The Journal of Pediatrics of Korean Medicine (대한한방소아과학회지)

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Anti-inflammatory Effect of Baekho-tang Extract through Endocannabinoid system (ECS) Control in Atopic Dermatitis

아토피피부염에서 Endocannabinoid system (ECS) 조절을 통한 백호탕 추출물의 염증 완화 효과

  • Ahn Sang Hyun (Dept. of anatomy, College of Korean Medicine, Semyung University) ;
  • Kim Ki Bong (School of Korean Medicine, Pusan National University ) ;
  • Jeong Aram (Dept. of Pediatrics, College of Korean Medicine, Gachon University)
  • 안상현 (세명대학교 한의과대학 해부학교실) ;
  • 김기봉 (부산대학교 한의학전문대학원 한방소아과학교실) ;
  • 정아람 (가천대학교 한의과대학 소아과학교실)
  • Received : 2023.10.31
  • Accepted : 2023.11.24
  • Published : 2023.11.30
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Abstract

Objectives The aim of this study was to identify the effect of Baekho-tang extract on epidermal barrier recovery and inflammation relief in atopic dermatitis-induced mice through Endocanabinoid system (ECS) regulation. Methods In this study, we used 4-week-old NC/Nga mice were divided into 4 group: lipid barrier elimination group (LBEG), palmitoylethanolamide treated group after lipid barrier elimination (PEAT), Baekho-tang extract treatment group after lipid barrier elimination (BHTT) and control group (Ctrl). Each group was assigned 10 animals. We identified that cannabinoid receptor (CB) 1, CB2, CD (Cluster of Differentiation) 68, inducible nitric oxide synthase (iNOS), substance P and Matrix metallopeptidase 9 (MMP-9) through our immunohistochemistry. Results We discovered that when compared to PEAT, 8-hydroxydeoxyguanosine, a marker of oxidative stress in the epidermal barrier, and CB1 and CB2, markers of ECS modulation, were less activated in BHTT. These results led to an anti-inflammatory response in BHTT, with a significant decrease in several inflammatory mediators such as CD 68, iNOS, substance P and MMP-9 compared to PEAT and LBEG. Conclusions These results suggest that the Baekho-tang extract can reduce the inflammation of atopic dermatitis by restoring the structural damage of the skin lipid barrier through ECS modulation.

Keywords

Ⅰ. Introduction

아토피피부염 (Atopic dermatitis, AD)은 영아기에 가장 흔한 만성 염증성 피부질환 중 하나로, 나라별로 2.7-20.1%의 유병률이 보고되고 있다1). AD는 소양감과 특징적 발진의 분포와 같은 임상적 징후를 보이며, 그 원인이 명확히 밝혀진 바는 없으나 알레르겐에 대한 Immunoglobulin E의 과발현과 관련이 깊으며, 오염 물질에 대한 노출 증가, 식습관 변화, 유전적 요인 등의 복합적 요인이 질병의 발병과 진행과정에 영향을 미치는 것으로 알려져 있다2). AD는 피부 지방장벽의 손상과 비만세포의 전염증성 및 혈관활성 매개물 방출에 의해 야기되는 T helper (Th) 1 / Th2 면역 시스템 불균형이 주된 조직병리학적 소견으로 알려져 있다. 따라서, 이로 인해 야기된 면역반응을 억제시키고, 염증성 인자들의 반응을 저하시키는 치료가 주로 활용되고 있다3).

AD의 병리 및 치료에 대한 또 다른 접근은 Endocannabinoid system (ECS)적 접근으로 최근 종양, 통증, 염증 및 신경계 질환 등 다양한 질환의 병인에 ECS가 영향을 주는 것으로 알려져 있어 관련 연구들이 활발히 진행되어 오고 있다4,5). ECS는 개별적인 시스템이 아닌 생리 및 질병 과정과 연관되어 다른 신호경로들과 복잡하게 영향을 주고받는 생체조절 시스템으로 여러 장기, 조직, 체액 및 세포에서 발견되며 고도로 민감하게 발현된다6). ECS는 cannabinoid, cannabinoid receptor (CB)1, CB2 및 G protein-coupled receptor 55를 운반, 합성 및 분해하는 대사 효소로 구성되어 있으며, 이 중 CB1과 CB2는 모두 면역체계의 주요 조절자로 작용하여 잠재적으로 면역억제를 유도한다7). 특히 CB2는 세포 사멸 유도, 세포 증식 억제, 전염증성 cytokine 생성 억제, 항염증 cytokine 증가 및 T세포 유도의 4단계를 통해 면역을 조절함으로써, 염증성 질환의 발병 및 진행과정과 밀접한 연관이 있는 것으로 알려져 있다8.9). 따라서, ECS 조절은 다양한 항염증 치료에 대한 연구의 주된 관심사 중 하나로 여겨지고 있으며, AD의 새로운 치료적 접근법으로 제시 해 볼 수 있다.

본 연구에서는 백호탕이 ECS 조절 시스템을 이용한 염증 감소 효과가 있을 것이라는 가설을 세우고 이를 확인하고자 수행되었다. NC/Nga 생쥐모델은 통상적 환경에서 화학물질 및 집먼지진드기 등의 외부항원이 접촉되었을 때 IgE 증가, 병변 부위 호산구, 호염구, 비만세포, Th1 및 Th2 세포 증가와 같은 인간의 AD와 유사한 면역학적 상태를 보이며10), 가려움, 홍반, 출혈, 부종, 건조 등과 같이 인간의 AD와 유사한 임상적 특징이 잘 발현되므로 각종 알레르기성 피부질환의 동물 실험 모델로 다용된다11). 인체 적용을 위한 예비 연구로서 최대한 유의미한 동물실험 결과를 도출하기 위해 인체의 면역학적 상태를 잘 구현하는 NC/Nga 생쥐모델을 본 실험에서도 사용하였다.

본 연구에서 사용된 백호탕 (白虎湯, Baekho-tang)은 “석고 (石膏, Gypsum fibrosum)”, “지모 (知母, Anemarrhena asphodeloides Bunge)”, “갱미 (粳米, Oryza sativa L.)”, “감초 (甘草, Glycyrhiza uralensis Fisch)”로 구성되어 있는 처방으로 한의학에서 청열생진 (淸熱生津) 효과를 가진 것으로 알려져 있다12). 청열 (淸熱)하는 효능은 염증성 병변을 완화시키고, 생진 (生津) 효능은 피부건조를 완화시킬 수 있어 피부장벽 회복 및 항염증 효과를 기대해볼 수 있으므로 임상에서 AD 치료에도 다용되고 있다. 저자들은 이전 연구에서 피부의 지방장벽을 손상시켜 AD을 유발한 NC/Nga 생쥐모델을 대상으로 백호탕 추출물을 투여 한 후 지방장벽의 회복 및 Th2 분화 조절을 통한 염증반응 완화 효과를 확인한 바 있다13). 백호탕은 임상에서 염증성 피부질환에 다용되는 한약임에도 불구하고, 현재까지 항염증 효과에 대한 3편의 연구14-16), 피부장벽 회복효과에 대한 1편의 연구만이17) 보고되어 있으며, ECS 조절 여부에 대한 연구는 전무하다. 다만, 선행연구들을 통하여 백호탕의 피부 장벽 회복 및 염증 완화 효과가 입증된 바 저자들은 백호탕이 ECS와 연관된 여러 인자들을 조절함으로서 염증을 억제하는 효과도 있을 것이라 판단하여 본 연구를 진행하게 되었으며 유의미한 효과를 확인하였기에 해당 결과를 보고하는 바이다.

Ⅱ. Materials and Methods

1. 실험동물

자바이오 (대한민국)에서 분양받은 태령 4주 수컷 NC/Nga계 생쥐를 무균사육장치내에서 2주일 동안 적응시킨 후 체중 16 ± 1 g로 선별하여 실험에 사용하였다. 대조군 (Control, Ctrl), 지방장벽제거군 (lipid barrier elimination group, LBEG), 지방장벽제거 후 palmitoylethanolamide (PEA) 투여군 (PEA treatment after lipid barrier elimination, PEAT), 그리고 지방장벽제거 후 백호탕 투여군 (Baekho-tang extract treatment group after lipid barrier elimination, BHTT)으로 나누었고, 각각 10마리씩 배정하였다. Skin sccore 판별 후 6 이하 및 10 이상의 동물을 제외하고 군에 배정하였다. 농림축산검역본부· 식품의약품안전처 공동 동물실험 및/또는 실험동물 관련 위원회 (IACUC) 표준운영 가이드라인에 의하면, 통계프로그램을 사용하여 동물 마리수의 적정성을 평가하기 어려울 때는 유사한 실험의 예를 이용할 수 있다는 내용을 근거로 하여 Jung의 연구18)의 sample size를 참고하여 본 연구의 sample size 및 통계적으로 유의한 마리수를 총 40마리로 산정하여 실험을 수행하였다. 동물의 고통 및 스트레스 경감을 위해 케이지 내에 wood block 및 house를 제공하고 ether 흡입 마취를 아토피피부염 유발 직전, 총 실험기간 동안 1회 시행하였다.

동물을 실험군에 배정하고, 결과를 평가할 때 발생할 수 있는 주관적 편향을 최소화하기 위해 2주 적응기간을 거친 이후의 행동을 모니터링하여 공격성 증가 및 위축 행동 등이 확인되는 경우 군 선정에서 제외하였다. 모든 군의 생쥐들은 23 - 25 °C, 55 ± 10%의 습도, 12 h 명암 주기에서 사육되었고, SAFE-40 + RMM (SAFE, France) 및 filtered tap water의 식이를 자유롭게 제한없이 제공하여 실험 전반에 걸쳐 동물의 스트레스 경감을 위한 환경을 제공하였다. 실험 동물의 긁기 행동, 공격성 증가 및 위축 행동 등을 모니터링하여 이상 반응을 체크하였으며, erythema/hemmorrhage, scarring/dryness of skin, edema, excoriation/erosion의 4가지 항목을 각각 none of symptoms = 0, mild = 1, moderate = 2, severe = 3 으로 분류하여 각 항목에 대한 점수의 총합이 15 이상으로 심화되거나, 20% 이상의 체중감소를 보이는 경우는 CO2를 이용하여 안락사하기로 계획하였다. 동물실험은 가천대 동물실험윤리위원회의 승인 (IACUC No. GU1-2021-IA0035-M2) 후 실시되었고, 실험실 동물의 관리와 사용은 National Institutes of Health 가이드라인에 따라 시행되었다.

2. 백호탕의 제조

본 실험에서 사용한 백호탕은 국내 한약공급업체인 바른한약 (Barunhanyak, Seoul, Korea)에서 구입하여 사용하였다. 백호탕 2첩 즉, 석고 (Gypsum fibrosum) 40 g, 지모 (Anemarrhena asphodeloides Bunge) 16 g, 감초 (Glycyrrhiza uralensis Fisch) 6 g, 갱미 (Oryza sativa L.) 6 g으로 구성된 백호탕 총 62 g을 증류수 1000 ㎖에 넣고 3시간 동안 전탕한 후 여과하였다. 그 여액을 회전증발 농축기를 이용하여 50 ㎖으로 감압· 농축한 후 동결 건조하여 추출물 4.03 g (수득률 6.5%)을 획득했다.

3. 지방장벽제거와 치료약물 투여

먼저, 생쥐 등쪽 부위 피부에 제모크림 (Body natur, Spain)과 면도기를 이용하여 제모한 다음 각질층 탈락막 (desqumation)을 Tape (3M, USA)를 이용하여 제거하였다. 10% sodium dodecyl sulfate (SDS: Sigma, USA) 500 ㎕를 도포한 후 면봉을 이용하여 20회 문질러서 각질층의 lipid lamella를 제거하였다. 그런 다음 백호탕 추출물을 생리식염수에 희석하여 3일 동안 68 ㎎/㎏으로 0.2 ㎖씩 BHTT에 경구투여하였다. 한편 대조약물로 사용된 PEA (Sigma, USA)는 생리식염수 (100 ㎕)에 녹인 뒤 AD 유발 후 3일 동안 10 ㎎/㎏ 경구투여하였다.

4. 조직표본제작과 조직화학

AD가 유발된 생쥐에 vascular rinse와 10% 중성 포르말린용액 (neutral buffered formalin, NBF)으로 심장관류고정을 실시하였다. 처치하고 얻어진 등쪽 피부를 10% NBF에 실온에서 24시간 동안 고정한 후 통상적인 방법으로 파라핀에 포매하고 5 ㎛ 두께로 연속절편을 만들었다. 피부 내 부종과 염증관련 세포 이주를 관찰하기 위해 연속절편을 Masson’s trichrome (M / T) 염색 후 관찰하였다.

5. 면역조직화학과 영상분석

진피 내 산화적 스트레스 유발 조절을 평가하기 위해 8-Oxo-2'-deoxyguanosine (8-OXdG); ECS system의 변화를 알기 위해 CB1과 CB2; 큰 포식세포의 세포를 알기 위해 Cluster of Differentiation 68 (CD68); 혈관확장 변화를 알기 위해 inducible nitric oxide synthase (iNOS); 부종유발 변화를 알기 위해 Matrix Metalloproteinase (MMP)-9; 그리고 긁기행동 변화를 알기 위해 물질 P (substance P) 등의 항체를 이용한 면역조직화학적 염색을 실시하였다. 우선 피부절편을 proteinase K (20 ㎍/㎖, Dako, USA)에 5분 동안 proteolysis 과정을 거친 후 1% fetal bovine serum (Sigma, USA)이 포함된 10% normal goat serum (Vector Lab, USA)에서 1시간동안 blocking 반응시켰다. 1차 항체인 mouse anti-8-OXdG (1:100, Santa Cruz Biotec, USA), mouse anti-CB1 (1:100, Santa Cruz Biotec), mouse anti-CB2 (1:100, Santa Cruz Biotec), mouse anti-CD68 (1:100, Abcam, USA), mouse anti-iNOS (1:50, Santa Cruz Biotec), mouse anti-MMP9 (1:50, Santa Cruz Biotec) 그리고 mouse anti-substance P (1:50, Santa Cruz Biotec)에 4 ℃ humidified chamber에서 72시간 동안 반응시켰다. 2차 항체인 biotinylated goat anti-mouse IgG (1:100, Abcam)에 실온에서 24시간 link 하였고, avidin biotin complex kit (Vector Lab)에 1시간 동안 실온에서 반응시켰다. 0.05% 3,3'-diaminobenzidine과 0.01% Hydrogen chloride (HCl)이 포함된 0.05 M tris-HCl 완충용액 (pH 7.4)에서 발색시킨 후, hematoxylin으로 대조염색하였다. 면역조직화학의 결과는 image Pro 10 (Media cybernetics, USA)를 이용한 영상분석을 통해 수치화 (means ± standard error) 되었다. 각 군의 피부표본 10개를 임의로 선정한 후 x 200 배율에서 촬영한 다음 positive pixels (intensity 80~100) / 20,000,000 pixels로 영상분석하였다.

6. 통계

통계는 SPSS software (SPSS 25, SPSS Inc., USA)를 이루어졌으며, one-way ANOVA 시행을 통해 유의성 (p < 0.05)을 검증하고, 사후 검증은 Tukey HSD를 실시하였다.

Ⅲ. Results

1. 지방장벽 회복

백호탕 추출물 적용에 따른 피부 진피 내 염증성 변화를 조사하기 위해 M / T 염색을 통한 조직학적 구조를 관찰하였다. 피부염에 따른 기저층 내 붕괴 바닥면 주변의 진피유두에서 염증관여 세포의 침윤 증가, Collagen fiber의 분포 감소, 혈관 신생성 증가 등의 구조적 변화가 관찰되었다. 이에 반해 BHTT의 피부에서는 LBEG와 PEAT에서 관찰되었던 부종, 염증세포이주 증가 등의 피부염 손상이 줄어든 것으로 나타났다 (Figure 1).

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Figure 1. The mitigative effects of lipid barrier elimination invoked dermal inflammation by BHT.

The BHT treatment relieved symptom as edema, infiltration of inflammatory cell, and enlarged capillary in BHTT. The distribution of 8-OXdG (arrow indicates light brown particle) was significantly decreased in BHTT as compared with LBEG and PEAT, the data of 8-OXdG image analysis showed the same results (8-OXdG immunohistochemistry).

Abbreviations: BHT, Baeckho-tang; BHTT, BHT extract treatment group after lipid barrier elimination; Ctrl, normal; DE, dermis; EP, epithelium; LBEG, lipid barrier eliminated group; M / T, Masson’s trichrome; 8-OXdG, 8-Oxo-2'-deoxyguanosine; PEAT, palmitoylethanolamide treatment after lipid barrier elimination; Bar size, 50㎛; *, p < 0.05 compared with LBEG; #, p < 0.05 compared with PEAT.

한편 진피 내 산화적 스트레스 변화는 8-OXdG 면역조직화학적 염색 실시 후 영상분석을 통해 조사되었다. 8-OXdG 양성반응은 지방장벽 제거된 LBEG, PEAT 그리고 BHTT 모두에서 Ctrl에 비해 유의성 있는 증가 경향을 보였다. LBEG의 8-OXdG 양성반응은 Ctrl (13,450 ± 648 / 20,000,000 pixel)에 비해 353% 증가한 60,940 ± 876 / 20,000,000 pixel로, PEAT는 199% 증가한 40,187 ± 910 / 20,000,000 pixel로, 그리고 BHTT는 105% 증가한 27,541 ± 837 / 20,000,000 pixel로 측정되었다. BHTT의 8-OXdG 양성반응은 LBEG에 비해 55% 감소하였고, PEAT에 비해 31%로 유의성 있게 감소 한 것으로 확인되었다 (Figure 1).

2. 진피 내 ECS 변화

진피 내 ECS 변화는 CB1 면역조직화학적 염색 실시 후 영상분석을 통해 조사되었다. CB1 양성반응은 지방 장벽이 제거된 LBEG, PEAT 그리고 BHTT 모두에서 Ctrl에 비해 유의성 있는 증가 경향을 보였다. LBEG의 CB1 양성반응은 Ctrl (17,408 ± 583 / 20,000,000 pixel)에 비해 28% 증가한 22,246 ± 432 / 20,000,000 pixel로, PEAT는 112% 증가한 36,940 ± 432 / 20,000,000 pixel로, 그리고 BHTT는 224% 증가한 56,424 ± 781 / 20,000,000 pixel로 측정되었다. BHTT의 CB1 양성반응은 LBEG에 비해 154%로, PEAT에 비해 53%로 유의성 있는 증가를 한 것으로 확인되었다 (Figure 2).

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Figure 2. The regulation of endocannabinoid (ECS) system by application of BHT.

The positve reaction of CB1 and CB2 (arrow indicates light brown particle) were significantly increased in BHTT as compared with LBEG and PEAT (Immunohistochemistry; Bar size, 50㎛). The data of image analysis for positive reaction showed the same results.

Abbreviations: BHT, Baeckho-tang; BHTT, BHT extract treatment group after lipid barrier elimination; Ctrl, normal; CB, cannabinoid receptor; DE, dermis; EP, epithelium; LBEG, lipid barrier eliminated group; M / T, Masson’s trichrome; PEAT, palmitoylethanolamide treatment after lipid barrier elimination; Bar size, 50㎛; *, p < 0.05 compared with LBEG; #, p < 0.05 compared with PEAT.

한편 진피 내 CB2 양성반응은 지방장벽이 제거된 LBEG에서는 감소하였고, PEAT와 BHTT에서는 Ctrl에 비해 유의성 있는 증가 경향을 보였다. LBEG의 CB2 양성반응은 Ctrl (15,509 ± 406 / 20,000,000 pixel)에 비해 33% 감소한 10,416 ± 299 / 20,000,000 pixel로, PEAT는 81% 증가한 28,094 ± 547 / 20,000,000 pixel로, 그리고 BHTT는 120% 증가한 34,159 ± 468 / 20,000,000 pixel로 측정되었다. BHTT의 CB2 양성반응은 LBEG에 비해 228%로, PEAT에 비해 22%로 유의성 있게 증가 한 것으로 확인되었다 (Figure 2).

3. 진피 내 항염증 변화

진피 내 큰 대식세포의 변화는 CD68 면역조직화학적 염색 실시 후 영상분석을 통해 조사되었다. CD68 양성반응은 지방장벽 제거된 LBEG, PEAT 그리고 BHTT 모두에서 Ctrl에 비해 유의성 있는 증가 경향을 보였다. LBEG의 CD68 양성반응은 Ctrl (12,130 ± 540 / 20,000,000 pixel)에 비해 300% 증가한 48,600 ± 570 / 20,000,000 pixel로, PEAT는 196% 증가한 35,889 ± 419 / 20,000,000 pixel로, 그리고 BHTT는 91% 증가한 23,148 ± 623 / 20,000,000 pixel로 측정되었다. BHTT의 CD68 양성반응은 LBEG에 비해 52%로, PEAT에 비해 36%로 유의성 있는 감소한 것으로 확인되었다 (Figure 3).

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Figure 3. The regulation of inflammation by application of BHT.

The positve reaction of CD68, iNOS, MMP-9 and substance P (arrow indicates light brown particle) were significantly decreased in BHTT as compared with LBEG and PEAT (Immunohistochemistry; Bar size, 50㎛). The data of image analysis for positive reaction showed the same results.

Abbreviations: BHT, Baeckho-tang; BHTT, BHT extract treatment group after lipid barrier elimination; CD68, Cluster of Differentiation 68; Ctrl, normal; DE, dermis; EP, epithelium; iNOS, inducible nitric oxide synthase; LBEG, lipid barrier eliminated group; MMP-9, Matrix metallopeptidase 9; PEAT, palmitoylethanolamide treatment after lipid barrier elimination; Bar size, 50㎛; *, p < 0.05 compared with LBEG; #, p < 0.05 compared with PEAT.

진피 내 혈관확장 변화는 iNOS 면역조직화학적 염색 실시 후 영상분석을 통해 조사되었다. iNOS 양성 반응은 지방장벽 제거된 LBEG, PEAT 그리고 BHTT 모두에서 Ctrl에 비해 유의성 있는 증가 경향을 보였다. LBEG의 iNOS 양성반응은 Ctrl (12,981 ± 878 / 20,000,000 pixel)에 비해 298% 증가한 51,600 ± 564 / 20,000,000 pixel로, PEAT는 168% 증가한 34,690 ± 900 / 20,000,000 pixel로, 그리고 BHTT는 91% 증가한 24,765 ± 511 / 20,000,000 pixel로 측정되었다. BHTT의 iNOS 양성반응은 LBEG에 비해 52%로, PEAT에 비해 29%로 유의성 있는 감소한 것으로 확인되었다 (Figure 3).

진피 내 부종유발 변화는 MMP-9 면역조직화학적 염색 실시 후 영상분석을 통해 조사되었다. MMP-9 양성반응은 지방장벽이 제거된 LBEG, PEAT 그리고 BHTT 모두에서 Ctrl에 비해 유의성 있는 증가 경향을 보였다. LBEG의 MMP-9 양성반응은 Ctrl (10,656 ± 434 / 20,000,000 pixel)에 비해 526% 증가한 66,681 ± 605 / 20,000,000 pixel로, PEAT는 333% 증가한 46,186 ± 938 / 20,000,000 pixel로, 그리고 BHTT는 227% 증가한 34,863 ± 639 / 20,000,000 pixel로 측정되었다. BHTT의 MMP-9 양성반응은 LBEG에 비해 48%로, PEAT에 비해 25%로 유의성 있게 감소한 것으로 확인되었다 (Figure 3).

진피 내 긁기 행동 변화는 subtance P 면역조직화학적 염색 실시 후 영상분석을 통해 조사되었다. subtance P 양성반응은 지방장벽 제거된 LBEG, PEAT 그리고 BHTT 모두에서 Ctrl에 비해 유의성 있는 증가 경향을 보였다. LBEG의 subtance P 양성반응은 Ctrl (12,522 ± 730 / 20,000,000 pixel)에 비해 231% 증가한 41,451 ± 672 / 20,000,000 pixel로, PEAT는 156% 증가한 32,087 ± 516 / 20,000,000 pixel로, 그리고 BHTT는 86% 증가한 23,245 ± 517 / 20,000,000 pixel로 측정되었다. BHTT의 subtance P 양성반응은 LBEG에 비해 44%로, PEAT에 비해 28%로 유의성 있게 감소한 것으로 확인되었다 (Figure 3).

Ⅳ. Discussion

본 연구에서는 피부의 지방장벽을 제거하여 인위적인 피부염증 반응을 유도한 NC/Nga 생쥐 모델을 사용하여 백호탕 추출물을 경구투여한 후 지방장벽 회복, ECS 조절능 및 항염증 효과를 군별 비교 분석하였고, BHTT에서 Ctrl 및 PEAT에 비해 유의한 효과가 있음을 확인하였다.

AD는 Th1, Th2 세포 매개의 염증성 cytokine 및 Immunoglobulin E 방출과 연관되어 발생하며, CD4+ / CD8+ T세포, 비만세포 및 대식세포 활성 증가 등의 면역학적 소견을 특징으로 하는 소아기 대표적인 알레르기성 피부질환이다19). 이러한 특징 뿐 아니라, 표피 지질, filaggrin 등이 이루는 표피장벽의 결함 등이 복합적으로 작용하여 만성 재발성으로 홍반, 소양감, 부종과 같은 심한 염증성 병변을 야기한다20). 피부는 활성 신경 면역 내분비 기관 중 하나로, 물리적 장벽으로서의 수동적 기능과 면역 내분비 장벽으로서의 능동적 기능을 모두 가지고 있다21). AD에서 이러한 피부의 기능을 모두 정상적으로 회복시키기 위해서는 피부의 물리적 장벽 손상을 회복하고, 면역 내분비 기관으로서의 기능을 회복함으로서 염증반응 억제로 이어지게 해야한다. 따라서, AD의 치료로는 이러한 염증성 인자들의 조절과 억제를 담당하는 corticosteroid, calcineurin inhibitor, cyclosporin A, methotrexate, azathioprine 등의 치료제와 표피장벽 강화를 위한 보습 및 연화제가 보조치료제로 사용되고 있다22). 이와 같은 치료제들은 단일 국소 corticosteroid 사용에 그쳤던 과거 치료법에 비하면 발전되어 온 것이나, 이들의 작용 기전이 여러 cytokine 수용체 및 면역계와 연결된 신호전달기전에만 작용하는 제한적인 접근에 그치고 있어, AD 치료에 대해 보다 다양한 접근의 필요성이 제기되고 있다23).

ECS는 CB1, CB2 및 endocannabinoid를 생성 및 분해하는 효소로 구성되어 있는 생체조절시스템으로 신경전달, 통증관리, 염증 반응의 각종 신호전달과정에 영향을 준다23). 체내 ECS는 특히, 피부의 각질층에 다량 존재하며, 습진24), 대상포진 후 신경통25), AD22), 접촉성 및 알레르기성 피부염과 같은 피부 병변에서23) 세포의 증식, 분화 및 균형을 조절하여 피부세포의 생존을 조절함으로써, 염증성 증상의 완화에 상당한 역할을 하는 것으로 연구되었다. 피부염증과 ECS 관련 선행연구들에 의하면 체내 합성되는 ECS 화합물 중 PEA를 위주로 연구가 진행되고 있으며, PEA가 CB1, CB2 조절을 통해 각질층의 지질을 생성하여 피부 재생 및 지방장벽 회복, 피부 면역능 증가와 같은 수동적이면서 능동적인 피부의 기능을 동시에 제어하고 있음을 밝히고 있다28). 따라서, 본 연구에서는 임상에서 AD에 많이 활용되고 있는 백호탕이 ECS 조절을 통해 지방장벽의 기능을 회복시키고, 이것이 항염증 효과로 이어지는지를 PEA의 효과와 비교하였다.

연구결과, CB1 양성반응의 경우 BHTT가 LBEG에 비해 154%, PEAT에 비해 53%로 유의한 증가를 보였으며, CB2 양성반응은 LBEG에 비해 228%, PEAT에 비해 22%로 유의하게 증가하였다. ECS는 산화 스트레스와도 밀접한 연관이 있는데29), DNA 분자 내에 존재하는 8-OXdG는 자외선 혹은 화학물질과 같은 외부 스트레스에 의해 손상된 각질층에서 그 발현이 증가하는 것으로 알려져 있어, 염증성 피부병변에서의 산화적 스트레스 정도를 알 수 있는 주요 지표 중 하나이다29). 연구 결과, 8-OXdG 양성반응은 BHTT가 LBEG에 비해 55% 감소하였고, PEAT에 비해 31%로 적게 증가함을 확인하였다. 피부장벽 내 지질의 산화는 곧 지방장벽이 손상되는 과정에 관여하므로30) 8-OXdG가 BHTT에서 PEAT에 비해 적게 발현된 결과는 백호탕이 PEA에 비해 피부 지방장벽의 회복에 더 효과가 있다는 것을 의미한다. 앞선 지표들의 변화를 통해 확인한 결과들로 볼 때, 백호탕이 CB1, CB2와 같은 ECS 핵심 인자들의 활성을 증가시키는 효과가 있음을 의미하며, 이것이 각질층의 산화적 스트레스를 완화하여 지방장벽의 구조적 손상 회복에 영향을 주었다고 해석해 볼 수 있다. CB1, CB2 활성화는 산화 스트레스의 발현과 cytokine 폭풍을 유발시키는 reactive oxygen species 및 tumor necrosis factor-α를 감소시켜 항산화 및 항염증 반응을 강화한다는 Paloczi의 연구를 참고하여 볼 때29), 백호탕이 ECS 조절을 통해 항산화 및 항염증 효과를 가진다고 볼 수 있다.

항염증 반응에 대한 효과를 보다 자세히 확인하기 위해 CD68, iNOS, MMP-9, substance p와 같은 염증성 인자들의 변화를 확인하였다. CD68은 대식세포 및 단핵구에서 발현되는 단백질로서, 염증성 질환 및 면역 관련 질환 연구에서 면역세포의 활성화 및 염증 정도를 평가하는 주요 마커로 사용되는 지표이다. 각종 염증성 피부병변에서 각질세포의 증식과 염증성 cytokine의 과발현은 CD68 활성화와 연관이 있는데31), 특히 Barros의 연구에서는 대식세포의 특이적인 표지자인 CD68의 발현이 Th2 우세 면역반응의 진행과 밀접한 상관관계가 있음을 증명하였다32). Th2 우세 면역반응은 Interleukin (IL)-4, IL-13 등의 면역세포 인자들의 방출이 Th1 cytokine에 비해 촉진된 면역 환경을 의미하며, 이는 비만세포의 탈과립화를 유도하여 MMP-9, substance P와 같은 염증 매개체 분비의 증가를 유도하게 된다33). MMP-9은 세포 외 기질에서 콜라겐 섬유를 제거하여 부종을 유발하고30), substance P의 경우 혈관 투과성을 증가시켜 histamine 분비를 유도함으로서, 염증반응을 촉진하고 소양감을 유발한다31). 또한, iNOS는 Extracellular signal-regulated kinase 및 p38 활성화 억제를 통해 cyclooxygenase-2 상향조절을 제어하여, 염증반응 조절의 핵심 구성요소로 작용하므로, 여러 선택적 iNOS 억제제들이 피부질환 치료약물 개발을 목표로 연구되고 있다35). 본 연구에서 CD68, MMP-9, substance P 및 iNOS와 같은 염증성 매개물질의 분비가 BHTT에서 나머지 대조군에 비해 유의하게 감소됨을 확인하였으며, 이는 최종적으로, MMP-9 감소로 인한 부종감소, substance P 및 iNOS 발현 억제를 통한 혈관 확장 반응 감소의 조직학적 변화를 야기하였다. 따라서, 백호탕은 ECS 조절을 통해 비만세포의 탈과립화를 억제하고, iNOS가 발현되는 여러 신호전달경로를 조절하여, 다양한 염증성 매개물질의 분비 감소에 영향을 줄 수 있다.

백호탕은 淸熱生津 효능이 있어, 당뇨, 건선, AD, 갑상선 질환과 같이 진액고갈과 염증성 병변이 동반되는 질환에서 빈번히 처방되고 활용도가 높은 처방 중 하나이다12). 구성 약재 중 석고는 肺衛氣分의 열을 淸解하는 효과가 있어 煩燥, 熱毒壅盛, 發斑發疹 등을 치료하며, 지모는 淸熱除煩, 滋陰降火 효능이 있어 煩熱消渴, 骨蒸勞熱을 치료한다12). 석고는 한의학에서 지모와 함께 사용 시 淸熱효과가 강화되는 것으로 알려져 있어37) 백호가인삼탕, 지황백호탕 등 여러 처방에서 함께 사용되고 있다. 실험적으로 석고가 지모 유래 활성 성분의 장내 흡수율을 증가시켜 석고 단독 사용 시 보다 항 알레르기 작용을 증대시킨다는 연구도 있으며38), 이러한 근거들은 본 연구에서 여러 염증 매개물질이 억제된 것과 일맥상통하였다. 그 외 갱미는 除煩渴하여 心煩口渴을 치료하고, 감초는 潤肺, 解毒하여 癰疽瘡瘍을 치료하는 효능이 있다12). 홍반, 소양감, 부종, 삼출물 등으로 나타나는 염증 반응은 한의학에서 열, 열독을 그 원인으로 보고 있어, 대표적인 염증성 피부 질환인 AD 또한, 백호탕의 淸熱 효능이 실험 결과와 대응됨을 확인할 수 있다. 또한, 백호탕은 피부염 외에도 소갈35), 위완통에 대한 증례 보고가 된 바 있으며41), p38 mitogen-activated protein kinase, Nuclear Factor Kappa B 활성 조절을 통한 iNOS 억제 효능41), 패혈증 유도 동물모델에서 IL-6, IL-10 억제 효능42) 및 표피장벽의 Transepidermal water loss, pH 감소를 통한 Th2 분화능 억제 효과가 입증된 바 있어13), 본 연구 결과에서 나타난 지방장벽 회복능, ECS 조절 및 항염증 효과 또한 백호탕을 활용한 선행연구들에서 밝혀진 면역학적 근거와 부합한다.

이상으로 백호탕은 CB1, CB2와 같은 ECS의 주요 구성 요소들의 활성을 조절하여 지방장벽을 회복시키고, CD68, iNOS, MMP-9, substance p와 같은 염증 매개인자들의 억제 효과를 보여주었다. 이 결과들은 각종 염증 및 통증 질환의 치료 보조제로 사용되고 있는 PEA 보다 유의한 결과를 보여주어 백호탕이 ECS 조절을 통한 항염증 효과를 기대해볼 수 있는 치료제로서의 가능성을 제시해주었다. 본 연구는 실험 동물 사용에 있어 임상에서 AD 환자들은 단순히 염증성 피부병변이라는 국소적 증상 뿐 아니라, 음식, 수면, 스트레스 등의 여러 환경적 요인들의 영향을 복합적으로 경험하고 있어, 단순히 염증을 억제하는 치료만으로는 치료가 어려운 경우가 많다. 본 연구의 ECS조절을 통한 염증성 질환의 접근은, 단순히 염증반응을 억제만 하는 치료가 아닌 인체 전반에 작용하는 신호전달경로에 영향을 줄 수 있다는 점과, 염증반응에 영향을 주는 환경적 인자에 대한 생체시스템 조절에도 긍정적 영향을 줄 수 있다는 점을 고려하여 볼 때 점점 복잡해지는 현대 사회에서 AD 치료를 보다 종합적으로 접근할 수 있는 치료제의 가능성을 확인하였다는 점에 의의가 있다. 다만, 본 연구는 ECS의 작용기전을 명확하게 밝히지는 못하였으며, 동물을 대상으로 하여 생물학적 차이가 있는 인체에 적용하기에는 재현성 측면에서 부정확할 수 있다는 한계가 있다. 따라서 임상에서 적극적으로 활용하기 위한 근거 마련 연구로 보아야 할 것이며, 향후 추가적인 임상 연구가 필요하다.

Ⅴ. Conclusion

본 연구에서는 AD유발 동물모델을 대상으로 백호탕 투여 시 CB1, CB2 활성 확인을 통해 ECS 조절여부를 확인하고, CD68, iNOS, MMP-9, substance P 변화를 통한 항염증 효과를 확인하였기에 다음과 같은 결과를 보고하는 바이다.

1. 지방장벽 회복

1) 조직학적 소견 상 BHTT에서 LBEG, PEAT와 비교하여 진피 내 부종, 염증세포 이주 증가 등 피부염 손상이 감소되었다.

2) 8-OXdG 양성반응이 BHTT에서 LBEG, PEAT와 비교하여 유의하게 감소하였다.

2. ECS 조절능

1) CB1 양성반응은 BHTT에서 LBEG에 비해 154%, PEAT에 비해 53%로 유의하게 증가하였다.

2) CB2 양성반응은 BHTT에서 LBEG에 비해 228%, PEAT에 비해 22%로 유의하게 증가하였다.

3. 항염증 반응

1) CD68 양성반응은 BHTT에서 LBEG에 비해 52%로, PEAT에 비해 36%로 유의하게 감소하였다.

2) iNOS 양성반응은 BHTT에서 LBEG에 비해 52%로, PEAT에 비해 29%로 유의하게 감소하였다.

3. MMP-9 양성반응은 BHTT에서 LBEG에 비해 48%로, PEAT에 비해 25%로 유의하게 감소하였다.

4. Substance P 양성반응은 BHTT에서 LBEG에 비해 44%로, PEAT에 비해 28%로 유의하게 감소하였다.

Ⅵ. Acknowledgement

이 성과는 정부 (과학기술정보통신부)의 재원으로 한국연구재단의 지원을 받아 수행된 연구임 (No. 2020R1F1A1061970).

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