensis JS25R; B. velezensis JS25R GCF_000769555.1 registered in https://www.ncbi.nlm.nih.gov/

외부 유전자의 도입에 의해 쉽게 돌연변이가 유발될 수 있는 근원요인들은 insertion element (IS), integrase, recombinase, transposase, bacteriophage 등의 유전자들에 의해 수행될 것이다[1]. B. velezensis K10과 B. velezensis JS25R를 비교해 본 결과, B. velezensis K10은 B. velezensis JS25R에 유전체에 비교하여 돌연변이 유발인자들이 2배 이상 많이 존재하는 것으로 나타났다. 그러나 insertion element는 양쪽 모두에서 전혀 발견되지 않았다(Table 1). 따라서 B. velezensis K10 유전체는 B. velezensis JS25R에 비교하여 보다 많은 돌연변이 부위가 존재하고, 해당 유전자들의 흔적이 염색체 위에 존재할 것으로 추정되었다.

후보 마커의 발굴

미생물에서 선발 유전자 마커는 특이 유전자를 이용하여 분류하는 것이 잘 알려져 있다. Bacillus에서는 recQ 유전자를 통해 밀접하게 연관된 Bacillus 종(species)간에 분류한다[8]. 이와 같은 유전자 마커는 종간에 구별을 수행할 수 있지만, subspecies 수준에서 분류에는 적합하지 못한 것으로 추정된다. 따라서 미생물 균총 또는 산업적 활용 균주에서 특정 미생물 균주를 확인하기 위한 방법은 유전체 특성을 이용한 분류 방법이 확립되어야 한다.

유전체 분석이 수행된 B. velezensis K10의 유전자 서열 중 돌연변이 빈도가 높을 것으로 예상되는 영역인 integrase, recombinase, transposase, phage-related regions 등에 대해 분석을 수행하였다[1]. 해당되는 영역의 유전자로써 integrase 관련 10, recombinase 관련 12, transposase 관련 5, phage 관련 54 유전자 영역들이 총 81 유전자가 확보되었다(Table 1). 이들 유전자들에 대해 해당 유전자의 up및 down-stream 1 kb에 해당되는 영역에 대해 NCBI를 통한 상동성 분석결과로부터 상동성이 비교적 낮은 것으로 나타난 9개의 유전자를 확보하였다. 단, HJCBNACN_03941은 유전자의 길이가 매우 큰 관계로 그 자체로 상동성 서열 분석을 실시하였다. 상동성 분석을 통해 일치도가 낮은 9 유전자 영역이 확보 되었고, 이들은 모두 phage에 연관된 유전자들이었다(Table 2). 위에서 선발된 9 유전자는 모두 phage 연관된 유전자로 구성되었지만, 다른 유래로부터 기원된 유전자들은 비교적 상동성이 높게 형성되었기 때문에 추가 연구에서 모두 배제되었다.

Table 2. Information of B. velezensis K10 candidate markers and oligonucleotide design

선발된 후보 마커들에서, HJCBNACN_03941, 03942, 03944, 03947 등은 Bacillus phage phi105 (Bacteriophage phi-105)로부터 유래되었다(Table 2). HJCBNACN_03941와 03942는 기능이 알려져 있지 않은 ORF36과 상동성을 보였기 때문에 ORF36이 분절되어 두 ORF로 나뉘어진 것으로 추정된다. HJCBNACN_03944와 03947은 각각 major tail 및 기능이 알려지지 않은 ORF31과 상동성을 보였다. HJCBNACN_03948, 03952, 03953 등은 Bacillus phage BtiUFT6.51-F로부터 유래된 것으로 추정되었다. HJCBNACN_03948은 phage의 head-tail connector protein과 상동성을 보인 반면에, HJCBNACN_03952 및 03953은 portal protein과 상동성이 있었다. HJCBNACN_03949는 Bacillus sp. OK048 phage major capsid protein, HK97 family와 상동성을 보인 반면에, HJCBNACN_03956은 Bacillus phage phIS3501 terminase small subunit와 상동성을 보였다.

종(species) 및 아종(subspecies) PCR 분석 결과

후보 유전자마커에 대해 PCR을 수행한 결과, Fig. 1과 같은 결과를 얻었다. BV1, 2, 4 프라이머 세트는 모두 B. velezensis K10과 B. cereus ATCC11778에서 유사한 PCR 산물이 관찰되었다. 따라서 이들 영역은 B. velezensis K10과 B. cereus ATCC11778에 양쪽 모두에 유전자 삽입이 유사하게 형성된 phage가 관련되어 유전자가 삽입되었거나 비특이적으로 증폭이 형성되는 것으로 추정된다. BV3의 경우에는 B. cereus에서 sub-PCR 산물로써 유사한 위치에 PCR 산물이 형성되는 것을 관찰할 수 있었지만, 주 PCR 산물이 500 bps 부근에 형성되어 있기 때문에 유전자 마커로써 사용에는 문제가 없는 것으로 판단되었다. BV5, 8, 9에서는 B. velezensis K10을 제외하고 나머지 균주에서는 주요 PCR 산물을 형성하지 못하는 것으로 관찰되었다. BV6와 7은 비교균주들에서 비특이적인 PCR 산물들이 많이 형성되었다. 따라서 BV3, 5~9 등의 후보 유전자 마커가 종 수준에서 선발 마커로써 활용이 가능한 것으로 추정된다.

Fig. 1. PCR results of genetic markers in species. Templates for PCR were prepared by general genomic extraction method, and PCR was done by standard method. BL; Bacillus licheniformis K12, BV; Bacillus velezensis K10, BS; Bacillus subtilis KCTC2217, BC; Bacillus cereus ATCC11778. BV1; 413 bps, BV2; 296 bps, BV3; 280 bps, BV4; 361 bps, BV5; 267 bps, BV6; 278 bps, BV7; 443 bps, BV8; 381 bps, BV9; 487 bps.

아종(subspecies)결과는 Fig. 2에 나타난 바와 같이 본 연구에 사용된 9 프라이머 세트에 대해 B. velezensis K10은 표준균주인 B. velezensis KACC10334와 일부 유사한 phage에 감염된 흔적들이 존재할 것으로 추정되었다. 특히, BV1, 2, 4, 7 등은 주 PCR 산물이 동일한 위치에 존재하였기 때문에 유사한 유전자를 보유할 것으로 추정되었다. BV3와 9는 주 PCR 산물은 아니지만, 부분적으로 형성되는 산물로써 동일한 위치에 약한 PCR 산물이 형성되어 나타났다. BV5와 BV8은 뚜렷하게 B. velezensis K10 특이적으로 PCR 산물을 형성하였다. 따라서 아종 수준에서 후보 유전자 마커는 BV3, 5, 8, 9 등이 적합하였으며, 특히, BV5와 8이 가장 적합한 것으로 나타났다.

Fig. 2. PCR results of genetic markers in subspecies. B. velezensis strains were cultured at LB broth, and then prepared for application as a PCR template. ST; Bacillus velezensis KACC10334, K10; Bacillus velezensis K10. BV1; 413 bps, BV2; 296 bps, BV3; 280 bps, BV4; 361 bps, BV5; 267 bps, BV6; 278 bps, BV7; 443 bps, BV8; 381 bps, BV9; 487 bps.

유사한 방법으로 연구를 수행한 B. licheniformis에 대한 연구에서 어류 장내 유래 미생물 균총에서 해당 균주를 선발하는 방법으로는 적합한 것으로 나타났다[2]. 그러나 집단 내에 특정 아종(subspecies) 수준에서 분류할 수 있는 유전자 마커에 대해 분석이 되지 않았기 때문에 추가 연구가 필요한 것으로 판단된다. 본 연구에서 B. velezensis K10 유전자 마커로써 적합성을 분석한 결과 종(species) 수준에서는 BV3, BV5~9로 나타난 반면에, 아종(sub-species) 수준에서는 BV3, 5, 8, 9 등으로 나타났다. 이들 중에서 가장 적합한 유전자 마커는 BV5와 8로 관찰되었다.

선발 마커의 특성 분석

HJCBNACN_03948은 267 bps (88 아미노산)으로 구성되었다. 본 영역의 1 kb up- 및 down-stream 부위에 대한 상동성 분석 결과, 5′- 및 3′-영역에 부분적인 상동성을 보였다(Fig. 3). 그러나 HJCBNACN_03948 영역은 전혀 상동성을 나타내지 않았다(Fig. 3). HJCBNACN_03948은 Bacillus phage BtiUFT6.51-F의 Head-tail connector protein과 40.2%만의 상동성을 나타내었기 때문에 본 ORF의 기능성은 향후 연구되어야 할 것으로 판단된다. HJCBNACN_03948로 부터 1 kb up- 및 down-stream 영역을 확장했을 때 총 5개의 유전자가 관여되었다(Fig. 4). 해당 영역의 유전자들은 대부분 phage 연관된 유전자들로 구성되어 있었다. 현재 알려져 있는 단백질 정보와 비교했을 때(https://www.uniprot.org/) 상동성이 38.9~62.8%로 관찰되어 해당 영역의 유전자들은 특이성이 있는 phage 유전자인 것으로 추정되었다. 유전자 마커 BV5는 상동성이 없었던 HJCBNACN_03948의 전 영역이 포함되도록 디자인 되었다.

Fig. 3. Comparison of homology on HJCBNACN_03948 and flanking regions. Fig. 3A and B indicate the results of comparison by NCBI nucleotide blasting, respectively. Query indicates HJCBNACN_03948 and flanking nucleotide sequences, the bars of pink colors in Fig. 3A mark homologous regions with the compared nucleotides as shown in Fig. 3B. Yellow letters; HJCBNACN_03948 region, Blue letters; NCBI homologous regions, red and bold letters; designed oligonucleotide regions.

Fig. 4. Gene arrangement at HJCBNACN_03948 and its neighboring regions. The designed oligonucleotides indicate in blue arrows in the upper panel. HJCBNACN_03945; Bacillus manliponensis DUF3168 domain-containing protein, HJCBNACN_03946; Bacillus phage phi105 (Bacteriophage phi-105) conserved phage protein, HK97 gp10 family, HJCBNACN_03947; Bacillus phage phi105 (Bacteriophage phi105) ORF31, HJCBNACN_03948; Bacillus phage BtiUFT6.51-F heat-tail connector protein, HJCBNACN_03949; Bacillus sp. OK048 phage major capsid protein, HK97 family.

HJCBNACN_03953은 381 bps (126 아미노산)으로 구성되며, 주변 영역 상동성 분석결과 3′-영역에 상동성이 부분적으로 존재하는 것으로 나타났다(Fig. 5). 유전자 수준에서 HJCBNACN_03953은 상동성이 전혀 없는 것으로 나타났다, HJCBNACN_03953 주변 영역으로 1 kb 확장하여 본 결과, 4개 유전자가 연관되는 것으로 나타났으며, phage와 연관된 유전자로 구축되어 있었다(Fig. 6). 단백질 수준에서 상동성 비교 결과, HJCBNACN_03953은 Bacillus phage BtiUFT6.51-F의 portal protein과 40.8% 상동성을 보였으며, HJCBNACN_03952와 유사한 역할을 수행할 것으로 예견되었다. 이웃한 유전자의 단백질 수준에서 상동성은 37.8~63.6%로 나타났기 때문에 본 영역에 있어서 phage 유전자는 특이성이 유지되는 것으로 추정되었다. BV8은 HJCBNACN_03953이 상동성이 결여되어 있기 때문에 본 orf의 전 영역이 포함되도록 디자인하였다.

Fig. 5. Comparison of homology on HJCBNACN_03953 and flanking regions. Fig. 5A and B indicate the results of comparison by NCBI nucleotide blasting, respectively. Query indicates HJCBNACN_03953 and flanking nucleotide sequences, the bars of pink color in Fig. 5A mark homologous regions with the compared nucleotides as shown in Fig. 5B. Yellow letters; HJCBNACN_03953 region (from yellow letters of 5’-terminus to 3’-primer), Blue and green letters; NCBI homologous region, red and bold letters; designed oligonucleotide regions.

Fig. 6. Gene arrangement at HJCBNACN_03953 and its neighboring regions. The designed oligonucleotides indicate in blue arrows in the upper panel. HJCBNACN_03951; Bacillus phage phIS3501 ATPdependent Clp protease, HJCBNACN_03952; Bacillus phage BtiUFT6.51-F portal protein, HJCBNACN_03953; Bacillus phage BtiUFT6.51-F portal protein, HJCBNACN_03954; Bacillus licheniformis (strain ATCC 14580) terminase large subunit.

Phage나 plasmid는 미생물 변이체를 형성할 수 있고, 이와 결과는 병원성 미생물이 살모넬라의 경우에 변이체를 확인하기 위한 수단으로 종종 사용되고 있다[3, 13]. 미생물 탐색을 위한 유전자 마커는 현재까지 종 수준에서 미생물을 분류하기 위한 수단으로 사용되고 있지만[1, 8], 보다 정확한 연구를 통해 진핵생물의 microsatellite 부위와 유사하게 미생물 계통 라인을 분석할 수 있는 수단으로 제공될 수 있도록 연구가 진행되기를 제의한다.

이상의 결과로 볼 때, 선발된 BV5와 8은 특이적인 phage 서열이 B. velezensis K10 내부에 삽입되어 B. velezensis K10 고유의 특성을 부여하는 것으로 추정된다. 따라서 선발된 B. velezensis K10 유전자 마커는 종(species) 및 아종(sub-species) 수준에서 균주를 선발하는 용도로 적합한 것으로 판단된다.

The Conflict of Interest Statement

The authors declare that they have no conflicts of interest with the contents of this article.