Antioxidant and Anti-obesity Effects of Mulberry (Morus alba L) Fermented withLactobacillus plantarum JCM 1149 or Pichia kudriavzevii Atz-EN-01

Lactobacillus plantarum JCM 1149와 Pichia kudriavzevii Atz-EN-01를 이용한 오디 발효액의 항산화 및 항비만 효과

Abstract

To improve the functionality of mulberry, samples were fermented with Lactobacillus plantarum JCM 1149 (LP) or Pichia kudriavzevii Atz-EN-01 (PK), and their antioxidant and anti-obesity activities were compared to those of unfermented mulberry. After fermenting for 60 hr, the total polyphenol and flavonoid content of the PK-fermented mulberry (PKFM) and LP-fermented mulberry (LPFM) was 1.5-fold and 2-fold higher, respectively, while the total anthocyanin content was 1.3-fold and 1.5-fold higher in the PKFM and LPFM, respectively. DPPH radical scavenging activity was found to be 16.3% higher (86% vs. 100%) after PK fermentation and 8.1% higher (86% vs. 93%) after LP fermentation. The lipase inhibitory activity of the LPFM and PKFM was 62.9% and 52.5%, respectively. 3T3-L1 preadipocytes were treated with unfermented mulberry, LPFM, or PKFM at 200, 400, or 800 ㎍/ml and stained with oil-red-O. A slight difference in the staining was observed in samples treated with 400 ㎍/ml. However, treatment with 800 ㎍/ml significantly reduced staining compared to the control, and the LPFM exhibited relatively higher adipogenesis inhibitory activity than the PKFM. Blood triglyceride content increased by 9.5% in the high-fat diet group, but decreased by 17.1% in the control group, 37.1% in the LPFM group, and 41.6% in the PKFM group. The blood triglyceride content of the LPFM group decreased by 43.1% and 21.4% compared to the high-fat diet group and the control group, respectively, and that of the PKFM group decreased by 48.6% and 28.9% compared to the same groups. In conclusion, the results indicate that fermented mulberry has increased antioxidant activity, lipase inhibitory activity, and adipogenesis inhibition activity, and decreased blood triglyceride content compared to unfermented mulberry.

오디의 기능성을 증진하기 위한 일환으로 유산균 L. plantarum JCM 1149 (LP)와 효모 P. kudriavzevii Atz-EN-01 (PK)로 발효한 오디액과 발효하지 않은 대조구 오디액의 항산화와 항비만 활성 관련 여러 지표들을 비교 조사하였다. 60시간 발효 후 PK와 LP 발효 오디액의 총 폴리페놀 및 총 플라보노이드 함량은 대조구보다 각각 1.5배 및 2배 증가하였고 총 안토시안닌 함량은 대조구에 비해 PK 발효 오디액이 1.3배, LP 발효 오디액이 1.5배 증가하였다. PK 발효 오디액의 DPPH 라디칼 소거활성은 86%에서 100%로 16.3% 증가하였으나 LP 발효 오디액은 86%에서 93%로 상대적으로 낮은 8.1% 증가하였다. LP와 PK 발효 오디액의 lipase 효소에 대한 저해율은 대조구 대비 62.9%와 52.5%로 나타났다. 발효 오디액이 3T3 - L1 지방전구 세포가 지방구를 포함한 지방세포로 분화되는 과정을 억제하는 효과를 조사하기 위해 대조구인 비발효오디 농축액과 LP 및 PK 발효 오디 농축액을 200, 400, 800 ㎍/ml 농도로 처리한 후 oil-red-O로 염색한 결과 400 ㎍/ml에서는 대조구에 비해 근소한 염색차이를 보였다. 반면에 800 ㎍/ml 처리는 대조구와 비교하여 유의하게 염색을 감소시켰으며 LP 발효 오디 농축액이 PK 발효 오디 농축액 보다 상대적으로 더 높은 지방구 생성 억제활성을 나타내었다. SD rats을 이용한 6주 간 동물실험 결과 혈청 중성지방 함량의 경우 고지방 식이군은 9.5% 증가하였으나 대조군은 17.1%, LP 발효 오디 농축액 실험군은 37.1%, 그리고 PK 발효 오디 농축액 실험군은 41.6% 감소하였다. LP 발효 오디 농축액 실험군과 PK 발효 오디 농축액 실험군의 중성지방 함량은 고지방 식이군과 대조군에 비해 각각 43.1%와 21.4% 그리고 48.6%와 28.9%씩 감소하였다. 이상의 결과로부터 유산균(LP)이나 효모(PK)로 발효한 오디는 발효하지 않은 오디에 비해 항산화활성, lipase 저해활성 및 지방구 생성 억제력을 증가시키고 혈청 중성지방 함량을 감소시키는 효과를 나타내는 것으로 확인하였다.

서론

최근 식품 소비는 영양의 개념을 뛰어넘어 건강을 증진시키고 궁극적으로 질병을 치료하는 데 기여할 수 있는 기능성 식품에 대한 수요가 급격히 증가하고 있다. 특히 발효식품에 대한 건강식품으로 인식이 확대되면서 발효미생물을 이용한 기능성 강화 및 품질향상을 위한 다양한 연구들이 진행되고 있다[31]. 현대인들의 과도한 영양 섭취로 인한 비만은 심각한 사회경제적인 문제 중 하나로 대두되고 있다. 이러한 비만은 체지방을 증가시킬 뿐만 아니라 제 2형 당뇨, 고혈압, 암 그리고 심혈관 질환 등 합병증을 유발한다[28, 39]. 최근 우리나라의 식습관이 서구화됨에 따라 과도한 지방섭취로 인해 제 2형 당뇨병, 비만이나 고지혈증과 같은 생활습관병이 증가하고 있다. 70년대 한국에서 당뇨병 발병율은 1.5% 정도였으나 최근에는 10%로 높게 증가되었다[24]. 비만의 예방과 치료를 위한 수단으로는 음식 섭취 감소와 운동과 같은 생활습관을 고치는 자연적인 방법과 영양소 흡수의 억제, thermogenesis 증가, 지방 또는 단백질 대사를 조절하는 인위적인 방법이 존재한다. 현재 연구자들은 비만을 개선을 위하여지방세포 분화의 감소, lipogenesis 감소, lipolysis 증가와 지방세포의 세포사멸을 유도하는 연구 등을 하고 있다[1, 14, 28]. 이러한 비만 연구를 위한 실험으로는 mouse 지방전구세포인 3T3-L1을 통한 in vitro 모델이 많이 사용되고 있다[1]. 3T3-L1 세포는 adipogenesis 과정을 통하여 지방전구세포에서 성숙된 지방세포로 분화가 유도된다. 최초 지방전구세포는 postconfluent상태에서 3-isobutyl-1methylxanthine (IBMX), dexamethasone과 insulin으로 자극하면 cell to cell contact에 의해 성장이 억제되었던 세포가 다시 증식하기 시작한다[13, 42]. 이를 mitotic clonal expansion(MCE)이라고 하는데, 이 MCE과정은 adipogenesis 유전자 발현을 위한 DNA의 remodeling 과정이다[9, 29]. 현재 연구되고 있는 비만 치료제들은 이러한 MCE 과정을 방해하여 지방 형성을 줄이는데 초점을 맞추고 있다. 따라서 본 실험에서 3T3-L1 지방전구세포에서 지방세포의 분화와 세포 내 지방 합성에 관련된 지표 유전자의 발현정도를 확인하였다. 완전히 분화된 지방세포에서는 fatty acid synthase (FAS), peroxisome proliferator-activated receptor gamma (PPAR-γ), CCAAT-enhancer-binding proteins (c/EBP-α) 그리고 sterol regulatory element-binding protein (SREBP-1)이 높게 발현된다[7, 29]. 최근 수많은 식품 소재들의 건강증진 효능 및 질병 예방 효과가 밝혀지면서 소비자들은 식품이 갖는 영양소 공급을 위한 1차적 기능을 넘어 식품의 생리활성에 대한 관심이 증대되고 있다. 과실에는 강력한 항산화 효과를 가지는 여러 가지 생리활성 성분, 즉 비타민, 카로티노이드 및 폴리페놀, 플라보노이드와 같은 페놀성 화합물들이 많이 존재하며 이러한 성분들은 항 궤양, 항 경련, 위 장관의 위액 분비 조절과 설사 예방, 당뇨 예방, 암, 심장병 및 퇴행성 질병들의 예방과 감소에 크게 기여한다고 보고되었다[5, 6]. 오디는 ‘상심자’로 불리며 백발을 검게 하며 소갈을 덜어주고 오장을 이롭게 하는 자양, 강장제뿐만 아니라 빈혈, 고혈압, 관절통 및 대머리 치료제로써 사용되고 있다[8, 26]. 오디는 cyanidin-3-glucoside 와 cyanidin-3-rudinoside 와 같은 anthocyanin 류의 색소뿐만 아니라 citric acid, malic acid 및 succinic acid 와 같은 유기산과 polyphenol 등을 다량 함유하고 있다. 특히 오디에 함유된 C3G는 여러 색소 중에서도 항산화력이 뛰어난 것으로 알려져 있으며 레스베라트과 같은 다른 생리활성물질도 포함되어 있는 것으로 알려져 있다[17].

또한 오디는 당과 유기산 이외에 안토시아닌(anthocyanin) 색소를 다량 함유하고 있다. 안토시아닌 색소는 노화억제, 시력 개선, 항 당뇨, 항 염증 및 항산화 등의 생리활성과 항균활성, 혈전 용해능, 항암 및 항 종양 등의 활성도 있는 것으로 보고되었다. 완숙 오디는 식감이 좋고 당도가 높으며 식품에 첨가 시 색깔이 우수하여 기능성식품 및 가공식품으로 활용되고 있다[39].

오디의 항 당뇨 효과, 뽕나무 오디 추출물의 항 염증과 항산화 작용에 대한 연구, 뽕나무와 꾸지뽕 나무의 수용성 추출물에 대한 항산화 활성 연구, 품종이 다른 오디 추출물의 항균 활성 및 항산화 효과 등의 연구가 보고되었다[6, 8, 20]. 또한 뽕나무 품종 별 오디의 영양 및 기능성 성분과 이화학적 특성 비교, 오디로부터 분리한 페놀성물질의 항산화 효과, 오디 즙 및 오디 박 분말의 streptozotocin 으로 유발한 당뇨 쥐에 대한 혈당 및 혈청 지질 강화 등에 대한 보고는 있으나 발효 오디의 항 비만 효과에 대한 연구는 상대적으로 적은 편이다[17, 20]. 유산균은 면역증강, 간경화 개선작용, 장내 유해세균 제거, 알레르기 감소, 아토피 완화, 콜레스테롤 함량 저하, 항암효과, 변비예방 등 다양한 효능이 있다고 알려져 있다. 최근 연구에서는 에너지 항상성에 관여하는 PPAR γ 유전자를 조절하여 비만을 억제하고 혈당을 조절한다고 보고되었다[10, 24].

따라서 본 연구에서는 오디의 발효 시간 별 성분변화, 이화학적 특성, 항 산화능을 비교하고 발효 오디액이 3T3-L1 지방 전구세포의 분화과정에 미치는 영향을 조사하고 동물실험을 통한 항비만 효과를 검증함으로써 오디의 식품소재로서 활용가능성을 검토하고자 한다.

재료 및 방법

실험 재료

본 연구에 사용된 오디(Morus alba L.)는 경상남도 산청군 지리산 일대에서 재배한 것을 수확하여 냉동 보관하면서 필요할 때 분쇄기에 갈아서 사용하였다. 실험에 사용된 대부분의 시약은 주로 Sigma-Aldrich Co. (St. Louis, MO, USA) 제품을, 미생물 배지는 BD Difco (Sparks, MD, USA) 제품을 사용하였다.

미생물 선별 및 오디 발효

오디 발효에 사용할 미생물을 선택하기 위해 다양한 발효식품 및 토양에서 분리하고 프로테아제, 아밀라아제, 셀룰라아제 등 효소활성이 높은 균주들을 선택하여 동정하기 위해 (주)솔젠트(Daejeon, Korea)에 의뢰하였다. 16S나 18S rRNA 유전자 염기서열분석에 의한 분자계통학적 동정을 통해 Lactobacillus plantarum JCM 1149과 Pichia kudriavzevii Atz-EN-01 (data not shown)을 최종 선택하였다. 분쇄한 오디와 증류수의 1:1 혼합액 100 ml를 삼각 플라스크에서 121℃, 15분간 멸균한 후 L. plantarum JCM 1149 과 P. kudriavzevii Atz-EN-01의 1.5% 전 배양액을 각각 접종하여 37℃에서 60시간 배양하였다. 12시간 간격으로 15 ml씩 회수한 뒤 생균수를 측정하고 원심 분리하여 상등액을 회수하고 pH를 측정한 후 0.25 μm (Millipore Co., Billerica, MA, USA) 막여과지로 여과하여 폴리페놀 함량, 총 플라보노이드 함량, 총 안토시아닌 함량, DPPH 라디칼 소거능 및 lipase 저해활성 등을 측정하기 위한 시료로 사용하였다[22].

총 폴리페놀 함량

오디 발효 여과액을 사용하여 Folin과 Denis [12]의 방법으로 총 폴리페놀 함량을 측정하였다. 오디 발효액 시료 50 μl와 20% Folin-ciocalteu's phenol reagent 50 μl 혼합액을 25℃에서 3분 동안 반응시켰다. 10% Na₂CO₃ 용액 450 ml를 첨가하고 25℃에서 1시간 반응시킨 후 730 nm에서 흡광도를 측정하였다. 표준물질로 gallic acid를 사용하여 작성한 검량곡선을 바탕으로 총 폴리페놀 함량을 1 ml 중 μg으로 환산하여 나타내었다.

총 플라보노이드 함량

식물계에 널리 분포되어 있는 총 폴리페놀성 화합물은 다양한 구조와 분자량을 가진 이차 대사산물로써 자유라디칼을 제거함으로써 산화적 스트레스를 감소하고 활성산소를 제거하여 항균, 항암, 심장질환 예방 및 노화방지 등을 나타내는 생리활성 물질로 알려져 있으며 식×의 약품 등에 다양하게 이용되고 있다[23]. 플라보노이드 함량은 Davis 방법을 변형하여 측정하였다. 오디 발효액 시료 1 ml와 5% sodium nitrite 150 μl을 혼합하여 실온에서 6분간 반응시킨 후 10% aluminium chloride 300 μl 첨가하고 실온에서 5분간 반응시키고 1 N NaOH 1 ml와 혼합한 뒤 510 nm에서 흡광도를 측정하였다. 표준 물질로 catechin (Sigma-Aldrich Co.)를 사용하였고 검량곡선을 이용하여 총 플라보노이드 함량을 1 ml 중 μg으로 환산하여 나타내었다[22].

총 안토시아닌 함량

총 안토시아닌의 함량은 Eom 등[11]이 보고한 방법을 참고하여 측정하였다. 오디 발효액 시료 0.4 ml씩 취하여 3.6 ml의 0.4 M sodium acetate buffer, pH 4.5와 0.025 M potassium chloride buffer, pH 1.0에 각각 혼합하여 520 nm 와 700 nm에서 흡광도를 측정한 후에 아래 식을 이용하여 cyanidin-3-glucoside로 환산하여 mg/dL로 나타내었다.

Total anthocyanin contents (%)=

\(\begin{aligned}\left[1-\left(\frac{\mathrm{A} \times \mathrm{MW} \times \mathrm{DF} \times 1000}{26,000 \times 1}\right)\right] \times 100\end{aligned}\)

A = (OD₅₂₀ －OD₇₀₀)_pH1.0- (OD₅₂₀ － OD₇₀₀)_pH4.5

MW = molecular weight of cyanidin-3–glucoside=449.2 g/mol

DF = dilution factor, l = cell length (cm)

26,900 = the molar absorptivity (A×mol^-1×cm^-1)

DPPH radical 소거활성

2, 2’-Diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH)는 화학적으로 안정한 free radical을 가지고 있는 수용성 물질로서 515-525 nm 파장범위에서 최대 흡광도를 나타내어 보라색을 띠게 되지만 ascorbic acid, butylated hydroxy anisole, 방향족 아민류 등의 항산화제에 의해 환원되면 노란색으로 변색되는 특성을 이용하여 항산화 물질의 전자공여능을 측정할 때 사용되는 화합물이다. 발효 시간 별 오디 발효액의 항산화 활성은 DPPH에 대한 전자 공여능(electrondonating activity, EDA)으로 측정하였다. 1.5×10^-4 M DPPH 160 μl와 증류수로 5배 희석한 오디 발효액 시료 40 μl를 혼합하여 상온에서 30분 동안 반응시킨 후 520 nm에서 흡광도를 측정하여 라디칼 소거능을 백분율로 나타내었다[30].

DPPH free radical scavenging activity (%) = \(\begin{aligned}(1-\frac{S}{C}) \times100\end{aligned}\)

S: Absorbance of sample

C: Absorbance of control (equal volume of DW instead of sample)

In vitro pancreatic lipase 저해활성

3.3 mg 돼지 췌장 유래 lipase를 1 ml의 0.25 M Tris buffer, pH 7.7에 녹여 효소액으로 사용하였다. 반응 완충액(0.25 M Tris, 0.25 M CaCl₂, pH 7.7) 100 μl, 효소액 50 μl, 오디 발효액 시료 100 μl 및 DW 650 μl 혼합액을 37℃에서 5분간 예열한 후 기질용액인 10 mM ρ-nitrophenyl dodecanate 100 μl을 첨가하여 37℃ 에서 15분간 반응시켰다. 20% SDS 500 μl을 넣어 반응을 정지시킨 후 15,000 rpm, 4℃에서 20분간 원심분리 한 후 상등액을 회수하고 412 nm에서 흡광도를 측정하였다. Lipase 저해활성은 다음과 같이 계산하였다[30].

Pancreatic lipase inhibitory activity (%) = \(\begin{aligned}\left[1-\left(\frac{S-B}{T-B}\right)\right] \times 100\end{aligned}\)

T: Absorbance without the sample

S: Absorbance of the sample

B: Absorbance without the enzyme

3T3-L1 지방전구세포 분화 억제효과

L. plantarum JCM 1149와 P. kudriavzevii Atz-EN-01로 각각 발효한 오디 농축액의 3T3-L1 지방전구세포의 분화에 대한 영향을 Choi 등[7]이 보고한 방법에 따라 조사하였다. 지방전구세포의 분화에 사용된 배지조성은 배양배지(minimal essential medium (MEM), 10 % FBS, 50 U/ml penicillin, 50 μg/ml streptomycin)에 0.5 mM IBMX, 1 mM dexamethasone 및 1.7 mM insulin 등을 포함하고 유도배지는 IBMX와 dexamethasone을 제외한 분화배지이다. 지방전구세포의 배양 및 분화를 위해 95% 습도, 5% CO₂, 37℃ 인큐베이터를 사용하여 배양배지는 3일마다 한 번씩, 분화배지는 3일마다 한 번씩 두 번, 유도배지는 분화배지를 두 번 교환한 후 3일 뒤 한 번 교환하였다. 이 때 분화배지와 유도배지에 0.45 μm syringe filter로 여과한 비발효 오디 농축액과 발효 오디 농축액(10 mg/ml)을 각각 200, 400, 800 μg/ml 최종 농도로 첨가하여 3일간 배양한 후 지방구의 생성을 확인하기 위하여 oil-red-O 염색을 실시하였다. 지방구의 염색은 먼저 well에 존재하는 세포 상층액을 제거한 후, 4% paraformaldehyde로 고정하였다. 100% 1,2-propanediol 탈수용액을 첨가한 뒤 5분 동안 배양한 후 oil-red-O 염색용액을 첨가하여 지방구를 염색하였다. Oil-red-O 염색 후 85% 1,2-propanediol 탈수용액으로 세척하고 염색한 well이 건조되지 않도록 증류수를 채운 뒤 200x 배율의 위상차 광학 현미경으로 염색된 지방구를 관찰하였다.

동물실험을 이용한 항비만 효과 검증

오디 발효액의 in vivo 항비만 활성을 조사하기 위해 male Sprague-Dawley (SD) rat 32마리를 ㈜효창사이언스(Seoul, Korea)에서 구입하여 1주간 정상 식이를 공급하여 적응기간을 가졌다. 실험동물을 고지방 식이군(HFD)(n=8), 대조군(비발효 오디 농축액 투여)(n=8), L. plantarum JCM 1149로 발효한 오디 농축액 투여군(n=8) 및 P. kudriavzevii Atz-EN-01로 발효한 오디 농축액 투여군(n=8)의 총 4군으로 나누고 동물실험을 수행하였다. 하루 실험 쥐 한 마리 당 25 g의 HFD 식이를 기본으로 대조군과 실험군의 경우 한 마리 당 0.2 g의 비발효 오디 농축액과 발효 오디 농축액을 각각 첨가하여 총 25.2 g을 공급하였다. 실험 기간동안 사육실의 온도는 20±2℃, 습도는 50~60%, 명암은 12시간 주기로 자동 조절하였다. 식이효율을 계산하기 위해 섭취 후 남은 사료 양을 매일 측정하였다. 체중은 실험 시작할 때 그리고 2주마다 한 번씩 같은 시간에 측정하였고 안구에서 채취한 혈액을 2,000 rpm에서 2분간 원심분리하여 혈청을 회수하여 냉장 보관하였다. 혈청 중성지방과 콜레스테롤 함량은 (주)아산제약의 중성지방 및 콜레스테롤 분석키트를 이용하여 정량하였다. 실험 시작 6주 후 혈액을 채취하고 해부하여 간을 적출하고 무게를 측정하였다. 본 연구의 모든 동물실험은 국립 창원대학교 동물실험윤리위원회의 사전 승인을 얻은 후 동물실험 윤리규정을 준수하여 수행하였다(Approval No. 2016-4).

통계처리

모든 실험은 3회 반복하여 측정한 값의 평균치와 표준편차(means ± SD)로 나타내었고, SPSS package program software (Version 25)를 이용하여 시료를 첨가하지 않은 control과 비교하여 Student’s t-test로써 유의성을 검증하였으며 F 값이 0.05 미만일 경우 유의성이 있는 것으로 판단하였다.

결과 및 고찰

발효 오디 중 pH 및 세포생장

오디 발효액의 pH는 발효 초기 약 5.0을 나타내었으나 발효시간이 지남에 따라 pH가 감소하였다. L. plantarum JCM 1149 (LP)를 사용한 오디 발효액의 pH는 배양시간 24시간까지 3.0으로 감소한 후 계속 이 값을 유지하였다. P. kudriavzevii Atz-EN-01(PK)는 발효시간에 따라 pH가 서서히 감소하여 48시간부터 4.0을 나타내었다(Fig. 1A). 당도는 두 발효액에서 감소하였는데 이는 발효과정에서 당류화합물이 미생물의 영양원으로 쓰이거나 분해되었기 때문일 것으로 사료된다(data not shown)[36, 37]. 효모 S. cerevisiae B-8을 이용한 오디주 발효에서 본 연구와 유사하게 발효 초기 pH 5.17에서 시작하여 발효 2일부터 4.0을 유지하는 것으로 보고되었다[5]. 60시간 오디를 발효하는 동안 유산균(LP)과 효모(PK)는 24시간까지 세포 수가 증가한 후 각각 8.8(log CFU/ml)과 8.2(log CFU/ml)로 거의 일정한 세포 수를 유지하였다(Fig. 1B). LP의 경우 Lee 등[22]과 Ahn 등[2]이 보고한 것처럼 배양시간에 따라 배지에 축적된 유기산으로 인해 세포생장이 영향을 받아 24시간 배양 이후는 일정한 세포 수를 유지하는 것으로 생각된다.

Fig. 1. Changes in pH (A) and cell growth (B) during mulberry fermentation with L. plantarum JCM 1149 and P. kudriavzevii Atz-En-01. The data represent means ± SD (n = 3). Means with different stars are significantly different at p<0.005(***), p<0.01(**) or p<0.05(*). The symbols: , L. plantarum JCM 1149; , P. kudriavzevii Atz-EN-01.

총 폴리페놀 함량

페놀성 화합물은 식물계에 널리 분포하는 2차 대사산물로서 benzoic acid, phenolic acid, flavonoid, cinnamic acid, stilbene, lignan, proanthocyanidin, anthocyanin 및 tannin 등이 있으며, 항고혈압, 항암, 항 염증, 항 노화, 항산화 등 여러 생리활성을 나타낸다[18, 30]. 오디에는 rutin, caffeic acid, piceid, quercetin, 및 4-prenylmoracin과 같은 여러가지 polyphenol 화합물이 존재하는 것으로 알려져 있다[18, 26].

배양시간 별 오디 발효액의 총 폴리페놀 함량을 측정한 결과를 Fig. 2에 나타내었다. 효모(PK)로 60시간 발효할 경우 대조군인 비발효 오디액의 총 폴리페놀 함량에 비해 1.52 배 증가한 723 μg/ml을 나타내었으며 유산균(LP)으로 발효할 경우 688 μg/ml으로 대조군에 비해 1.47배 증가하였다. Seo 등[35]은 L. casei KCRZ 1121 및 L. plantarum ATCC 10830 유산균을 이용한 꾸지뽕 발효액의 총 폴리페놀 함량이 약 47% 증가하였는데 이는 유산균 발효에 의해 폴리페놀 화합물의 증가와 미생물 대사를 통한 유용 생리활성 물질의 생성에 의한 것이라 보고하였다. Chae 등[6]이 보고한 베리류의 유산균 발효에 의한 플라보노이드 함량은 아로니아 복분자, 블루베리 순으로 증가하였다. 아로니아의 경우 4.31±0.02 TAE mg/ml에서 6.11±0.07 TAE mg/ml, 복분자의 경우 3.53±0.02 TAE mg/ml에서 4.64±0.05 TAE mg/ml, 블루베리의 경우, 1.80±0.03 TAE mg/ml에서 1.95±0.02 TAE mg/ml 로 증가하였으나 오디는 유의적인 증가가 나타나지 않았다. 이는 발효 오디에 사용된 균주와 발효조건, 오디의 재배지역 및 품종 등에 기인하는 것으로 고찰하였다. Jung 등[18]의 보고에 의하면 다시마의 물 추출액은 428.29 μg GAE/ml, 발효액은 615.77 μg GAE/ml로 발효에 의해 1.24 배 증가하는 것으로 나타났다. 이는 여러가지 생리활성이 있는 것으로 알려져 있는 페놀 화합물이 생성되는 것을 의미하며 유산균발효에 의한 유익한 항산화 물질이 생성된 것으로 판단된다. 이와 같은 페놀성 물질의 증가는 발효 중 protease, amylase, lipase등의 작용에 의해 페놀성 물질들로 전환되기 때문으로 보고되었다[32]. 이처럼 유산균과 효모균을 이용한 발효액을 이용한다면 앞에서 조사한 바와 같이 항암, 항 고혈압, 항 노화와 항산화의 기능성 소재로서 활용할 수 있을 것으로 사료된다.

Fig. 2. Changes in total polyphenol contents during mulberry fermentation with L. plantarum JCM 1149 and P. kudriavzevii Atz-En-01. Gallic acid was used as standard. The data represent means ± SD (n = 3). Means with different stars are significantly different at p<0.005 (***), p<0.01(**) or p<0.05(*). The symbols: , L. plantarum JCM 1149; , P. kudriavzevii Atz-EN-01.

총 플라보노이드 함량

총 페놀성 화합물은 다양한 분자량과 구조를 가진 이차대사산물로서 식물계에 널리 분포되어 있는 것으로서 자유 라디칼을 없애거나 산화를 억제하는 등의 생리활성 물질로 잘 알려져 있으며 식품, 의약품, 화장품 등 많은 분야에 활용되고 있다[5]. 본 연구에서는 효모와 젖산균을 이용한 오디 발효액의 총 플라보노이드 함량을 %로 나타내었다. 총 폴리페놀함량은 12시간부터 증가하여 60시간까지 발효하였을 때 젖산균 발효액과 효모 발효액 모두 대조구인 비발효 오디액에 비해 총 플라보노이드 함량은 2배 정도 증가하여 총 폴리페놀 함량의 증가 양상과 유사한 경향을 나타내었다(Fig. 3).

Fig. 3. Changes in total flavonoid contents during mulberry fermentation with L. plantarum JCM 1149 and P. kudriavzevii Atz-En-01. Catechin was used as standard. The data represent means ± SD (n = 3). Means with different stars are significantly different at p<0.005 (***), p<0.01(**) or p<0.05(*). The symbols: , L. plantarum JCM 1149; , P. kudriavzevii Atz-EN-01.

시판 건조 효모인 S. cerevisiae Fermivin과 S. cerevisiae B-8을 각각 이용하여 제조한 오디 발효주 모두 총 플라보노이드 함량이 총 폴리페놀과 같이 감소하는 경향을 보여 본 연구결과와 다르게 나타났다[5]. L. plantarum CGKW3를 이용한 오디 발효의 경우 총 플라보노이드 함량은 발효 전 1.77 g/100 g에서 발효 후에는 5.02 g/100 g으로 약 2.84 배 증가한 것으로 보고되어 본 연구결과와 유사하였다[22]. Jeon 등[17]의 보고에 의하면 2단 발효한 마의 총 플라보노이드 함량이 발효하지 않은 대조군에 비해서 3배 정도 증가하였으며 Aspergillus 속 진균을 이용하여 30℃, 7일 발효한 마의 플라보노이드 함량은 발효하지 않은 마에 비해 3.3배 증가하는 것으로 보고되었다[23].

총 안토시아닌 함량

오디의 기능성을 부여하는데 중요한 역할을 하는 것으로 알려진 안토시아닌의 발효시간 별 함량변화는 Fig. 4와 같다. 비발효 오디액의 총 안토시아닌 함량은 260 mg/dL이었고 유산균 오디 발효액은 380 mg/dL로 46% 증가하였으며 효모 오디 발효액의 경우 340 mg/dL로 31% 증가하였다. Lee 등[22]은 L. plantarum CGKW3를 이용한 발효 오디물의 총 안토시아닌 함량은 비발효 오디보다 18% 증가한 것으로 보고하였다. Chae 등[6]이 보고한 바에 의하면 복분자, 아로니아, 오디, 블루베리 등의 베리류를 유산균으로 발효한 경우 복분자와 아로니아의 안토시아닌 함량은 각각 44%와 51%로 유의적으로 증가하였으나 오디와 블루베리는 유의적인 변화가 없었다. Eom 등[11]은 반응표면분석법을 이용한 L. plantarum DUIJ-1612에 의한 발효 오디조건 최적화 연구에서 발효조건에 따라 총 안토시아닌 함량은 19% - 47% 증가한 것으로 보고하였다. Sung 등[39]의 연구인 오디분말을 첨가한 요구르트의 제조에서 음성 대조군에서는 안토시아닌이 검출되지 않았으며 오디분말을 첨가한 시험구에서는 발효시간이 경과될수록 안토시아닌 함량은 감소하였다. 이는 저장 중 호흡 및 노화 과정이 진행되면서 pH변화 등 색소의 안정성에 영향을 주는 요인들에 따라 안토시아닌이 점차 소실됨을 보였는데 이는 본 연구결과와 상이한 결과를 보였다. 이는 안토시아닌 색소의 발현 메카니즘은 복잡하여 유전적 요소뿐만 아니라 여러 가지 환경조건에 의해서도 크게 좌우된다고 보고한 바와 일치한다. 오디의 안토시아닌 색소는 높은 항 산화력으로 시력 개선 및 만성퇴행성질환 등에 효능을 지닌 생리 활성 물질로 주목을 받고 있다[26].

Fig. 4. Total anthocyanin contents during mulberry fermentation with L. plantarum JCM 1149 and P. kudriavzevii Atz-En-01. Means with different stars are significantly different at p<0.005(***), p<0.01(**) or p<0.05(*). The symbols: , L. plantarum JCM 1149; , P. kudriavzevii Atz-EN-01.

DPPH 라디칼 소거활성

DPPH는 화학적으로 안정화된 free radical을 가지고 있는 물질로서 515 ~ 525 nm에서 최대 흡광도를 가지는 보라색의 화합물로 ascorbic acid, BHA, 토코페롤, 방향족 아민류 등에 의해 환원되어 짙은 보라색으로 나타내어 항산화 물질의 전자공여능을 측정할 때 사용된다[33].

오디의 유산균 및 효모 발효에 의한 항산화 활성변화를 나타낸 결과는 Fig. 5와 같다. 60시간 발효 후 DPPH radical 소거활성은 유산균(LP)의 경우 86%에서 100%로, 그리고 효모(KP)의 경우 86%에서 93%로 증가하였다. L. plantarum CGKW3 을 이용한 250 μg/ml ~ 2,500 μg/ml 오디용액을 발효한 경우 DPPH radical 소거활성은 비발효 오디용액의 13.54% ~ 47.88%에서 17.4% ~ 58.2%로 농도 의존적으로 증가하였다[22]. Jung 등[18]이 보고한 결과에 따르면 다시마 물 추출액과 발효액 10% 농도에서 DPPH 라디칼 소거활성은 각각 89.89%와 96.94%로 발효액의 소거능이 유의적으로 높게 나타났다. Chae 등[5]이 보고한 오디 발효주의 항산화 활성분석에서 비발효 오디 착즙액의 DPPH 라디칼 소거활성에 대한 IC₅₀ 값은 114.60±3.19 μl/ml, 시판 효모인 S. cerevisiae Fermivin과 분리주 S. cerevisiae B-8로 발효한 경우 70.86±0.79 μl/ml와 73.62±0.37 μl/ml로 나타나 오디주의 항산화 활성이 오디 착즙액보다 1.5배 높았다. 한편 다양한 유산균으로 발효한 대마씨 추출물 1 mg/ml 농도에서 DPPH의 라디칼 소거활성은 같은 농도의 비발효 대마씨 추출물에 비해 현저히 증가하였으며 특히 L. plantarum KCTC 3108 유산균으로 발효한 추출물의 경우 약 4배 높은 소거활성을 보였다[43]. 발효 강황을 농도별로 첨가한 선식의 항산화 활성 연구에서 발효 강황을 0.8%이상 첨가할 경우 대조군에 비해 DPPH 라디칼 소거활성이 유의적으로 증가하는 것으로 보고되었는데 이는 발효강황의 성분에서 기인하는 것으로 보인다[41]. Jeon 등[16]은 비발효 마추출물의 DPPH 라디칼 소거활성은 66.4%였으나 Monascus sp. MK2를 이용한 1단 발효 마추출물, 그리고 Monascus sp. MK2와 L. brevis HLJ59 균주로 2단 발효한 마추출물의 DPPH 라디칼 소거활성은 각각 74.7%와 81.7%로 증가하였다고 보고하였는데 이는 폴리페놀의 함량과 관련이 있을 것으로 사료된다.

Fig. 5. Changes in DPPH radical scavenging activity during mulberry fermentation with L. plantarum JCM 1149 and P. kudriavzevii Atz-En-01. The data represent means ± SD (n = 3). Means with different stars are significantly different at p<0.005(***), p<0.01(**) or p<0.05(*). The symbols: , L. plantarum JCM 1149; , P. kudriavzevii Atz-EN-01.

In vitro pancreatic lipase 저해활성

식이로 섭취한 지방의 대사에 중요한 효소이며 췌장에서 분비되는 lipase는 중성지방을 두 분자의 지방산과 2-monoacylglycerol로 가수분해하는 반응을 촉매하는 효소이다. 따라서 이 효소의 저해제를 탐색하면 지방의 흡수를 감소시킴으로써 항비만 활성을 나타낼 것으로 기대된다[7, 30]. 본 연구에서는 Park 등[30]의 방법을 변형하여 오디 발효액의 pancreatic lipase에 대한 저해활성을 조사하였으며 그 결과는 Fig. 6과 같다. 유산균(LP)을 이용한 오디 발효액은 발효시간에 따라 계속 증가하여 60시간 발효 후 대조구인 비발효 오디액보다 62.9% 더 높은 lipase 저해 활성을 나타내었으며 효모(PK)로 발효한 경우 같은 발효시간의 시료에 대해 유산균보다 상대적으로 저해활성이 낮았으며 대조구보다 52.5% 더 높은 저해율을 나타내었다. 이상과 같이 유산균(LP)과 효모(PK)를 이용한 오디 발효액이 pancreatic lipase에 대해 비교적 높은 저해활성을 나타내어 항비만 효과가 있을 것으로 사료된다.

Fig. 6. Changes in lipase inhibitory activity during mulberry fermentation with L. plantarum JCM 1149 and P. kudriavzevii Atz-En-01. The data represent means ± SD (n = 3). Means with different stars are significantly different at p<0.005(***), p<0.01(**) or p<0.05(*). The symbols: , L. plantarum JCM 1149; , P. kudriavzevii Atz-EN-01.

3T3-L1 지방전구세포의 분화억제효과

Oil-red-O 염색법을 이용하여 오디 발효액의 3T3-L1 지방전구세포가 지방세포로 분화되는 과정에 대한 억제활성 정도를 측정한 결과를 Fig. 7A에 나타내었다. 비발효 오디 농축액과 유산균(LP) 및 효모(PK) 발효 오디 농축액을 200, 400 및 800 μg/ml 농도로 처리한 대조구와 실험구에서 세포독성은 거의 관찰되지 않았으나 (data not shown) 400 μg/ml 및 800 μg/ml 농도로 처리한 실험군의 염색정도가 분화유도 조건인 양성 대조구에 비해 낮았으며 유산균(LP)이 효모(PK)에 비해 상대적으로 염색이 덜 되었다. 비발효 오디 농축액을 처리한 실험 대조구와 발효 오디 농축액을 같은 농도로 처리한 실험구의 염색정도를 비교하면 800 μg/ml의 농도에서 실험 대조구에 비해 염색이 감소하여 지방전구세포의 분화가 억제된 것을 확인하였다. 또한 육안으로 확인된 염색된 지방구를 구획 별로 계산하여 한 현미경 상의 지방구를 수치화한 후 통계 처리하여 도식화하여 비교한 결과 800 μg/ml의 농도에서 지방구의 분화가 가장 낮았으며 비발효 오디 농축액을 처리한 실험 대조구와 비교할 때 지방구의 분화가 유의적으로 감소하였다(Fig. 7B). 유산균으로 발효한 흑무[21], 백두구 추출물[30], 참취 추출물[7] 및 PineXol[27] 등도 지방전구세포의 분화를 농도 의존적으로 억제하여 지방의 축적을 감소시키는 것으로 보고되었다.

Fig. 7. Inhibitory effect of fermented mulberry on the lipid accumulation during adipogenesis of 3T3- L1 pre-adipocyte. 3T3-L1 cells were treated with unfermented mulberry (control) and fermented mulberry concentrate (200, 400, 800 μg/ml) for 3 days twice in differentiation media and then once in induction media. Intracellular lipids were stained with Oil-Red-O (A). Stained cells (lipid droplets) observed through microscope were counted and followed by statistical analysis. Data expressed as percentage to positive control are the means ± SD of triplicate experiments. Bars with different stars are significantly different at p<0.005(***), p<0.01(**) or p<0.05(*) (B).

이상의 결과로부터 800 μg/ml 농도의 유산균(LP) 오디 발효농축액을 사용한다면 지방세포 분화를 억제하여 세포 내 지방 수준을 낮추어 비만으로 진행되는 정도를 완화할 수 있을 것으로 기대된다.

동물실험을 이용한 항비만 효과 검증

유산균 분리주 L. palntarum JCM 1149 (LP)와 효모 분리주 Pichia kudriavzenii Atz-EN-01 (PK)로 발효한 오디 농축액의 in vivo 항비만 효과를 확인하기 위해 SD rat을 이용한 6주간 동물실험 결과 중 대표적인 지표를 Table 1에 정리하였다. 체중은 고지방 식이군에 비해 비발효 오디 농축액을 투여한 대조군과 발효 오디 농축액을 투여한 실험군에서 전반적으로 낮게 나타났다. 6주후 체중 증가율은 고지방 식이군 56.8%, 비발효 오디 농축액 대조군 54.0%, LP 발효 오디 농축액 실험군 49.1% 그리고 KP 발효 오디 농축액 실험군 54.1%로 나타났다. LP 발효 오디 농축액 실험군은 고지방 식이군에 비해 5.4% 그리고 대조군에 비해 3.4% 감소하였으나 KP 발효 오디 농축액 실험군과 대조군은 차이가 없었다. 6주 동안 섭취한 사료의 양을 보면 고지방 식이군 1,316 g, 비발효 오디 농축액 대조군 1,159 g, LP 발효 오디 농축액 실험군이 가장 적은 916 g 그리고 KP 발효 오디 농축액 실험군은 가장 많은 1,549 g으로 나타났다. LP 발효 오디 실험군의 체중이 가장 적은 것은 섭취한 사료의 양에도 영향을 받은 것으로 추측된다. 6주후 혈청 중성지방 함량의 경우 고지방 식이군은 9.5% 증가하였으나 대조군은 17.1%, LP 발효 오디 농축액 실험군은 37.1%, 그리고 PK 발효 오디 농축액 실험군은 41.6% 감소한 것으로 나타났다. 비발효 오디 농축액 자체도 중성지방 함량 저하효과가 있었으나 오디의 발효과정을 통해 중성지방 함량 감소효과가 더 높아진 것을 확인할 수 있었다. 6주후 LP 발효 오디 농축액 실험군과 PK 발효 오디 농축액 실험군의 중성지방 함량은 고지방 식이군과 대조군에 비해 각각 43.1%와 21.4% 그리고 48.6%와 28.9%씩 감소하였다. 6주 후 혈청 콜레스테롤 함량 변화를 비교한 결과 예외적으로 비발효 오디 농축액 대조군의 혈중 콜레스테롤 함량이 가장 높게 나타나 고지방 식이군보다 오히려 24.1% 증가하였다. 한편 LP 발효 오디 농축액 실험군과 PK 발효 오디 농축액 실험군은 대조군에 비해 각각 37.4% 및 53.46% 감소하였다. 간 무게의 경우 대조군과 발효 오디 농축액을 투여한 실험군 간에 미미한 차이가 있었으나 고지방 식이군과 비교하면 대조군은 6.8%, LP 발효 오디 농축액 실험군은 9.4% 그리고 PK 발효 오디 농축액 실험군은 10.7% 감소하였다. 이것은 대조군과 실험군(LP, PK)에서는 고지방 식이군에 비해 간 조직에 중성지방의 축적이 감소된 결과로 사료되며 혈청 중성지방 함량을 분석한 결과와 유사한 경향을 나타내었다. 7종의 Aspergillus 속 곰팡이로 발효한 비지와 비발효 비지의 혈청 지질함량을 비교 분석한 Lee 등[25]의 보고에 의하면 발효한 비지는 비발효 비지 대조군에 비해 중성지방 함량은 7.2% ~ 10.4%, 총 콜레스테롤 함량은 3.9% ~ 12.4% 그리고 LDL-콜레스테롤 함량은 24.6% ~ 50.7% 각각 감소하였으나 HDL-콜레스테롤 함량은 44.1% ~ 67.6% 증가하여 발효한 비지의 혈중 지질개선 효과가 증가되었다. Kim 등[20]은 streptozotocin으로 유발된 당뇨쥐에서 가공형태가 다른 오디시료의 혈청 지질함량에 대한 영향을 조사한 연구에 따르면 총 콜레스테롤 함량은 5% 오디 침출주를 첨가한 실험군에서 유의적으로 감소하였고 중성지방 함량은 경우 5% 오디 침출주와 1% 오디 식초를 첨가한 실험군에서 유의하게 낮아졌으나 1% 오디분말을 첨가한 실험군에서는 지질개선 효과가 나타나지 않았다. L. plantarum으로 발효한 홍고추의 경우 2.5% 첨가한 실험군은 비발효 홍고추 대조군에 비해 혈청 중성지방 함량을 25.7% 감소시키고 1.25% 첨가하면 총 콜레스테롤 함량은 23.1% 낮추는 것으로 보고되었다[21].

Table 1. Effect of fermented mulberry on changes in body weight, triglyceride, cholesterol, FER and liver weight

The data represent means ± SD (n = 8). Mean values with different letters in the same column indicate significant difference (P<0.05) by Duncan’s multiple range test.

1. Food efficiency ratio (FER) was calculated by FER = {(body weight gain (g)/food intake (g)} ×100.

감사의 글

본 연구는 산자부 지역주력산업육성기술개발사업(No.A011900523/R0004403)의 연구비 지원에 의해 수행되었으며 이에 감사드립니다.

The Conflict of Interest Statement

The authors declare that they have no conflicts of interest with the contents of this article.