Effects of Betaone Extract on the Inhibition of Adipocyte Differentiation in High-fat Diet-induced Obesity

고지방 식이 유발 비만에서 베타원 추출물이 지방세포 분화 억제에 미치는 영향

Abstract

Obesity is a disease in which an abnormally large amount of fat accumulates in the body. Various diseases such as type 2 diabetes, dyslipidemia, high blood pressure, fatty liver, gallbladder disease, and coronary artery disease are induced. In this study, we investigated the effect of betaone, a type of barley, on obesity suppression. After the betaone extract was treated with 3T3 L1 adipocytes, the effect on adipocyte formation was investigated through Oil Red O staining. It was observed that differentiation was inhibited without affecting the viability of 3T3 L1 adipocytes. The effect of betaone extract on obesity inhibition in a mouse model was investigated. As a result of administering betaone extract after a high-fat diet, it was confirmed that the level of blood sugar and body weight was decreased, and glucose uptake ability was improved in a glucose tolerance test. The formation of mouse adipose tissue was suppressed, and the expression of genes involved in the formation and degradation of obesity in liver tissue was improved. These results suggest that betaone extract is a useful substance for improving obesity and is an excellent material for health functional food.

백색지방조직(WAT)은 고등 진화 생물의 주요 에너지 저장고이며, 음식의 과잉 섭취에 의한 초과된 에너지가 발생하면 triacylglycerol(트리아실글리세롤)을 저장하고 에너지가 필요한 상황에서 동원하는 것이 주요 목적이며, 혈장 지질수준과 포도당 섭취 속도에 큰 영향을 미치는 조직이다.1,2) 최근에는 고지방 음식의 과잉으로 WAT의 증가에 의한 비만의 발병률이 급격히 증가하고 있다. 비만은 산업화된 국가에서 만연한 질병이며 non-insulin-dependent diabetes, hypertension, cancer, gallbladder disease, 그리고 atherosclerosis 를 비롯한 여러 병리학적 장애와 밀접하게 연관되어 있다.3-7) 이러한 광범위한 건강 영향과 관련하여 비만을 조절하는 새롭고 효과적인 전략을 개발할 필요성이 더욱 절실해졌다. 최근 지방세포 분화 과정을 이해하고 고지방 식이에 의한비만 유도 마우스 모델을 이용하여 비만 개선을 위한 연구들이 진행되고 있다. 지방 생성의 생리적 과정을 완전히 이해하고 비만 및 당뇨병과 같은 일부 대사 질환에 대한 새로운 치료 표적을 식별하기 위해서는 지방 세포 발달의 분자메커니즘 및 지방 유전자 조절에 대한 조사가 필요하다.

보리(Hordeum vulgare L.)는 밀, 쌀, 옥수수 다음으로 전세계적으로 많이 생산되는 곡물 작물이다. 본 연구에서 사용한 베타원은 베타글루칸의 함량을 증진시킨 보리의 한 종류로서 단백질, 지방, 무기질 및 비타민 등의 영양성분과 베타글루칸, 페놀화합물 등의 생리활성물질들이 함유되어 면역 강화, 혈중 콜레스테롤 수치를 낮추어 심혈관질환의 위험을 감소시키는 효과뿐만 아니라 당뇨병, 피부염, 습진, 주름 등에도 효과가 있는 것으로 보고되고 있다.8-11) 또한, 베타원 물추출물의 유효성분을 분석한 결과 triphenyl hexene과 ferulic acid가 분리되었고, 이 유효성분이 파골세포 분화를 억제하여 당뇨병을 개선시킨다고 보고되었다.12) 추후에 이유효성분을 이용하여 항비만에 미치는 효과에 대하여 검증을 할 예정이다. 본 연구에서는 베타원 추출물에 의한 지방세포분화 억제 효과를 in vitro 세포 실험, in vivo 마우스 모델에서 검증을 수행하였다.

재료 및 방법

실험 재료 −보리 베타원 가루를 이용하여 추출을 하였다. 준비된 시료에 10배의 물을 첨가한 후 2시간 동안 교반한 후 2회 추출하고 최종적으로 농축 및 동결건조하여 베타원물 추출물을 얻었다. 본 연구에 사용된 베타원 보리 품종은 2015년 국립식량과학원에서 개발한 품종이다.

세포 배양 및 시료 처리 −항비만에 관한 in vitro 세포분석에 사용되는 세포인 3T3 L1 preadipocyte를 서울대 세포주 은행에서 분양을 받은 후, 96 well plate에 분주 후 밀도가 100%가 될 때까지 배양하였다. 다음 2일 후(day 0) 분화유도 배지(MDI; 0.5 μM 3-isobutyl-1-methylxanthine(IBMX), 1 μM dexamethasone(DEX), 10 μg/mL insulin)에서 3일간처리한 후(day 3) 성숙 촉진 배지(10% FBS DMEM + 10 μg/mL insulin)와 시료로 교체하여 2일 간격으로 교체하여 8일까지 배양하였다.

세포 독성 유무 분석 −3T3 L1 세포를 96 well plate에 분주한 후, 베타원 추출물을 농도별로 첨가하여 배양시킨 후, 세포에 CCK-8 용액을 첨가한 후 450 nm에서 흡광도를 측정하였다.

Oil Red O 염색을 통한 지방세포 분화 분석 −세포내지방 형성을 염색하기 위해 세포를 따뜻한 PBS로 3회 세척하고 60% 여과된 Oil Red O 용액과 함께 실온에서 15분동안 배양한 다음 5회 세척하였다. 염색된 세포를 위상차 현미경을 이용하여 lipid droplet을 관찰하였다. 실험 동물 및 비만 유도 −실험동물은 주령된

실험 동물 및 비만 유도 −실험 동물은 4주령 된 C57BL/ 6 수컷 마우스를 32마리 구입한 후, 1주일간 적응시킨 후정상군 8마리를 제외한 24마리를 5주간 고지방 식이를 제공하였다. 물과 식이는 제한 없이 공급하였고, 체중은 고지방 식이를 공급한 후 매주 측정을 하였고, 식이는 5주동안 측정하였다. 동물사육실의 사육 조건은 12시간 명암 주기(오전 8시 ~오후 8시 조명), 온도 23±3℃, 상대습도 50±10% 가 되도록 조절하였다.

실험군 설정 −고지방 식이 공급으로 비만을 유도한 후무작위 추출하여 실험군을 나누었다. 정상 사료 식이(n=8), 고지방 식이(n=8), 저농도 베타원 추출물(50 mg/kg body weight)(n=8), 고농도 베타원 추출물(200 mg/kg body weight)(n=8)로 나누었다(Table I). 5주간 베타원 추출물을 투여하였다.

Table I.Classification of experimental groups

식이 섭취량, 체중, 부고환 지방량 및 간조직 측정 −5주간의 실험 기간 동안 매주 체중 변화를 관찰하기 위하여 매주 한번씩 체중을 측정하였고, 식이 섭취량은 매일 측정하였다. 또한, 5주 실험 종료 후 경추 탈골시킨 후 복부를 절개 하여 부고환 주위 지방 및 간조직의 무게를 측정하였다.

부고환 지방 조직 염색 −5주간 실험 종료 후 추출한 부고환 지방을 상온에서 10% 중성 완충 포르말린에 고정하였고 에탄올을 단계별 침투시켜 탈수 과정을 거친 후 xylene과 파라핀을 이용하여 조직을 동결 박절하여 조직 절편을 제작 후 hematoxylin으로 5분간 핵 염색하였으며, 다시 수세하여 eosin 용액으로 3분간 세포질 염색을 실시하였다. 염색된 조직은 광학 현미경을 사용하여 각 실험군들의 부고환 지방 조직을 관찰하였다.

혈당 측정 및 복강 내 당부하 검사(intraperitoneal glucose tolerance test)−혈당은 5주간 고지방 식이 및 베타원 추출물 식이를 급여 후 16시간 절식 시킨 다음 꼬리 정맥에서 혈액을 채혈하여 수행하였다. 복강 내 당부하 검사를 위해 16시간 절식 시킨 마우스의 체중을 측정한 후, 20% glucose 용액을 체중에 비례하게 적당량(2 g glucose/1 kg bw)을 복강 투여하고 0분, 15분, 30분, 60분, 및 120분에 꼬리 정맥으로부터 채혈하여 혈당을 측정하였다.

Reverse transcription-polymerase chain reaction(RT- PCR)을 통한 지방세포 분화 관련 유전자 발현 조절능 분석 −베타원 추출물이 지방세포 분화에 중요한 역할을 담당하는 유전자의 발현에 미치는 영향을 알아보기 위해 동물실험에서 추출한 간조직에서 관련 실험을 수행하였다. cDNA 합성을 위하여 먼저 샘플링한 간조직을 액체질소를 이용하여 막자사발에서 분쇄하였다. TRIzol(Invitrogen, CA, USA) 을 사용하여 mRNA를 추출한 후 M-MLV cDNA synthesis kit(Enzynomics)를 이용하여 cDNA를 합성한 후 PCR을 수행하였다. 유전자 발현 분석의 internal control로는 housekeeping gene인 glyceraldehydes-3-phosphate dehydrogenase(GAPDH) 를 사용하였으며 실험에 사용한 유전자의 염기서열은 Table 2에 표시하였다.

통계 분석 −실험을 통하여 얻어진 결과는 통계 처리하여 평균치와 표준 오차(mean ± SE)를 계산하였고, 각 당뇨 대조군과 실험군간의 유효성 검정을 위하여 Student's t-test를 사용하였다.

Table II. Primer sequences used in this study

결과 및 고찰

베타원 추출물이 3T3 L1 preadipocyte의 세포 생존율에 미치는 영향 −베타원 추출물의 지방 생성 억제능에 대한 실험을 하기 전에 우선적으로 3T3 L1 preadipocyte의 세포생존율에 미치는 영향을 CCK-8 assay를 이용하여 분석하였다. 3T3 L1 세포에 베타원 추출물을 농도별로 처리한 후 72 시간 후에 살펴보면 베타원 추출물 농도 10, 100 μg/mL 에서 세포 독성이 보이지 않았다(Fig. 1A). 이러한 결과는 베타원 추출물이 세포 독성을 유발하지 않아 안전성이 높은 소재임을 확인할 수 있다.

Fig. 1. Effect of Betaone extract on MDI-induced 3T3 L1 adipocyte. Differentiation of confluent 3T3-L1 preadipocytes was ini tiated with MDI treatment and maintained in DMEM containing 10% FBS. After day 8, MDI-induced adipocytes were treated with betaone for 48hr. (A) Cells were treated with the indicated concentrations of betaone for 72hr. and viability was determined by CCK-8 assay. (B) Cells were stained with Oil Red O stain. The morphological change and lipid droplet accumulation was visu alized using by inverted microscopy (×200). (C) Oil Red O staining ratios were determined by treatment of betaone.

베타원 추출물이 3T3 L1 preadipocyte의 지방세포형성에 미치는 영향 −지방세포 분화의 억제에 미치는 베타원 추출물의 영향을 살펴보기 위하여, 3T3 L1 preadipocyte를 MDI 로 분화를 유도함으로써 지방세포형성에 베타원 추출물의 작용을 확인할 수 있었다.13,14) 베타원 추출물을 농도별로 처리한 후 분화를 보내고 Oil Red O staining을 수행한 결과를 살펴보면 염색된 지방의 수가 감소됨을 확인할 수 있었다(Fig. 1B). 지방 생성의 억제 효과를 정량적으로 비교하기 위하여 염색된 지방의 양을 계산하여 추출물을 처리하지 않은 세포와 비교하여 농도 10, 100 μg/mL에서 각각 39, 79% 억제됨을 알 수 있었다(Fig. 1C).

본 연구에서 사용하는 베타원 추출물과 기존의 다양한 보리 추출물이 지방세포 분화 억제에 미치는 영향에 대한 실험을 수행하였다. 같은 농도(20 μg/ml)에서 베타원 추출물의 억제효과는 다른 추출물보다 높다는 것을 알 수 있었다 (Supplement data).

식이 섭취량 −식이 섭취량을 2일마다 1회 관찰한 결과, 정상 식이 실험군의 섭취량에 비하여 고지방 식이, 고지방 식이 + 베타원추출물 식이 실험군이 조금 감소하는 것을 볼수 있다. 그러나, 고지방 식이 실험군 사이에는 섭취량 차이가 유의미하게 보이지 않았다(Fig. 2A). 이러한 결과는 베타원 추출물에 의한 마우스 체중 증가 억제 효과는 식이 섭취량의 감소에 의해서 발생한 결과가 아니라 베타원 추출물의 항비만 효과에 의하여 발생한 현상이라고 생각된다.

Fig. 2. Serum glucose, and food intake, body weight and GTT. The values are expressed as the means±S.E. (n=8 per group) ##p<0.01, ###p<0.001 vs. ND; *p<0.05, **p<0.01 vs. HFD.

실험동물의 체중 −실험동물의 체중을 매주 1회 측정하여 체중 증가율을 측정한 결과, Fig. 2C에 제시한 것과 같이 베타원 추출물 섭취 실험군의 체중 증가율이 정상 식이를 섭취한 실험군처럼 고지방 식이만 섭취한 실험군에 비교하여 유의적으로 감소됨을 알 수 있다. 베타원 추출물의 농도별 체중 증가율은 차이를 보이지 않았다. 저농도와 고농도 실험군 사이에서 유의적인 차이는 보이지 않았다.

혈당 및 내당능 검사 −혈당 측정은 종료시점에서 측정하였으며, 실험 동물을 16시간 동안 절식 시킨 후 꼬리의 미세정맥에서 채혈을 하여 측정하였다. 그 결과 고지방 식이 실험군에 비하여 베타원 추출물의 저농도, 고농도 실험군인 B50, B200에서 혈당이 유의적으로 낮아졌다(Fig. 2B). 내당능 검사에서는 정상 식이 실험군과 베타원 추출물 실험군 (저농도, 고농도) 에서 고지방 식이 실험군과 비교해서 내당능 효능이 더 우수함을 알 수 있다. 결과를 살펴보면, 정상식이 실험군과 비교하여 고지방 식이 실험군에서 내당능이 감소되었고, 베타원 추출물 식이에 의하여 감소된 내당능이 개선되는 것을 볼 수 있었다(Fig. 2D).

부고환 지방 및 간 무게 −실험 종료 후 동물 희생 시 측정한 부고환 지방 및 간 무게를 측정하여 비교하였다. 고지방 식이에 의한 지방량 증가는 부고환 지방에서는 매우 유의미하게 증가하였고 간조직에서는 증가되는 경향을 보였다. 이 증가된 간조직과 부고환 지방은 베타원 추출물 실험군에서 지방량은 유의미하게 감소되었고, 간조직 무게 여기 감소되는 경향을 보였다(Fig. 3A). 각 실험군에서 추출한 부고환 지방 조직의 H&E 염색을 통하여 베타원 추출물이 지방 세포 분화를 억제시키는 역할을 수행함을 알 수 있다(Fig. 3B).

Fig. 3. Betaone extract ameliorates obesity in HFD-fed mice. (A) Epididymal adipose tissue and liver weight. (B) Representative microscopic observation of adipose tissue of epididymis by H&E staining. ###p<0.001 vs. ND; **p<0.01, ***p< 0.001 vs. HFD

베타원 추출물이 adipogenesis 관련 유전자 및 단백질 발현에 미치는 영향 −항지방 생성 효과의 기초가 되는 분자 메커니즘을 더 잘 이해하기 위해 qRT-PCR 분석을 수행하여 베타원 추출물이 주요 전사 인자의 발현에 미치는 영향을 조사하였다. PPARγ와 C/EBPα가 전사 수준에서 베타원 추출물에 의해 억제되었음을 관찰했다. 우리는 또한 지방 생성 경로에서 PPARγ의 잘알려진 상위 조절 인자인 핵심 전사 조절자인 SREBP-1c의 유전자 발현도 조사하였는데, 베타원 추출물에 의해 SREBP-1c mRNA가 유의하게 억제됨을 보였다. 이러한 결과는 베타원 추출물이 전사 수준에서 PPARγ의 상류 조절자로서 SREBP-1c를 억제한다는 것을 나타낸다.15,16) 결과적으로, 이러한 관찰은 베타원 추출물이 지방 세포 분화 동안 지방 생성을 억제한다는 것을 시사한다.17-20) FAS와 ACC는 지방 생성의 두 가지 핵심 효소로, 항비만 연구의 중요한 표적이 된다.21,22) 따라서 본 연구를 통해 베타원 추출물이 FAS와 ACC의 유전자 발현을 조절하는지 여부를 추가로 연구하였다. 베타원 추출물 처리는FAS와 ACC의 전사를 억제하였다. 이러한 결과는 베타원 추출물이 지방 세포 분화 동안 지방 생성을 억제한다는 것을 나타낸다(Fig. 4).

Fig. 4. Inhibitory effect of betaone on adipogenesis and adipogenesis-related gene expression in mouse liver. The mRNA was extracted from liver tissue of each mouse, cDNA was synthesized, and real-time qPCR was performed, and loading control was evaluated using GAPDH. The relative intensities of expression of PPARγ, C/EBPα, SREBP-1c, FAS, and ACC were measured, and the data were statistically analyzed using TTEST, and differences were considered statistically different at #p<0.05 vs. ND; *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001 vs. HFD.

결론

국립식량과학원에서 개발한 베타원은 기존의 맥류에 베타글루칸의 함량이 증가한 품종으로, 물추출을 수행하여 사용하였다. 본 연구를 통하여 베타원 추출물이 지방세포 3T3 L1의 분화 과정에서 억제제로 작용함을 알 수 있었고, 고지방 유래 비만 마우스의 혈당 개선, 지방 조직 감소 등의 효과를 보였다. 이에 본 연구결과는 향후 비만 예방 및 개선에 효과가 있는 소재 개발 및 건강기능식품의 소재로 사용될 가능성을 제시하였다.