Korean Journal of Pharmacognosy (생약학회지)

The Korean Society of Pharmacognosy (한국생약학회)
권호 표지
DOI QR코드

DOI QR Code

Protective Effect of Cotoneaster mongolicus Pojark. Extract in HCl/ethanol-induced Gastritis Mice

Cotoneaster mongolicus Pojark. 추출물의 HCl/ethanol로 유발된 위염 mice에 대한 보호효과

  • Choi, Jeong Won (Department of Herbology, College of Korean Medicine, Daegu Haany University) ;
  • Lee, Jin A (Department of Herbology, College of Korean Medicine, Daegu Haany University) ;
  • Shin, Mi-Rae (Department of Herbology, College of Korean Medicine, Daegu Haany University) ;
  • Park, Hae-jin (DHU Bio Convergence Testing Center) ;
  • Roh, Seong-Soo (Department of Herbology, College of Korean Medicine, Daegu Haany University)
  • 최정원 (대구한의대학교 한의과대학 본초약리학교실) ;
  • 이진아 (대구한의대학교 한의과대학 본초약리학교실) ;
  • 신미래 (대구한의대학교 한의과대학 본초약리학교실) ;
  • 박해진 (DHU 바이오융복합시험센터) ;
  • 노성수 (대구한의대학교 한의과대학 본초약리학교실)
  • Received : 2022.09.07
  • Accepted : 2022.09.24
  • Published : 2022.09.30
Download PDF
⟨ Previous Next ⟩

Abstract

Cotoneaster mongolicus Pojark. (CM), in the family Rosaceae is an endemic plant to the Mongolian region (its name: Moнroл чapraй). In Mongolia, Cotoneaster species as a crude drug is mainly used for inflammatory diseases, diarrhea, and stomach indigestion. In this study, we evaluated the gastro-protective activity underlying mechanism of CM. For in vivo experiments, mice were divided into 5 groups; normal mice (Normal), gastritis mice (Control), gastritis mice treated with sucralfate 10 mg/kg (SC), gastritis mice treated with CM 100 mg/kg (CML), gastritis mice treated with CM 200 mg/kg (CMH). Gastritis was provoked by HCl/ethanol (60% ethanol in 150 mM HCl). After oral administration of each drug, HCl/ethanol was orally administered 90 mins later to induce gastritis. CM alleviated the damage to the gastric mucosa caused. As a result of confirming the expression of protein in gastric tissue through western blot, CM significantly reduced the expression of NF-κB activated due to gastritis. Also, it significantly modulated the Nrf2-Keap1 pathway. These results indicate that CM not only inhibits the nuclear metastasis of NF-𝛋B but also modulates the Nrf2-Keap1 pathway to relieve inflammation of the gastric mucosa.

Keywords

위염(gastritis)은 위의 내층을 보호하는 점막 표면에 발생한 염증을 말하며, 체내 위산분비와 관련된 물질인 공격인자와 위장 점막의 방어력과 관련된 물질인 방어인자의 불균형으로 인해 발생한다.1,2) 위염의 주요한 원인으로는 Helicobacter pylori균에 의한 감염, 진통 소염제, 스테로이 드제제, 음주, 흡연, 불규칙한 식습관 및 스트레스 등이 있다.3) 이 중 음주는 위 점막 손상의 가장 큰 요인이며, 알코올을 과다하게 섭취하면 위 조직에서 점막하 부종, 출혈, 상피세포의 박리 및 염증세포의 침윤 등이 특징적으로 나타난다.4) 위염이 발생하면 복통, 속쓰림과 같은 증상이 발생 하고, 위장내 출혈이 발생할 가능성이 높아지며 위장장애가 발생할 수 있다.5) 이러한 질환의 예방과 치료를 위해 여러 약물이 사용되고 있는데 위 점막 보호제인 sucralfate, stillen, teprenone은 일반적으로 식욕부진, 불면증, 두통 등의 부작용이 나타나기도 하며, 복용량이 많은 단점이 있다. 또한 위염 치료제로 사용되는 히스타민 수용체 길항제(H-receptor 2 antagonist)인 cimetidine, ranitidine과 양성자 펌프 억제제 (proton pump inhibitors, PPIs)인 omeprazole, pantoprazole 등이 위산분비를 억제시키는 기능을 하지만, 부작용으로써 두통, 변비, 설사, 어지러움, 소양감, 피부발진 등이 나타나기도 한다.6,7) 이에 위염을 억제할 수 있는 천연물 소재에대한 연구가 활발히 이루어지고 있다.8,9)

Cotoneaster속 식물은 주로 몽골, 이란, 중국 및 티베트에 분포되어 있으며 전통 의학에서 기침, 발열, 비강출혈, 치질, 심혈관 질환 및 당뇨병의 치료에 사용되고 있다.10) Cotoneaster mongolicus Pojark.(C. mongolicus)의 열매는 티베트에서 소화와 설사치료에 사용되는 복합 제제의 주요 성분이며, 잎은 isoquercetin, quercetrin, rutin과 같은 flavonoid 성분이 함유된 것으로 확인되었다.11,12) 하지만 C. mongolicus에 대한 연구는 부족한 실정이며 약리효능과 그 작용기전에 대한 연구가 필요한 것으로 보여진다.

본 연구에서는 HCl/ethanol로 유발한 급성 위염 동물모델에서 C. mongolicus의 위 점막 보호효과를 확인하였으며 유의한 결과를 얻었기에 그 기전에 대해 보고하는 바이다.

재료 및 방법

시료 −본 실험에 사용된 C. mongolicus는 traditional medical research institute(TMRI, Bangkok, Thailand)로부터 건조된 파우더 형태로 공급받았다. C. mongolicus의 잎과 가지 200g에 10배의 증류수를 가하여 열탕추출기(DWT- 1800T; Daewoong Pharmaceutical Co., Ltd., Seoul, Korea)로100℃에서 2시간 추출한 후, 회전 감압농축기(Buchi B-480, Buchi Labortechnik AG, Flawil, Switzerland)를 이용하여 농축하였다. 그 후 동결건조기(FreeZone 1 Liter Benchtop Freeze Dry System, LABCONCO, MO, USA)에서 완전 건조시켜 파우더 형태로 만들었으며, C. mongolicus 파우더 (CM, sample No. H-21-39)는 –80℃에서 냉동 보관하였다가 실험 직전에 증류수에 녹여 사용하였다.

시약 −본 실험에 사용된 gallic acid, folin-ciocalteu’s phenol reagent, quercetin, 2-diphenyl-1-picrylhydrazyl(DPPH), 2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid)(ABTS), sucrose octasulfate aluminum complex (sucralfate), potassium phosphate monobasic, potassium phosphate dibasic, potassium persulfate, phenylmethylsulfonyl fluoride(PMSF)는 Sigma- Aldrich Co.(St. Louis, MO, USA)에서 구입하여 사용하였으며 sodium carbonate와 potassium acetate는 DAEJUNG (Gyeonggi, Korea)에서 구입하여 사용하였고, L-ascorbic acid, aluminum chloride는 Alfa Aesar(Ward Hill, MA, USA) 에서 구입하였다. 단백질 정량을 위한 BCA protein assay kit는 Thermo Scientific(Waltham, MA, USA)로 부터 구입하였으며, protease inhibitor mixture, ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)는 Wako Pure Chemical Industries, Ltd.(Osaka, Japan)에서, ECL western blotting detection reagents와 Nitrocellulose membranes는 GE Healthcare(Arlington Height, IL, USA)에서 구입하여 사용하였다. 1차항체로 사용한 IκB-α, p-IκB-α, cyclooxygenase-2(Cox-2), tumor necrosis factor α(TNFα), interleukin-β(IL-1β), gp91phox, p22phox, p47phox, kelch-like ECH-associated protein 1(Keap1), Heme Oxygenase 1(HO-1), catalase, glutathione peroxidase-1/2(GPx-1/2), nuclear factor-kappaB p65(NF-κB p65), nuclear factor erythroid-2-related factor 2(Nrf2), β-Actin 및 Histone 항체는 Santa Cruz Biotechnology(Dallas, TX, USA)에서, 2차항체는 GeneTex, Inc.(Irvine, CA, USA)에서 구입하여 사용하였다.

Total Polyphenol과 Total Flavonoid 함량 측정 −Total polyphenol 함량은 Folin Ciocalteu’s의 방법13)에 따라 측정하였다. 100 µL의 시료에 10% Folin-Ciocalteu’s phenol reagent 500 µL와 7.5% sodium carbonate 400 µL를 혼합한 뒤 실온의 암소상태에서 30분 반응시켰다. 그 후 microplate reader(Infinite M200 pro, Tecan, Männedorf, Switzerland)를사용하여 765 nm에서 흡광도를 측정한 뒤, 표준물질인 gallic acid로 표준 검량선을 구하고 total polyphenol 함량(mg gallic acid equivalent(GAE)/g)을 산출하였다.

Total flavonoid의 함량은 Jiao와 Wang의 방법14)에 따라 측정하였다. 100 µL의 시료에 methanol 300 µL, 10% aluminium chloride solution 20µL, 1M potassium acetate solution 20 µL 및 증류수 560 µL를 혼합하여 실온의 암소상태에서 30분 반응시켰다. 그 후 microplate reader를 사용하여 415 nm에서 흡광도를 측정하여, 표준물질인 quercetin로 표준 검량선을 구하고 total flavonoid 함량(mg quercetin equivalent(QE)/g)을 산출하였다.

DPPH와 ABTS radical 소거 활성 측정 −DPPH free radical 소거 활성은 Blois의 방법15)에 따라 측정하였다. 60 µM DPPH 용액 100 µL와 농도별로 희석한 시료 용액 100 µL를 혼합하여 30분간 암소상태로 반응시킨 후 microplate reader를 사용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. 대조군으로는 L-ascorbic acid를 사용하였고, radical을 50% 감소시키는 시료의 농도를 IC50 값으로 나타내었다. ABTS radical 소거 활성은 Re등의 방법16)에 따라 측정하였다. 7 mM ABTS 용액과 2.4 mM potassium persulfate를 혼합하여 실온의 암소상태에서 약 16시간 이상 방치하여 ABTS+를 형성시킨 후, 흡광도(30℃, 415 nm) 값이 0.70 ± 0.02가 되도록 ethanol로 희석하였다. 희석한 ABTS 용액 95 µL와 농도별로 희석한시료 용액 5 µL를 혼합하여 15분간 반응시킨 후 microplate reader를 사용하여 30℃, 415 nm에서 흡광도를 측정하였다. 대조군으로는 L-ascorbic acid를 사용하였고, radical을 50% 감소시키는 시료의 농도를 IC50 값으로 나타내었다.

\(\text {DPPH and ABTS radical scavenging activity} (\%) \\= [ 1 - ( \frac { O D _ { \text { sample } } } { O D _ { \text { control } } } ) ] \times 100\)

Absorbance of sample; ODsample

Absorbance without sample; ODcontrol

실험 동물 −본 실험에 사용된 실험동물은 6주령 수컷 ICR mice(Daehan Biolink Co. Ltd., Eumseong, Korea)는 1주일간 사육실 환경에 적응시킨 뒤 실험을 진행하였다. 동물 사육실의 조건은 conventional system으로 온도 22±2℃, 습도 55±5%, 명암주기(light: dark cycle) 12시간의 사육 환경을 유지했고, 물과 고형 사료(Zeigler Bros, Inc., PA, USA)를 자유롭게 공급하였다. 동물실험의 윤리적, 과학적 타당성의 검토와 효율적인 관리를 위해 대구한의대학교 동물실험윤리 위원회(Institutional Animal Care and Use Committee: IACUC) 의 승인(DHU2021-108)을 받아 시행되었으며, 동물관리 규정을 준수하였다.

급성 위염 동물 모델 유발 및 동물 처치 −실험군은 정 상군(Normal), 대조군(Control), sucralfate 10 mg/kg 투여군 (SC), CM 100 mg/kg 투여군(CML) 및 CM 200 mg/kg 투 여군(CMH) 총 5군으로 각각 8마리씩 분류하여 실험을 진행하였다. 실험 18시간 전부터 절식하여 물만 제공하였고, 정상군을 제외한 모든 동물은 각각 농도와 약물에 따라 단회 경구투여하였다. 투여 90분 후 150mM HCl/60% ethanol 0.55 mL를 단회 경구투여하여 위염을 유발하였다. 유발 90분후 isoflurane으로 흡입 마취한 후 위 조직을 채취하였으며, 실험에 사용하기 전까지 -80℃에 보관하였다.

육안적인 위 점막 손상도 관찰 −적출한 위 조직의 손상도는 I-Solution lite(Innerview Co., Korea) 프로그램을 사용하여 위 점막의 손상된 면적을 측정하였으며, 위 전체 면적과 비교한 후 아래의 식을 이용하여 나타내었다.

\(\text {위 손상 비율} ( \% ) = \frac { \text { 위 손상 면적 } ( mm ^ { 2 } ) } { \text { 위 전체 면적 } ( mm ^ { 2 } ) } \times 100\)

위 조직 western blotting−위 조직의 세포질을 얻기 위해 10 mM HEPES(pH 7.8), 10 mM KCl, 2 mM MgCl2, 1mM DTT, 0.1 mM EDTA, 0.1 mM PMSF 및 protease inhibitor cocktail을 첨가한 buffer A를 넣고 tissue grinder (BioSpec Product, Oklahoma, USA)로 분쇄한 후 아이스 위에서 30분간 정치시켰다. 그 후, 10% NP-40 용액을 첨가하여 12,000 rpm으로 2분간 원심분리 하여 세포질을 포함하고 있는 상층액을 분리하였다. 핵을 얻기 위해 10% NP-40가더해진 buffer A에 두 번 헹구고 100 µL의 buffer C(50 mM HEPES, 50 mM KCl, 300 mM NaCl, 1 mM DTT, 0.1 mM EDTA, 0.1 mM PMSF, 1%(v/v) glycerol, protease inhibitor cocktail)를 첨가해 재부유 시킨 뒤 10분마다 vortex를 3번 하였다. 4℃에서 12,000 rpm으로 10분간 원심 분리한 후 핵을포함하고 있는 상층액을 얻어 -80℃에서 각각 냉동 보관하 였다. 위 조직 세포질에서 p-IκB-α, IκB-α, Cox-2, TNFα, IL-1β, gp91phox, p22phox, p47phox, Keap1, Heme Oxygenase 1(HO-1), catalase, GPx-1/2, β-Actin과 핵에서 NF-κB p65, Nrf2, Histone 단백질 발현을 측정하기 위해 12 µg의 단백질을 8~14% SDS-polyacrylamide gel을 이용하여 전기영동 후, acrylamide gel에서 분리된 단백질을 nitrocellulose membrane으로 이동시켰다. 준비된 membrane에 각각의 1차antibody(1:1000)를 처리하여 4℃ 에서 overnight 시킨 다음 PBS-T로 6분마다 5회 세척하고, 각각 처리된 1차 antibody에 사용되는 2차 antibody(1:3000)를 사용하여 상온에서 1시간 30분 반응시킨 후, PBS-T로 6분마다 5회 세척하였다. 그 후 enhanced chemiluminescence(ECL) 용액에 노출시켜 Sensi- Q2000 Chemidoc(Lugen Sci Co. Ltd, Seoul, Korea)를 이용해 단백질 발현을 확인하였으며, 해당 band를 ATTO Densitograph Software(ATTO Corporation, Tokyo, Japan) 프로그램을 사용하여 정량하였다. 각각의 단백질 수준을 정상군의 단백질 수준으로 나눈 후 상대적 비로 나타내었다 (represented as 1).

통계분석 −In vitro의 수치는 mean ± SEM으로 표시하였고 in vivo의 수치는 mean ± SD로 표시하였다. SPSS program for windows version 26(Version 26.0, IBM, Armonk, NY, USA)를 사용하여 one-way analysis of variance(ANOVA) test를 실시한 후 least-significant differences(LSD) test로 사후검증을 실시하여 각 군의 평균 차이에 대한 통계적 유의성을 p<0.05에서 검증하였다.

결과

Total polyphenol과 Total flavonoid 함량 측정 −CM의 total polyphenol과 total flavonoid 함량을 측정한 결과, total polyphenol 함량은 181.16±0.026 mg GAE/g, total flavonoid 함량은 40.20±0.23 mg QE/g으로 나타났다(Table I). 와 소거 활성 −

DPPH와 ABTS radical 소거 활성 −DPPH free radical 소거 활성을 측정한 결과, 양성대조물질인 L-ascorbic acid의 IC50 값은 1.23 ± 0.05 μg/mL로 나타났고, CM의 IC50 값은 50 6.12 ± 0.07 μg/mL로 나타났다. ABTS radical 소거 활성을 측정한 결과, 양성대조물질인 L-ascorbic acid의 IC 값은 50 3.37 ± 0.05 μg/mL로 나타났고, CM의 IC 값은 14.91±0.23 50 μg/mL로 나타났다(Fig. 1).

Fig. 1. DPPH and ABTS radical scavenging activity of CM. DPPH radical scavenging activity of CM; (A), ABTS radical scav- enging activity of CM and L-ascorbic acid; (B). CM, Cotoneaster mongolicus extract. All data were performed in triplicate and expressed as mean±SEM.

육안적인 위 점막 손상도 측정 −육안적 평가로 위 점막의 손상도를 확인한 결과, Normal군의 손상도는 1.34±0.41% 로 정상적인 상태로 나타났으며, Control군의 위 점막 손상도는 43.66 ± 2.66%로 150 mM HCl/60% ethanol에 의해 출혈과 점막의 결손이 발생한 것이 확인되었다. CM 투여군은 CML군 11.64 ± 2.56%, CMH군 9.64 ± 1.46%의 손상도가 나타났으며, 이는 양성대조군인 SC군의 손상도가 13.43 ± 1.92%인 것으로 보았을 때 CM의 투여가 150 mM HCl/60% ethanol에 의한 위 점막 손상을 효과적으로 완화시켰음을 확인하였다(Fig. 2).

Table I.Total polyphenol and total flavonoid contents of Cotoneaster mongolicus

CM, Cotoneaster mongolicus extract; GAE, gallic acid equivalent; QE, quercetin equivalent. All data were performed in triplicate and expressed as mean±SEM.

Fig. 2. Protective effects of CM on HCl/ethanol-induced gastritis in mice. Macroscopic observation of the effect of CM; (A), Ratio of damaged area per total gastric area; (B). Normal; normal mice, Control; gastritis mice, SC; gastritis mice treated with sucralfate 10mg/kg, CML; gastritis mice treated with CM 100 mg/kg, CMH; gastritis mice treated with CM 200 mg/kg. All data are expressed as mean±SD (n=8). Significance: ###p<0.001 versus normal mice, ***p<0.001 versus gastritis mice.

Fig. 3. Effects of CM on the regulation of inflammatory transcription factors. Normal; normal mice, Control; gastritis mice, SC; gastritis mice treated with sucralfate 10 mg/kg, CML; gastritis mice treated with CM 100 mg/kg, CMH; gastritis mice treated with CM 200 mg/kg. All data are expressed as mean ± SD (n=8). Significance: ###p<0.001 versus normal mice, *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001 versus gastritis mice.

CM이 염증성 전사인자 조절에 미치는 효과 −위 조직에서 염증성 전사인자인 p-IκB-α와 NF-κB p65의 발현을 확인하였다. 세포질 내 p-IκB-α의 발현은 Normal군 대비Control군에서 약 2.5배 증가하였으며, Control군 대비 CML 군과 CMH군에서 각 31%, 36% 감소하였다. 핵 내 NF-κB p65의 발현은 Normal군 대비 Control군에서 34% 증가하였으며, Control군 대비 CML군과 CMH군 모두에서 15% 발현이 감소하여 양성대조군인 SC군과 유사한 수치를 나타내었다(Fig. 3).

CM이 염증관련 인자의 조절에 미치는 효과 −위 조직에서 염증 발현에 관련된 인자인 Cox2, TNFα 및 IL-1β의 발현량을 분석한 결과 Normal군 대비 Control군에서 각각 2.1배, 1.9배, 2.7배 발현이 증가하였다. CM 투여군에서 모든 인자의 발현이 감소되었고, 그 감소율이 CMH군에서 각각 45%, 48%, 40%로 가장 높게 나타났다(Fig. 4).

Fig. 4. Effects of CM on the regulation of inflammatory-related factors. Normal; normal mice, Control; gastritis mice, SC; gastritis mice treated with sucralfate 10 mg/kg, CML; gastritis mice treated with CM 100 mg/kg, CMH; gastritis mice treated with CM 200 mg/kg. All data are expressed as mean ± SD (n=8). Significance: ###p<0.001 versus normal mice, *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001 versus gastritis mice.

CM이 NADPH oxidase의 조절에 미치는 효과 −위 조직에서 NADPH oxidase인 gp91phox, p22phox 및 p47phox의 발현량을 분석한 결과 Normal군 대비 Control군에서 gp91phox는 약 1.9배, p22phox와 p47phox는 약 2.5배 발현이 증가하였다. CM 투여군에서 NADPH oxidase의 발현감소가 모두 나타났고, 감소율은 CMH군에서 각각 38%, 40%, 46%로가장 효과적인 것으로 나타났다(Fig. 5).

Fig. 5. Effects of CM on the regulation of NADPH oxidase. Normal; normal mice, Control; gastritis mice, SC; gastritis mice treated with sucralfate 10 mg/kg, CML; gastritis mice treated with CM 100 mg/kg, CMH; gastritis mice treated with CM 200 mg/kg. All data are expressed as mean ± SD (n=8). Significance: ###p<0.001 versus normal mice, *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001 versus gastritis mice.

CM이 항산화 단백질의 조절에 미치는 효과 −위 조직에서 항산화에 관련된 단백질인 Nrf2와 Keap1의 발현을 확인하였다. 핵 내 Nrf2의 발현은 Normal군 대비 Control군에서 약 29% 감소하였으며, CM 투여군에서 발현이 농도의존적으로 증가하였고 CMH군에서의 발현 수준은 Normal군과 비슷한 정도로 나타났다. 세포질 내 Keap1의 발현은 Normal군 대비 Control군에서 약 2.2배 증가하였으며, CM 투여군에서 발현이 농도의존적으로 감소하였고 CMH군에서 감소율이 48%로 가장 유의한 결과가 나타났다(Fig. 6).

Fig. 6. Effects of CM on the regulation of antioxidant-related proteins. Normal; normal mice, Control; gastritis mice, SC; gastritis mice treated with sucralfate 10 mg/kg, CML; gastritis mice treated with CM 100 mg/kg, CMH; gastritis mice treated with CM 200 mg/kg. All data are expressed as mean ± SD (n=8). Significance: ##p<0.01, ###p<0.001 versus normal mice, **p<0.01, ***p<0.001 versus gastritis mice.

CM이 항산화 효소의 조절에 미치는 효과 −위 조직에서 항산화 효소인 HO-1, catalase, GPx-1/2의 발현량을 분석한 결과 Normal군 대비 Control군에서 각각 28%, 21%, 28% 의 발현 감소가 나타났다. Control군 대비 CM투여군에서 항산화 효소의 발현량이 증가하였으며 CMH군에서 증가율은 각각 34%, 28%, 51%로 가장 높은 수준의 발현 증가가 나타났다(Fig. 7).

Fig. 7. Effects of CM on the regulation of antioxidant enzymes. Normal; normal mice, Control; gastritis mice, SC; gastritis mice treated with sucralfate 10 mg/kg, CML; gastritis mice treated with CM 100 mg/kg, CMH; gastritis mice treated with CM 200 mg/kg. All data are expressed as mean±SD (n=8). Significance: #p<0.05, ##p<0.01 versus normal mice, *p<0.05, **p<0.01 versus gastritis mice.

고찰

위염(Gastritis)은 크게 급성과 만성으로 분류된다. 급성위염은 위산이 과다분비 되거나 과하게 알코올을 섭취하는 경우에 발생한다고 알려져 있으며, 만성위염은 과도한 스트레스 또는 Helicobacter pylori균의 감염과 관련이 깊다.17) 급성위염을 방치하게 되면 만성위염으로 이어지게 된다. 치료를 위해 제산제를 복용하기도 하지만 위장수축 저해, 소화불량으로 인한 변비와 같은 증상을 유발하며 위장의 산도가 낮아져 유해균이 증식하기 좋은 환경을 조성한다.18) 이렇듯 기존 치료제의 여러 부작용이 보고되고 있어 비교적 안전성이 높은 천연물에서 위염 치료와 예방 효과를 가지는소재를 발굴하기 위해 연구가 활발히 이루어지고 있다.19,20) 따라서 본 연구에서는 HCl/ethanol로 유발한 급성 위염 동물모델에서 Cotoneaster mongolicus Pojark. 추출물(CM)이어떠한 보호효과를 나타내는지에 대해 평가하였다.

실험에 사용한 CM의 total polyphenol과 total flavonoid 함량을 확인한 결과 total polyphenol은 181.16±0.26 mg GAE/g total flavonoid는 40.20±0.23 mg QE/g을 가지는 것으로 확인되었다(Table I). 천연식물이 지니는 이러한 유기화합물질(phytochemical)은 항산화 활성 외에도 항염증, 면역조절, 위장보호 등의 신체에 이로운 생물학적 기능을나타내는 것으로 알려져있다.21) 또한 라디칼 소거 활성을 통해 항산화 능력을 평가하기 위해 DPPH, ABTS assay를 실시하였다. DPPH는 비교적 안정한 free 라디칼로 항산화 물질과 반응하면 짙은 자색을 띄는 diphenylpicrylhydrazyl이diphenylpicrylhydazine으로 환원되어 색이 변하는 것을 통하여 항산화능 평가에 일반적으로 사용되고 있다.22) ABTS는 산화 유도제인 potassium persulfate와 반응해 청록색의 ABTS+을 형성하고 이것이 항산화 물질과 반응하여 전자공여능으로 인한 탈색반응을 나타내며, 이를 통해 항산화능을 측정하는데 이용되고 있다.23) 라디칼을 50% 억제시키는 농도인 IC50 값을 산출하여 소거능을 확인한 결과 DPPH assay는6.12±0.07μg/mL로, ABTS assay의 경우 14.91±0.23μg/mL 으로 나타났다(Fig. 1).

실험에 사용된 동물은 6주령의 수컷 ICR mice로, 약물의 보호효과를 확인하기 위해 위염 유발 90분 전 각 실험군의 해당약물과 농도(SC; sucralfate 10 mg/kg, CML; CM 100 mg/kg, CMH; CM 200 mg/kg)에 맞추어 단회 경구투여하였다. 이후 150mM HCl/60% ethanol 0.55 mL를 단회 경구투여하여 위염을 유발하였다. 유발 90분 후 위 조직의 손상정도를 육안으로 확인한 결과 유발을 하지 않은 정상군에서는 손상이 나타나지 않았으나 대조군은 HCl과 ethanol에 의해 위 점막 및 위벽이 전반적으로 손상되었으면 발적, 출혈 및 궤양이 크게 나타난 것으로 확인되었다. 하지만 C. mongolicus 추출물(CM)을 투여한 군인 CML군과 CMH군에서는 위 점막의 손상 정도와 출혈이 크게 감소한 것이 확인되었으며, 이를 정량한 뒤 수치화하여 평가한 결과 CM을 투여한 군에서 양성대조군인 SC군보다 손상도가 낮은 것으로 나타났다(Fig. 2).

염증반응이 과다하게 일어나면 세포질에 존재하는 IκB-α의 인산화 및 분해가 일어나면서 이와 결합해 있던 nuclear factor-kappaB(NF-κB)의 핵 내 전이가 발생한다. 이로 인해 cyclooxygenase-2(Cox-2), tumor necrosis factor α(TNFα), interleukin-1β(IL-1β)와 같은 염증유발에 관여하는 인자들의 분비가 증가하게 되면서 세포 및 조직을 손상시키게 된다.24) 위 조직에서 NF-κB p65와 p-IκB-α의 발현을 확인한 결과세포질 내 p-IκB-α의 수준은 CM의 투여에 의해 크게 감소한 것으로 확인되었으며, NF-κB p65의 핵 내 전이 또한 유의하게 감소한 것으로 확인되었다(Fig. 3). 또한 염증관련인자 Cox-2, TNFα 및 IL-1β의 세포질 내 발현은 CM을 투여받은 군 모두에서 유의하게 감소하였으며, 양성대조군인 SC 군과 비교하였을 때도 CMH군은 더욱 우수한 억제효과를 나타냈다(Fig. 4).

활성 산소종(reactive oxygen species; ROS)은 세포와 DNA의 손상에 작용하는 변형된 산소인데, 대표적으로 superoxide(O2-), hydrogen peroxide(H2O2) 및 hydroxy radical(•OH)이 있다.25) NADPH oxidase는 superoxide를 생산하는 효소 단백질로 세포막 단백질 p22phox, NOX2 (gp91phox)와 세포질 단백질 p40phox, p47phox, p67phox, Rac 1/ 2로 구성되어있다.26) 산화와 같은 외부 자극이 발생하면p47phox가 인산화되고 세포막 단백질 p22phox와 결합하면서 NADPH 산화효소 시스템이 활성화되어 superoxide를 생성한다.27) 위 조직의 gp91phox, p22phox 및 p47phox의 발현을 확인한 결과 CM을 투여한 군에서 모든 인자의 발현이 유의하게 억제된 것이 확인되었으며, 이는 투여농도에 의존적으로 억제율이 높게 나타났다(Fig. 5).

Nuclear factor erythroid-2-related factor 2(Nrf2)는 항산화작용의 주요 전사인자로 항산화 단백질의 발현조절에 작용한다. 친전자체나 ROS와 같은 외부자극에 노출되면 Nrf2와 결합하고 있던 억제제 kelch-like ECH-associated protein1(Keap1)과 해리되면서 핵 내 전사가 일어난다. Nrf2는 핵에서 DNA 프로모터에 결합하여 heme oxygenase-1(HO-1), catalase 및 glutathione peroxidase-1/2(GPx-1/2)와 같은 항산화 단백질의 생성을 활성화시킨다.28) 위 조직에서 핵 내 Nrf2 의 발현을 확인한 결과 대조군 대비 CM 투여군에서 증가하였으며, 특히 CMH군에서는 정상군과 유사한 정도의 발현이 나타났다. 또한 세포질 내 Keap1의 발현은 대조군 대비 CM 투여군에서 크게 감소한 것으로 확인되었다(Fig. 6). 항산화 효소 HO-1, catalase 및 GPx-1/2의 발현은 CM의 투여에 의해 증가하였으며 투여농도에 의존적이게 발현이 증가하는 경향을 보였다(Fig. 7).

결론

본 연구는 Cotoneaster mongolicus Pojark. 추출물(CM)의 HCl/ethanol 유도 위염에 대한 보호효과를 평가하였다. 그 결과, CM은 NF-κB의 핵 내 전이를 억제하여 염증반응을 조절함과 동시에 Nrf2 활성화를 통해 염증을 완화시키는 것으로 판단되며, 이러한 결과는 CM은 위 보호를 위한 우수한 소재로 사용될 수 있을 것임을 시사한다.

사사

본 논문은 농촌진흥청 연구사업(과제번호: PJ015272012022) 의 지원을 받아 수행되었습니다.

References

  1. Jainu, M. and Devi, C. S. (2006) Antiulcerogenic and ulcer healing effects of Solanum nigrum (L.) on experimental ulcer models: possible mechanism for the inhibition of acid formation. J. Ethnopharmacol. 104: 156-163. https://doi.org/10.1016/j.jep.2005.08.064
  2. Yeo, D., Hwang, S. J., Song, Y. S. and Lee, H. J. (2021) Humulene inhibits acute gastric mucosal injury by enhancing mucosal integrity. Antioxidants 10: 761.
  3. Nomura, A., Stemmermann, G. N., Chyou, P. H., Perez-Perez, G. I. and Blaser, M. J. (1994) Helicobacter pylori infection and the risk for duodenal and gastric ulceration. Ann. Intern. Med. 120: 977-981. https://doi.org/10.7326/0003-4819-120-12-199406150-00001
  4. Mousa, A. M., El-Sammad, N. M., Hassan, S. K., Madboli, A. E. N. A., Hashim, A. N., Moustafa, E. S., Bakry, S. M. and Elsayed, E. A. (2019) Antiulcerogenic effect of Cuphea ignea extract against ethanol-induced gastric ulcer in rats. BMC Complement Altern. Med. 19: 345.
  5. Al-Quraishy, S., Othman, M. S., Dkhil, M. A. and Abdel Moneim, A. E. (2017) Olive (Olea europaea) leaf methanolic extract prevents HCl/ethanol-induced gastritis in rats by attenuating inflammation and augmenting antioxidant enzyme activities. Biomed Pharmacother. 91: 338-349. https://doi.org/10.1016/j.biopha.2017.04.069
  6. Lee, A. R., Lee, J. Y., Kim, M. Y., Shin, M. R., Shin, S. H., Seo, B. I. and Roh, S. S. (2015) Protective effects of a Lycium chinense ethanol extract through anti-oxidative stress on acute gastric lesion mice. Kor. J. Herbol. 30: 63-68.
  7. Park, H. W. and Jeong, H. Y. (2009) Safety profile of acid suppression with proton pump inhibitors. Korean J. Helicobacter Up Gastrointest. Res. 9: 11-17.
  8. Jalilzadeh-Amin, G., Najarnezhad, V., Anassori, E., Mostafavi, M. and Keshipour, H. (2015) Antiulcer properties of Glycyrrhiza glabra L. extract on experimental models of gastric ulcer in mice. Iran J. Pharm. Res. 14: 1163-1170.
  9. Wang, C., Peng, D., Liu, Y., Wu, Y., Guo, P. and Wei, J. (2021) Agarwood alcohol extract protects against gastric ulcer by inhibiting oxidation and inflammation. Evid. Based Complement Alternat. Med. 2021: 9944685.
  10. Kicel, A. (2020) An overview of the genus Cotoneaster (Rosaceae): phytochemistry, biological activity, and toxicology. Antioxidants 9: 1002.
  11. Odontuya, G. (2019) Phytochemicals in leaves of Cotoneaster mongolica, their antioxidative, and acetylcholinesterase inhibitory activity. Mong. J. Chem. 20: 1-6. https://doi.org/10.5564/mjc.v20i46.1235
  12. Chang, C. S. and Jeon, J. I. (2003) Leaf flavonoids in Cotoneaster wilsonii (Rosaceae) from the island Ulleung-do, Korea. Biochem. Syst. Ecol. 31: 171-179. https://doi.org/10.1016/S0305-1978(02)00064-9
  13. Islam, T., Hasan, M. R., Roy, A., Islam, M. S., Uddin, M. A., Islam, M. A., Neon, M. N. and Rana, M. S. (2015) Screening of in-vitro antioxidant, brine shrimp lethality bioassay and antimicrobial activities of extracts of Bridelia retusa (L.) Spreng. fruit. Int. J. Pharm. 5: 1058-1067.
  14. Jiao, H. and Wang, S. Y. (2000) Correlation of antioxidant capacities to oxygen radical scavenging enzyme activities in blackberry. J. Agric. Food Chem. 48: 5672-5676. https://doi.org/10.1021/jf000765q
  15. Blois, M. S. (1958) Antioxidant determinations by the use of a stable free radical. Nature 181: 1199-1200. https://doi.org/10.1038/1811199a0
  16. Re, R., Pellegrini, N., Proteggente, A., Pannala, A., Yang, M. and Rice-Evans, C. (1999) Antioxidant activity applying an improved ABTS radical cation decolorization assay. Free Radic. Biol. Med. 26: 1231-1237. https://doi.org/10.1016/S0891-5849(98)00315-3
  17. Noh, J. H., Lee, H. J., Jang, J. H., Yang, B. D., Woo, K. W., Seo, J. W., Kim, S. Y., Cho, H. W. and Jung, H. K. (2019) Protective effect of water extract of Leonurus japonicus Houttuyn against HCl/EtOH-induced gastric mucosal damage and genotoxicity evaluation using micronucleus test. Korean J. Plant Res. 32: 282-289.
  18. Lee, Y. M., Hwang, I. Y., Lee, E. B. and Jeong, C. S. (2011) Antigastritic and antiulcerative effects of Cirsium japonicum var. ussuriense extract and fractions. J. Pharm. Soc. Korea 55: 160-167.
  19. Berardi, R. R. (2000) A critical evaluation of proton pump inhibitors in the treatment of gastroesophageal reflux disease. Am. J. Manag. Care. 6: S491-S505.
  20. Kim, S. A., Oh, J., Choi, S. R., Lee, C. H., Lee, B. H., Lee, M. N., Hossain, M. A., Kim, J. H., Lee, S. and Cho, J. Y. (2021) Gastritis and anti-lung injury effects of pine tree ethanol extract targeting both NF-κB and AP-1 pathways. Molecules 26: 6275.
  21. Chiu, H. F., Venkatakrishnan, K., Golovinskaia, O. and Wang, C. K. (2021) Gastroprotective effects of polyphenols against various gastro-intestinal disorders: A mini-review with special focus on clinical evidence. Molecules 26: 2090.
  22. Kim, M. J., Kim, J. H., Lee, S. H., Cho, E. J. and Kim, H. Y. (2018) Determination of radical scavenging activity of Aster yomena (Kitam.) Honda. J. Korea Acad. Ind. Coop. Soc. 19: 402-407. https://doi.org/10.5762/KAIS.2018.19.9.402
  23. Seo, K. H., Kim, Y. H., Lee, Y. M., Ghosh, M., Park, K. M., Park, D. H., Kim, J. S. and Lim, B. O. (2017) Evaluation of anti-oxidant and anti-inflammatory activities of Ganoderma lucidum cultured on hulled barley. Korean J. Medicinal Crop Sci. 25: 29-36. https://doi.org/10.7783/KJMCS.2017.25.1.29
  24. Kim, S. H., Lee, J. A., Lee, A. R., Shin, M. R., Park, H. J. and Roh, S. S. (2019) Protective effect of Gardenia fruit ethanol extract in HCl/ethanol-induced acute gastritis. J. Korean Soc. Food Sci. Nut. 48: 198-205. https://doi.org/10.3746/jkfn.2019.48.2.198
  25. Halliwell, B. and Gutteridge, J. (1999) Free radical, other reactive species and disease. Free Radic. Biol. Med. 1: 617-783.
  26. Rotrosen, D., Yeung, C. L. and Katkin, J. P. (1993) Production of recombinant cytochrome b558 allows reconstitution of the phagocyte NADPH oxidase solely from recombinant proteins. J. Biol. Chem. 268: 14256-14260. https://doi.org/10.1016/S0021-9258(19)85235-3
  27. Huang, J. and Kleinberg, M. E. (1999) Activation of the phagocyte NADPH oxidase protein p47(phox). Phosphory- lation controls SH3 domain-dependent binding to p22(phox). J. Biol. Chem. 274: 19731-19737. https://doi.org/10.1074/jbc.274.28.19731