Korean Journal of Fisheries and Aquatic Sciences (한국수산과학회지)

The Korean Society of Fisheries and Aquatic Science (한국수산과학회)
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Effects of Dietary Prebiotic, Probiotics and Synbiotic on Growth, Nonspecific Immunity, Antioxidant Capacity, Intestinal Microbiota and Antiinflammatory Activity of Hybrid Grouper (Epinephelus akaara ♀×Epinephelus lanceolatus ♂)

사료 내 Prebiotic, Probiotics와 Synbiotic의 첨가가 대왕붉바리(Epinephelus akaara ♀×Epinephelus lanceolatus ♂)의 성장, 비특이적 면역력, 항산화능, 장내 미생물 조성과 항염증에 미치는 영향

  • Wonhoon Kim (Department of Marine Life Sciences, Jeju National University) ;
  • Jongho Lim (Department of Marine Life Sciences, Jeju National University) ;
  • Minjoo Kang (Korea Institute of Ocean Science and Technology) ;
  • Choong Hwan Noh (Korea Institute of Ocean Science and Technology) ;
  • Kyeong-Jun Lee (Marine Science Institute, Jeju National University)
  • 김원훈 (제주대학교 해양생명과학과) ;
  • 임종호 (제주대학교 해양생명과학과) ;
  • 강민주 (한국해양과학기술원) ;
  • 노충환 (한국해양과학기술원) ;
  • 이경준 (제주대학교 해양과학연구소)
  • Received : 2023.09.15
  • Accepted : 2023.11.20
  • Published : 2023.12.31
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Abstract

The effects of dietary mannan oligosaccharides, Lactobacillus plantarum, Bacillus subtilis, and Bacillus licheniformis supplementation on hybrid grouper Epinephelus akaara ♀×Epinephelus lanceolatus ♂ were evaluated. The fish were fed a basal diet and five other diets consisting of 0.6% mannan oligosaccharides, L. plantarum, B. subtilis, and B. licheniformis and mixture of each 0.15% prebiotic and all the probiotics (designated as MOS, LP, BS, BL, and SYN) for 56 days. Growth performance and feed utilization showed no significant differences among all experimental groups. Lipid level of whole-body was significantly high in MOS and BL groups. Plasma aspartate aminotransferase was significantly low in BL and SYN groups. Nitro-blue tetrazolium, lysozyme and anti-protease, and glutathione peroxidase in BS, SYN, and all probiotic groups, respectively, were significantly high. Intestinal Vibrio bacteria was significantly low in all probiotic and SYN groups. Gene expression of interleukin-1β and interleukin-10 in SYN group; transforming growth factor β2 in MOS and BS groups, toll-like receptor 2-2 in BS and BL groups; and C-type lectin in MOS, LP and SYN groups were significantly upregulated. Our findings indicate that mannan oligosaccharides, L. plantarum, B. subtilis, and B. licheniformis could improve innate immunity, antioxidant capacity, anti-inflammation, and intestinal microbiota of hybrid grouper.

Keywords

서론

붉바리(Epinephelus akaara)는 중국, 일본을 비롯한 동남아시아 시장의 대표적인 고급 양식어종으로, 수요가 높지만 성장이 느려 최소 출하 크기인 0.6 kg까지 약 3년이 소요된다(Kang et al., 2020). 대왕바리(Epinephelus lanceolatus)는 부화 후 1년에 3 kg, 4년에 20 kg, 최대 400 kg까지 빠르게 성장하는 대형 어종으로, 이를 이용해 근연종과 교잡하여 성장이 빠른 교잡 바리(hybrid grouper) 생산과 관련된 연구들이 활발히 진행 중이다(Kang et al., 2020; Zhu et al., 2023). 대왕붉바리(E. akaara ♀×E. lanceolatus ♂)는 붉바리와 대왕바리의 교잡종으로 붉바리의 저조한 성장 문제를 해결하기 위해 개발되었으며, 24개월이면 최소 출하 크기에 도달할 수 있다고 보고되었다(Kang et al., 2020).

장내 미생물은 어류의 장내 점막층에 존재하는 미생물로, 숙주의 영양소 소화율, 면역력, 항산화능과 질병 저항성에 영향을 미치는 것으로 알려져 있다(Yukgehnaish et al., 2020). 최근 양식 산업에서 성장과 면역에 관여할 수 있는 어류 장내 미생물의 중요성이 크게 주목받고 있으며, 장내 미생물 조성을 개선할 수 있는 prebiotics와 probiotics 제품들이 활발하게 연구 개발되고 있다(Dawood et al., 2018). Prebiotics는 숙주 생물이 소화할 수 없으나 장내 probiotics의 먹이가 되어 장내 미생물군을 개선하고 건강에 유익한 영향을 미치는 섬유질을 말한다(Davani-Davari et al., 2019). Probiotics는 장내 pH 감소, 병원균 군집 제거와 침입 방지, 면역반응 조절을 통해 체내에 유익한 영향을 미치는 살아있는 미생물로 알려져 있다(Williams, 2010). Prebiotics와 probiotics를 혼합 첨가하여 상호 보완적인 효과를 내는 synbiotics는 양어사료 내 prebiotics나 probiotics의 단독 첨가에 비해 장내 유익균 증가와 병원균 감소, 면역력 증가 효과가 뛰어나 첨가제로 이용하기 위한 연구가 활발히 진행되고 있다(Cerezuela et al., 2011). 효모 Saccharomyces cerevisiae의 세포벽에서 추출된 prebiotics인 mannan oligosaccharides를 hybrid grouper E. lanceolatus ♂×E. fuscoguttatus ♀ 사료 내 첨가할 경우, 항산화능과 비특이적 면역력을 강화하고 Vibrio harveyi에 대한 질병 저항성을 증가시켜 생존율을 높일 수 있다고 보고되었다(Ren et al., 2020; Zhu et al., 2023). 양어사료 내 Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis와 Lactobacillus plantarum을 포함한 다양한 probiotics를 첨가할 경우, 감성돔(Acanthopagrus schlegelii, Sagada et al., 2021), Nile tilapia Oreochromis niloticus (Han et al., 2015)와 orange spotted grouper Epinephelus coioides (Son et al., 2009; Liu et al., 2012)의 성장과 비특이적 면역력을 증가시킨다고 보고되었다. 그러나 현재까지 대왕붉바리 사료에 mannan oligosaccharides, B. subtilis, B. licheniformis와 L. plantarum의 단독 혹은 혼합 첨가에 따른 효과를 평가한 연구는 전무한 실정이다.

Prebiotics나 probiotics의 첨가가 어류에 미치는 영향은 어종에 따라 다르기 때문에, 각 어종에 따라 사료 내 첨가 효과를 평가해야 할 필요가 있다(Hai, 2015; Yukgehnaish et al., 2020). 따라서 본 연구는 대왕붉바리 사료 내 mannan oligosaccharides, L. plantarum, B. subtilis와 B. licheniformis의 단독 혹은 혼합 첨가가 성장, 비특이적 면역력, 항산화능, 장내 미생물군 조성과 항염증 반응에 미치는 영향을 조사하고자 수행하였다.

재료 및 방법

실험사료

사육실험에는 분말 형태의 mannan oligosaccharides (Alltech, Lexington, KY, USA), L. plantarum (FNCbio Co. Ltd., Daejeon, Korea), B. subtilis (FNCbio Co)와 B. licheniformis (Woogene B&G Co. Ltd., Seoul, Korea)를 사용하였고, 첨가한 probiotics의 균 농도는 1.0×1010 CFU (colony forming unit)/g으로 동일하였다. 대조사료(CON)는 어분(sardine meal)과 대두박을 주 단백질원으로 사용하였고, 조단백질과 조지질의 함량은 각각 58.8%와 12.0%로 조성하였다(Table 1). Prebiotic 첨가구는 mannan oligosaccharides를 0.6% 첨가하였으며(MOS), probiotics 첨가구는 L. plantarum, B. subtilis와 B. licheniformis를 각각 0.6%씩 첨가하였다(LP, BS, BL). Synbiotic 실험구는 mannan oligosaccharides와 3가지 probiotics를 각각 0.15%씩 총 0.6% 첨가하였다(SYN). 실험사료에 첨가된 mannan oligosaccharides와 probiotics는 CON의 starch를 대체하여 첨가하였다. 실험사료는 원료를 혼합한 후, 어유와 증류수(원료 총 중량의 13%)를 첨가하여 펠렛 성형기(SP-50; Kumkang ENG, Daegu, Korea)를 이용해 직경 7 mm 크기로 제작하였다. 실험사료는 건조(25°C, 8 h) 후 냉장(4°C) 보관하였다.

Table 1. Dietary formulation and proximate composition of the experimental diets for hybrid grouper Epinephelus akaara ♀×Epinephelus lanceolatus ♂ (% of dry matter)

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1 Orizon S.A., Las Condes, Chile. 2 E-wha Oil Co. Ltd., Busan, Korea. 3 Alltech, Kentucky, USA. 4 FNCbio Co. Ltd., Daejeon, Korea. 5 Woogene B&G Co. Ltd., Hwaseong, Korea. 6 Mineral premix (g/ kg of mixture): MgSO4·7H20, 80.0; NaH2 PO4·2H2O, 370.0; KCL, 130.0; Ferric citrate, 40.0; ZnSO4·7H20, 20.0; Ca-lactate, 356.5; CuCl2, 0.2; AlCl3·6H2O, 0.15; Na2SeO3, 0.01; MnSO4.H2O, 2.0; CoCl2·6H2O, 1.0; Starch, 0.14. 7 Vitamin premix (g/kg of mixture): DL-α tocopherol acetate, 20.0; thiamin hydrochloride, 4.0; riboflavin, 4.4; pyridoxine hydrochloride, 4.0; niacin, 30.0; D-pantothenic acid hemicalcium salt, 14.5; myo-inositol, 40.0; D-biotin, 0.2; folic acid, 0.48; menadione, 0.2; retinyl acetate, 1.0; cholecalciferol, 0.05; cyanocobalamin, 0.01; Starch, 881.16. 8 AlphaAqua Co., Busan, Korea. CON, Control; MOS, Mannan oligosaccharides; LP, Lactobacillus plantarum; BS, Bacillus subtilis; BL, Bacillus licheniformis; SYN, Synbiotic, mixture of each 0.15% mannan oligosaccharides, L. plantarum, B. subtilis and B. licheniformis.

실험어와 사육관리

사육실험에 사용된 대왕붉바리는 전라남도 무안군에 위치한 양식장에서 구입하여 제주대학교 해양과학연구소로 이송 후, 실험 환경 적응을 위해 1.2톤 수조에서 2주 동안 순치하였다. 총 234마리의 실험어(초기 평균 무게, 183.95±4.43 g)를 원형 polypropylene 수조(300 L)에 수조당 13마리씩, 실험구당 3반복으로 18개 수조에 배치하였다. 사육실험은 총 8주간 진행하였으며 실험기간 동안 사료는 1일 2회(08:30, 18:30 h)에 걸쳐 만복 공급하였다. 모든 실험수조의 사육수는 자연 해수를 모래 여과하여 수조에 3 L/min으로 동일하게 공급하였으며, 용존산소량을 유지하기 위해 공기 발생기(aeration)를 설치하였다. 각 수조의 용존산소량과 수온은 Pro20 Dissolved Oxygen Instrument (6050020; YSI, Yellow Springs, OH, USA)를 사용하여 1일 1회 측정하였다. 실험기간 동안 모든 실험수조의 용존산소량과 수온은 각각 8.24–9.05 mg/L와 24.4±2.3°C로 유지하였다. 실험기간 동안 광주기는 12 light: 12 dark를 유지하였다.

Sampling과 분석

실험어를 24 h 절식한 후 최종무게(final body weight, FBW)를 측정하였다. 무게 측정 후 일간성장률(specific growth rate, SGR)과 생존율(survival)을 조사하였으며, 사료섭취량(feed intake, FI)을 사용하여 사료계수(feed conversion ratio, FCR)와 단백질 이용효율(protein efficiency ratio, PER)을 계산하였다. FBW 측정 후 모든 실험 수조에서 수조당 3마리의 실험어를 무작위로 선별하였다. 선별한 실험어는 100 mg/L 농도의 MS-222 (M10521; Sigma, St. Louis, MO, USA) 수용액을 사용하여 마취하였으며, 미부정맥에서 채혈한 후 해부하여 간을 sampling 하였다. 채혈한 혈액은 혈청(serum)과 혈장(plasma)으로 분리하였으며, plasma는 heparin (H6279; Sigma) 처리 후 nitro-blue tetrazolium (NBT), hemoglobin (Hb)과 hematocrit (Ht) 분석에 사용하였다. 분석 후 남은 plasma는 원심분리(5,000 g, 5 min, 4°C)하여 상층액을 분리하였다. Serum은 원심분리(5,000 g, 5 min, 4°C) 후 상층액을 분리하여 면역분석에 사용하였다. 간 sample은 액체질소를 이용하여 급속 냉동 후 serum, plasma와 함께 분석 전까지 초저온 냉동고(-80°C)에서 냉동 보관하였다. 전어체(whole-body)는 일반성분 분석을 위해 냉동(-24°C) 보관하였다.

Ht은 모세관 내 plasma를 원심분리기(Hematospin II; Hanil Science Co, Daejeon, Korea)를 사용하여 원심분리(12,000 g, 15 min, 4°C) 후 측정하였다. 자동생화학분석기(CH 100plus; RADIM Company, Firenze, Italy)를 이용하여 Hb, aspartate aminotransferase (AST), alanine aminotransferase (ALT), cholesterol (Chol)과 triglyceride (TG) 농도를 측정하였다. NBT와 myeloperoxidase (MPO) 활성은 Kumari and Sahoo (2005)의 방법으로 분석하였다. Lysozyme 활성, anti-protease 활성과 immunoglobulin (Ig) 함량은 각각 Mohammed et al. (2018)과 Ellis (1990), Siwicki and Anderson (1993)의 방법에 따라 분석하였다. 항산화능 분석인 glutathione peroxidase (GPx) 활성과 superoxide dismutase (SOD) 활성은 GPx assay kit (703102; Cayman Chemical, Ann Arbor, MI, USA)와 SOD assay kit (19160; Sigma)를 사용하여 분석하였다. 실험사료와 전어체의 일반성분 조성 중 수분, 회분, 조단백질 함량은 AOAC (2005)의 방법을, 조지질의 함량은 Folch et al. (1957)의 방법에 따라 분석을 진행하였다.

장내 미생물 조성은 Silva et al. (2013)과 Safari et al. (2022)의 방법에 따라 분석하였다. 수조당 3마리의 실험어를 무작위로 선별하여 무게 측정 후, 얼음물에서 5분간 마취를 진행하여 마취된 실험어의 장을 sampling 하였다. 장 sample은 2 mL의 sodium chloride (0.9%) 용액에 넣고 1 min간 균질한 후, 원심분리(5,000 g, 5 min, 4°C)하여 상층액을 분리하였다. 상층액은 농도에 따라 희석하였으며, 실험어당 3반복으로 marine agar (2124239; BD DifcoTM, Dickinson, ND, USA), lactobacilli MRS agar (2047688; BD DifcoTM)와 thiosulfate citrate bile salt sucrose (TCBS) agar (1173733; BD DifcoTM)에 100 µL씩 도말하였다. Marine agar, lactobacilli MRS agar, TCBS agar를 사용하여 각각 total heterotrophic bacteria (THB), total lactic acid bacteria (TLB), total Vibrio bacteria (TVB)를 관찰하였으며, incubator (27°C)에서 최소 48 h에서 최대 72 h까지 배양하였다. 각 lactobacilli MRS agar와 TCBS agar는 colony의 형태를 확인하여 LAB와 Vibrio를 구분하였고, colony의 개수가 30–300개가 관찰되는 agar를 선별하여 CFU를 측정하였다. 대왕붉바리의 간 sample을 TRIzol (T9424; Sigma)에 넣고 균질하여 RNA를추출하였다. 추출한 RNA 농도는µDropTMPlate (N12391; Thermo Scientific, Waltham, MA, USA)로 측정하였고, 모든 OD260/OD280의 RNA 순도가 1.8–2.0임을 확인하였다. PrimeScriptTM first-strand cDNA synthesis kit (6110A; Takara, Shiga, Japan)를 사용하여 cDNA를 합성하였고, nuclease free water에 100배로 희석하여 분석 전까지 초저온 냉동고(-80°C)에 냉동 보관하였다. qPCR 분석에는 Thermal Cycle Dice Real Time System III (TP 950; Takara) 기기를 이용하였다. Reference gene으로는 β-actin을, target gene으로는 interleukin 1β (IL-1β), interleukin 10 (IL-10), transforming growth factor β2 (TGF- β2), toll-like receptor 2-2 (TLR 2-2)와 C type lectin을 사용하여 분석을 진행하였다. PCR 반응은 95°C에서 30 s (initial denaturation) 후 95°C에서 15 s (denaturation), 50°C에서 30 s (annealing), 72°C에서 45 s (extension) cycle을 총 45회 진행하였다. 분석에 사용한 유전자의 primer sequences는 Table 2에 나타내었다.

Table 2. Primer sequences of target genes used in real-time quantitative PCR of hybrid grouper Epinephelus akaara ♀×Epinephelus lanceolatus ♂

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IL-1β, interleukin 1β; IL-10, interleukin 10; TGF- β2, transforming growth factor β2; TLR 2-2, toll-like receptor 2-2.

통계학적 분석

실험은 완전확률계획법(completely randomized design)에 따라 실험구를 배치하였다. 모든 데이터들은 SPSS (Version 24.0; International Business Machines Co., NY, USA) 프로그램을 이용하여 One-way ANOVA로 통계 분석하였고, 백분율 데이터는 통계 분석 전에 arcsine값으로 변형하여 분석하였다. 분석 후 결과의 유의차는 Duncan’s multiple range test (P<0.05)로 사후검정을 하여 결과 값의 유의차를 비교하였고, 모든 데이터는 평균값±표준편차(mean±standard deviation)로 나타내었다.

결과

성장과 사료 이용

8주간의 사육실험 후 성장 지표(FBW, SGR), 사료 이용 지표(FCR, PER)와 survival은 모든 실험구 사이에서 유의한 차이가 없었다(P>0.05) (Table 3). FI는 MOS 그룹과 BS 그룹에 비해 SYN 그룹에서 유의적으로 높았다(P<0.05). 전어체 일반성분 분석 결과, MOS 그룹에서 CON 그룹에 비해 지질 함량이 유의적으로 높게 나타났다(P<0.05) (Table 4).

Table 3. Growth performance, feed utilization and survival of hybrid grouper Epinephelus akaara ♀×Epinephelus lanceolatus ♂ (initial body weight: 183.95±4.43 g) fed the experimental diets for 8 weeks

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1 Final body weight (g). 2 Specific growth rate (%/day)={loge [final mean body weight (g)]-loge [initial mean body weight (g)]}/days×100. 3 Feed conversion ratio=dry feed intake (g)/wet weight gain (g). 4 Protein efficiency ratio=wet weight gain (g)/total protein intake (g). 5 Feed intake (g/fish)=feed consumption (g)/number of fish. CON, Control; MOS, Mannan oligosaccharides; LP, Lactobacillus plantarum; BS, Bacillus subtilis; BL, Bacillus licheniformis; SYN, Synbiotic, mixture of each 0.15% mannan oligosaccharides, L. plantarum, B. subtilis and B. licheniformis. Values are mean of triplicates and presented as mean±S.D. Values with different superscripts in the same column are significantly different (P<0.05). The lack of superscript letter indicates no significant differences among treatments.

Table 4. Whole body proximate composition of hybrid grouper Epinephelus akaara ♀×Epinephelus lanceolatus ♂ fed the experimental diets for 8 weeks (%, wet basis)

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CON, Control; MOS, Mannan oligosaccharides; LP, Lactobacillus plantarum; BS, Bacillus subtilis; BL, Bacillus licheniformis; SYN, Synbiotic, mixture of each 0.15% mannan oligosaccharides, L. plantarum, B. subtilis and B. licheniformis. Values are mean of triplicates and presented as mean±S.D. Values with different superscripts in the same column are significantly different (P<0.05). The lack of superscript letter indicates no significant differences among treatments.

비특이적 면역력과 항산화능

혈액의 MPO, SOD 활성과 Ig 농도는 모든 실험구 사이에 유의한 차이를 보이지 않았다(P>0.05) (Table 5). NBT 활성은 BS 그룹이 CON 그룹, LP 그룹, BL 그룹과 SYN 그룹에 비해 유의적으로 높은 결과를 보였다(P<0.05). Lysozyme 활성은 CON 그룹에 비해 BS 그룹과 SYN 그룹에서 유의하게 높았다(P<0.05). Anti-protease 활성은 BL 그룹, SYN 그룹이 CON 그룹, MOS 그룹, BS 그룹에 비해 유의적으로 높게 나타났다(P<0.05). GPx 활성은 LP 그룹, BS 그룹, BL 그룹이 CON 그룹, MOS 그룹, SYN 그룹에 비해 유의하게 높았다(P<0.05).

Table 5. Non-specific immune responses and antioxidant capacity of hybrid grouper Epinephelus akaara ♀×Epinephelus lanceolatus ♂ fed the experimental diets for 8 weeks

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1 Nitro-blue tetrazolium activity (absorbance). 2 Lysozyme activity (µg/mL). 3 Myeloperoxidase activity (µg/mL). 4 Immunoglobulin level (mg/mL). 5 Anti-protease activity (% inhibition). 6 Glutathione peroxidase activity (mU/mL). 7 Superoxide dismutase activity (% inhibition). CON, Control; MOS, Mannan oligosaccharides; LP, Lactobacillus plantarum; BS, Bacillus subtilis; BL, Bacillus licheniformis; SYN, Synbiotic: mixture of each 0.15% mannan oligosaccharides, L. plantarum, B. subtilis and B. licheniformis. Values are mean of triplicate groups and presented as mean±S.D. Values with different superscripts in the same column are significantly different (P<0.05). The lack of superscript letter indicates no significant differences among treatments.

혈액학적 지표

Hb, Chol, TG와 ALT는 모든 실험구 사이에 유의한 차이가 없었다(P>0.05) (Table 6). Ht은 BS 그룹, SYN 그룹이 BL 그룹에 비해 유의적으로 높게 나타났다(P<0.05). AST는 BL 그룹, SYN 그룹이 CON 그룹에 비해 유의하게 낮았다(P<0.05).

Table 6. Hematological parameters of hybrid grouper Epinephelus akaara ♀×Epinephelus lanceolatus ♂ fed the experimental diets for 8 weeks

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1 Hemoglobin (g/dL). 2 Hematocrit (%). 3 Aspartate aminotransferase (U/L). 4 Alanine aminotransferase (U/L). 5 Cholesterol (mg/dL). 6 Triglyceride (mg/dL). CON, Control; MOS, Mannan oligosaccharides; LP, Lactobacillus plantarum; BS, Bacillus subtilis; BL, Bacillus licheniformis; SYN, Synbiotic, mixture of each 0.15% mannan oligosaccharides, L. plantarum, B. subtilis and B. licheniformis. Values are mean of triplicate groups and presented as mean±S.D. Values with different superscripts in the same column are significantly different (P<0.05). The lack of superscript letter indicates no significant differences among treatments.

장내 미생물 조성

대왕붉바리의 장내 TLB/THB 비율은 모든 실험구 사이에 유의한 차이가 없었다(P>0.05) (Fig. 1). TVB/THB 비율은 MOS 그룹을 제외한 모든 실험구에서 CON 그룹에 비해 유의하게 낮았다(P<0.05).

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Fig. 1. Intestinal microbiota ratio of total lactic acid bacteria (TLB) and total Vibrio bacteria (TVB) to total heterotrophic bacteria (THB) of hybrid grouper Epinephelus akaara ♀×E. lanceolatus ♂ fed the experimental diets for 8 weeks. CON, Control; MOS, Mannan oligosaccharides; LP, Lactobacillus plantarum; BS, Bacillus subtilis; BL, Bacillus licheniformis; SYN, Synbiotic, mixture of each 0.15% mannan oligosaccharides, L. plantarum, B. subtilis and B. licheniformis. Values are mean of triplicates and bars with different letters are significantly different (P<0.05).

항염증 유전자 발현

간 내 IL-1β와 IL-10의 유전자 발현은 SYN 그룹에서 CON 그룹에 비해 유의적으로 높은 결과를 보였다(P<0.05) (Fig. 2). TGF-β2의 발현은 MOS 그룹과 BS그룹에서 CON 그룹에 비해 유의하게 높았다(P<0.05). TLR 2-2 유전자는 BS 그룹과 BL 그룹에서 CON 그룹에 비해 유의적으로 높게 나타났다(P<0.05). C type lectin은 MOS 그룹, LP 그룹과 SYN 그룹에서 CON 그룹에 비해 유전자 발현량이 유의하게 높았다(P<0.05).

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Fig. 2. Relative mRNA expression of IL-1β, IL-10, TGF- β2, TLR 2-2 and C type lectin in the liver of hybrid grouper Epinephelus akaara ♀×E. lanceolatus ♂ fed the experimental diets for 8 weeks. IL-1β, interleukin 1β; IL-10, interleukin 10; TGF-β2, transforming growth factor beta 2; TLR 2-2, toll-like receptor 2-2. CON, Control; MOS, Mannan oligosaccharides; LP, Lactobacillus plantarum; BS, Bacillus subtilis; BL, Bacillus licheniformis; SYN, Synbiotic, mixture of each 0.15% mannan oligosaccharides, L. plantarum, B. subtilis and B. licheniformis. Values are mean of triplicates and bars with different letters are significantly different (P<0.05).

고찰

양어사료 내 prebiotics, probiotics와 synbiotics 첨가는 장에서 소화효소(protease, amylase, lipase) 활성을 촉진하여 영양소 소화율과 성장을 증가시킬 수 있다(Wang et al., 2017a; Adorian et al., 2019). Orange spotted grouper (초기 무게, 2.8 g) 사료에 B. subtilis 혹은 L. plantarum을 1×108 CFU/g 이상의 농도로 첨가할 경우, 성장이 유의하게 증가하였다고 보고되었다(Son et al., 2009; Liu et al., 2012). Sun et al. (2010)은 orange spotted grouper (초기 무게, 45 g) 사료 내 B. pumilus와 B. clausii를 각각 1×108 CFU/g 농도로 단독 첨가하여 60일간 공급했을 때, B. clausii 실험구에서 B. pumilus 실험구에 비해 성장 증가 효과가 나타났으며, 이는 첨가된 B. clausii가 단백질 소화율을 개선시킨 결과라고 보고하였다. 이에 더해, Hybrid grouper E. fuscoguttatus ♀×E. lanceolatus ♂ (초기 무게, 28 g) 사료 내 0.2%의 mannan oligosaccharides를 첨가하여 4주간 공급했을 때, 성장률이 유의하게 증가하였다고 보고되었다(Zhu et al., 2023). Kang et al. (2022)은 대왕붉바리(초기 무게, 12–13 g)를 대상으로 각각 19°C, 23°C, 27°C와 31°C의 수온에서 사육실험을 진행한 결과, 수온이 증가함에 따라 성장이 증가하였으며 31°C에서 가장 높게 나타났다고 보고하였다. Prebiotics와 probiotics는 어종, 성장 단계, 사육수온과 첨가 함량에 따라 이용성이 달라진다(Torrecillas et al., 2011; Yang et al., 2016). 따라서, 대왕붉바리 사료에 mannan oligosaccharides, B. subtilis, B. licheniformis와 L. plantarum의 단독 혹은 혼합 첨가가 성장에 미치는 효과의 검증을 위해서는 성장단계, 첨가 함량, 첨가된 균주의 종류, 사육 수온 등 다양한 조건에서의 추가 연구가 필요하다고 생각된다.

양어사료 내 Bacillus의 첨가는 넙치(Paralichthys olivaceus, Ye et al., 2011), 무지개송어(Oncorhynchus mykiss, Bagheri et al., 2008)와 barramundi Lates calcarifer (Adorian et al., 2019)의 전어체 조지질 함량을 감소시킨다고 보고되었다. Adorian et al. (2019)은 barramundi 사료 내 Bacillus 첨가가 소화효소(protease, lipase, amylase)의 활성을 증가시켜 이용 가능한 영양소 사용을 최적화하고, 지질 저장보다 단백질 저장을 우선하여 전어체 조지질 함량이 감소되었다고 보고하였다. Dawood et al. (2016)은 참돔(Pagrus major) 사료에 L. rhamnosus와 L. lactis를 첨가하였을 때 전어체의 조지질 함량이 유의하게 증가하였고, 이는 사료 내 Lactobacillus가 체내 지질 소화율을 증가시켰기 때문이라고 보고하였다. 반면, Amoah et al. (2023)은 hybrid grouper E. fuscoguttatus ♀×E. lanceolatus ♂ 사료에 Bacillus를 첨가하였을 때, 전어체의 조지질 함량에는 유의한 차이가 없었다고 보고하였다. 본 실험의 경우, 대왕붉바리 사료 내 mannan oligosaccharides의 단독 첨가가 지질 소화율을 향상시켜 전어체의 지질 함량이 증가한 것으로 사료된다.

어류의 비특이적 면역은 항상성 유지와 병원균 제거에 중추적인 역할을 하며, SOD와 GPx는 항산화효소로서 면역반응 과정에서 발생하는 활성산소를 제거하여 산화스트레스를 방지한다(Toppo et al., 2009; Wang et al., 2018). 참돔 사료 내 mannan oligosaccharides, L. rhamnosus와 L. lactis를 단독 혹은 혼합 첨가하여 공급할 경우, lysozyme, 대식세포 활성과 SOD 활성이 증가한다고 보고되었다(Dawood et al., 2016; 2020). 넙치 사료에 mannan oligosaccharides, B. subtilis와 B. clausii를 단독 혹은 혼합 첨가하여 공급할 경우, lysozyme과 antiprotease의 활성이 증가하였다고 보고되었다(Ye et al., 2011; Lee et al., 2020). Jang et al. (2021)은 조피볼락(Sebastes schlegelii) 사료에 mannan oligosaccharides를 첨가할 경우 lysozyme, MPO, SOD 활성과 Ig 농도를 증가시킨다고 보고하였으며, Giri et al. (2013)은 rohu Labeo rohita 사료 내 L. plantarum 첨가가 lysozyme, 대식세포와 SOD 활성을 증가시킨다고 보고하였다. Orange spotted grouper에서도 mannan oligosaccharides, L. plantarum, B. pumilus와 B. clausii의 단독 혹은 혼합 첨가가 비특이적 면역력(lysozyme과 phagocyte)과 항산화 효소(SOD와 GPx) 활성을 증가시킨다고 알려져 있다(Son et al., 2009; Sun et al., 2010; Liu et al., 2012; Wang et al., 2017a). Torrecillas et al. (2011)은 유럽 농어(Dicentrarchus labrax) 사료에 첨가된 mannan oligosaccharides가 체내의 패턴 인식 수용체(pattern recognition receptor, PRR)에 의해 인식되어 대식세포와 lysozyme 활성을 증가시킨다고 보고하였다. 사료에 첨가된 L. plantarum과 Bacillus 균주는 식세포 작용, 대식세포, lysozyme과 complement 활성을 통해 세포와 체액의 면역능을 자극하고, 체내 glutathione과 folate 생성, 항산화 효소 활성 증가를 통해 숙주의 면역능을 증가시킬 수 있다(Son et al., 2009; Nayak, 2010; Sun et al., 2010; Liu et al., 2012; Wang et al., 2017b). 선행 연구들과 같이 본 실험에서 사료에 첨가된 mannan oligosaccharides, L. plantarum, B. subtilis와 B. licheniformis가 체내 대식세포와 lysozyme 활성, glutathione 생성 증가에 관여하여 비특이적 면역력을 강화했다고 생각된다. 그러나 NBT와 GPx의 경우, 각각 B. subtilis 단독 첨가나 probiotics를 단독 첨가한 경우에만 활성이 증가하여 나타났으므로, 이와 관련된 후속 연구가 필요하다고 생각된다. 따라서 L. plantarum, B. subtilis와 B. licheniformis는 기능성 사료 첨가제로써, 대왕붉바리 사료에 첨가할 경우 체내 lysozyme, anti-protease 활성과 GPx 활성을 증가시킬 것으로 사료된다.

어류의 혈액학적 지표는 건강도(Hb, Ht), 물질 대사(Chol, TG), 간 손상에 의한 스트레스(AST, ALT) 등을 확인하기 위해 사용된다(Casanovas et al., 2021). Dawood et al. (2016)은 참돔 사료 내 L. rhamnosus와 L. lactis를 첨가하여 공급할 경우, 장에서 짧은 사슬 지방산 생성을 촉진하여 혈중 지질 수치인 Chol과 TG를 감소시켰다고 보고하였다. 이에 더해, 사료 내 Lactobacillus 첨가가 참돔의 조직 손상이나 외부 감염으로부터 회복을 돕고 항상성 유지에 기여하여 Ht 수치를 증가시킨다고 보고되었다(Dawood et al., 2016). Adorian et al. (2019)은 barramundi 사료 내 B. subtilis와 B. licheniformis의 첨가가 AST, ALT 수치를 감소시킨다고 보고하였다. 따라서 대왕붉바리 사료 내 mannan oligosaccharides, L. plantarum, B. subtilis와 B. licheniformis의 혼합 첨가 혹은 B. licheniformis의 단독 첨가는 스트레스에 의한 간 손상을 감소시켜주는 것으로 판단된다.

어류의 장내 유익균의 증식은 병원균을 억제하여 장내 미생물군 조성을 개선하여 숙주의 건강, 면역능 강화와 소화 개선을 통하여 숙주에 긍정적인 영향을 미칠 수 있다(Liu et al., 2012). Bacillus는 장내에서 증식할 경우, 장내 산소 농도를 감소시켜 호기성 병원균의 성장을 억제하고, 혐기성 유익균의 성장을 촉진하여 장내 미생물군 조성을 개선한다고 보고되었다(Timmerman et al., 2004; Kuebutornye et al., 2019). Son et al. (2009)은 orange spotted grouper 사료 내 L. plantarum의 첨가가 장내 LAB의 증식을 촉진하여 장내 미생물 조성을 개선한다고 보고하였다. Yang et al. (2014)은 orange spotted grouper 사료 내 B. pumilus를 첨가하였을 때, 장내 Psychroserpens burtonensis, Pantoea agglomerans와 같은 병원균들의 증식을 억제하여 질병 저항성을 높일 수 있다고 보고하였다. 이에 더해, Yang et al. (2011)은 Psychrobacter를 orange spotted grouper에 첨가하여 공급할 경우, 장내 병원균이 감소하고 LAB를 포함한 유익균이 증가하여 장내미생물 조성이 개선되었다고 보고하였다. Dawood et al. (2016)은 참돔 사료 내 L. rhamnosus와 L. lactis를 첨가하여 공급할 경우, 장에서 LAB가 유의적으로 증가한다고 보고하였다. 따라서, 대왕붉바리 사료 내 mannan oligosaccharides, L. plantarum, B. subtilis와 B. licheniformis의 단독 혹은 혼합 첨가는 장내에서 Vibrio 균의 증식을 억제하고 LAB의 성장을 촉진하여 장내 미생물군 조성을 개선할 수 있는 사료 첨가제로 이용할 수 있을 것으로 사료된다.

Cytokine은 다양한 세포의 발달과 기능을 조절하는 중추적인 역할을 하는 단백질이다(O’shea et al., 2019). Probiotics는 여러 유형의 cytokine 발현을 조절하여 잉어(Cyprinus carpio)의 비특이적 면역반응을 활성화할 수 있다고 보고되었다(Biswas et al., 2012). IL-1β와 IL-10은 각각 염증 반응 유도와 항염증 반응을 통해 면역 체계에 관여한다(Secombes et al., 2011). TNF-β는 체내 면역계에서 림프구, natural killer cells, 수지상 세포와 대식세포 활성을 조절하여 체내 항상성을 유지하고 염증반응을 제어한다(Li et al., 2006).

어류의 비특이적 면역계에서 PRR은 미생물마다 특이적인 미생물 관련 분자 패턴을 식별하여 병원균을 인식한다(Takeuchi and Akira, 2010). Ribeiro et al. (2010)은 잉어에서 TLR-2가 병원균의 침입을 인식하고, 대식세포를 활성화하여 면역체계를 강화한다고 보고하였다. Ren et al. (2020)은 hybrid grouper E. lanceolatus ♂×E. fuscoguttatus ♀ 사료 내 mannan oligosaccharides 첨가가 IL-8과 TGF- β1 발현을 증가시킨다고 보고하였다. Picchietti et al. (2009)은 유럽 농어 사료 내 Lactobacillus 첨가가 IL-1β와 TGF-1 유전자 발현을 감소시켰다고 보고하였다. 이에 대조적으로, 무지개 송어에서 Bacillus와 Lactobacillus의 단독 첨가는 IL-1β, TNF-1, TGF-β 유전자 발현을 증가시켰다고 보고되었다(Panigrahi et al., 2007). 본 연구에서 대왕붉바리 사료 내 mannan oligosaccharides, L. plantarum, B. subtilis와 B. licheniformis의 혼합 첨가는 항염증 cytokine의 발현을 증가시켜 체내 염증반응을 조절하고 면역체계를 강화할 수 있을 것으로 생각된다.

대왕붉바리 사료에 mannan oligosaccharides, L. plantarum, B. subtilis와 B. licheniformis의 단독 혹은 혼합 첨가할 경우, 비특이적 면역력, 항산화능과 항염증 유전자 발현을 증가시키는 것으로 판단된다. 이는 mannan oligosaccharides, L. plantarum, B. subtilis와 B. licheniformis의 단독 혹은 혼합 첨가가 대왕붉바리의 장내 유익균(TLB)을 증식시키고 병원균(TVB)을 억제하여 장내 미생물군을 개선하였기 때문이라고 생각된다. 따라서 대왕붉바리 사료에서 mannan oligosaccharides, L. plantarum, B. subtilis와 B. licheniformis는 장 건강 개선을 통한 기능성 사료 첨가제로서의 이용성이 높은 것으로 사료된다. 그러나 어류 사료에서 prebiotics와 probiotics의 이용성은 다양한 요인에 영향을 받기 때문에, 대왕붉바리 사료 내 mannan oligosaccharides와 3종의 probiotics의 단독 혹은 혼합 첨가에 따른 이용성을 규명하기 위해서는 성장단계, 첨가 함량, 첨가된 균주의 종류, 사육 수온 등 다양한 조건에서의 후속 연구가 필요하다고 생각된다.

사사

본 연구는 “해양생물 마이크로바이옴 분석과 적용 연구를 통한 마린바이오틱스 개발” 연구의 일환으로 해양수산부와 한국해양수산과학기술진흥원의 지원을 받아 수행되었음(20210469).

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