Esculetin Suppresses the Growth and Proliferation of A431 Skin Cancer Cells via the MAPKs Pathway

A431 skin cancer cell에서 Esculetin의 MAPKs pathway를 통한 항암 효과

Abstract

As the incidence of skin cancer increases every year, non-surgical treatment methods for cancer are being sought. Esculetin, a natural dihydroxy coumarin, is attracting attention as a therapeutic agent for certain diseases, such as cancer, based on its broad pharmacological activity. In this study, the anticancer ability of esculetin was evaluated using the epidermoid carcinoma cell line A431. As a result of evaluating the apoptosis ability of esculetin by MTT assay, apoptosis was observed in a time-concentration-dependent manner regardless of the presence or absence of FBS. As a result of quantitative real-time PCR, esculetin reduced cyclin D1 mRNA in a time-concentration-dependent manner. In addition, as a result of western blotting, esculetin significantly inhibited phosphorylation of ERK, JNK, and p38 in a concentration-dependent manner. The results of this study suggest that esculetin has the potential to be used as an effective natural medicine for the treatment of skin cancer.

피부암의 발병률은 최근 수십 년 동안 빠르게 증가하여 매년 2백만 건 이상 발생한다. ¹⁾ 그 중 비흑색종 피부암 (Non-melanoma Skin Cancer; NMSC)은 가장 흔한 유형의 암이며, UV에 노출되는 신체 부위에서 자주 발생한다. 하지만 UV 노출의 유해한 영향에 대한 대중의 인식이 높아짐에도 불구하고 발병률은 계속 증가하고 있다. ^1,2) NMSC 중 편평 세포 암종(squamous cell carcinoma; SCC)은 기저 세포 암종(basal cell carcinoma; BCC)에 비하여 전이 위험이 더 높고, 머리와 목과 같은 눈에 보이는 부위에서 상당한 이환율을 보이며 결과적으로 미용, 기능적 손상으로 인해 수억 달러의 치료 비용을 야기할 수 있다. ^1,3) 또한 NMSC의 80%는 60세 이상의 고령층에서 발생함에 따라 고령 환자들의 수술 진행이 어려워지면서 예방과 치료를 위한 새로운 비수술적 치료 방안이 모색되고 있다.^1,2)

항암의 대표적인 신호 전달 경로인 MAPKs 경로 중 ERK(extracellular signal-regulated kinase)는 세포 증식, 분화, 생존 및 운동성과 같은 다양한 세포 반응에 관여한다.⁴⁾ 과활성화된 ERK 신호전달은 암의 85% 이상에서 발견되며, ERK의 지속적인 활성화는 cyclin D1 발현을 유도하여 세포 주기 진행을 촉진하는 것으로 여러 연구에서 입증된 바있다.^5,6) ERK 활성화의 유도는 UVB로도 이루어지며, 이는 UV 유발 피부암 발병에 기여한다.⁷⁾ 이 밖에도 ERK의 활성화는 CDK(cyclin dependent kinases)활성 증가, CDKIs(CDK inhibitors)억제 및 G1기에서 많은 항증식 유전자들의 억제를 통해 G1/S 전환을 유도하여 세포 과증식을 야기한다.⁸⁾

JNK(c-Jun N-terminal kinases)와 p38의 활성화는 UV 매개 피부 발암의 주요 기전이며, 이들의 비정상적인 활성화는 SCC에서 자주 관찰된다.⁹⁾ Dimethylbenz[a]anthracene 및 12-O-tetradecanoyl phorbol-13-cetate(DMBA-TPA)를 사용한 피부 발암 마우스 모델에서, JNK2 결핍은 피부암 발병에 저항성을 나타내었다. 이는 JNK2가 피부암 촉진제로 기능한다는 것을 나타낸다.^9,10) 또한, UVA가 조사된 HaCaT 세포에서 p38 inhibitor 처리는 염색질 응축, 핵 단편화, 세포 자멸체 형성 및 caspase-3 절단과 같은 전형적인 apoptosis 특징을 보였다. 반면 p38 inhibitor 없이 UVA 조사만으로는 유의한 세포사멸이 발생하지 않았다.¹¹⁾ 이와 일치하게 태양 UV 유도 발암 마우스 모델에서 p38 억제는 더 적은 수의 종양을 생성하는 것으로 나타났다.¹²⁾ Cyclin D1 또한 SCC에서 최대 80% 과발현되며, cyclin D1의 억제는 SCC 세포주에서 in vitro 및 in vivo 모두에서 SCC 성장을 억제하여 apoptosis를 유도하는 것으로 알려졌다.¹³⁾ 따라서 JNK, p38 및 cyclin D1의 억제는 SCC를 약화시키는 데 기여할 수 있다.

Esculetin은 Fraxinus rhynchophylla hance 줄기 껍질에 다량 분포하는 6,7-dihydroxy coumarin으로, 항염, 항응고제, 항산화, 항균, 항종양 효과 등 광범위한 약리학적 활성을 지니는 것으로 알려져 있다. ¹⁴⁾ 더불어 인간 결장암,¹⁵⁾ 췌장암,¹⁶⁾ 전립선암¹⁷⁾에서 세포 주기 정지, 항증식 및 세포 사멸을 유도하여 항암 효과를 드러내 천연 항암제로서의 가능성이 제시되었다. 특히 esculetin은 인간 악성 흑색종 세포 G361에서 cyclin D1, caspase-3, PARP 등의 발현을 조절하여 흑색종 피부암 치료제로 제안되었지만,¹⁸⁾ SCC에서의 항암 기전은 밝혀진 바가 없다. 따라서 본 연구에서는 인간 편평 상피암(SCC) 세포주인 A431을 사용하여 esculetin의 항암 효과 기전을 밝혀내고자 한다.

재료 및 방법

실험재료 및 세포 배양 − A431 cell line은 한국세포주은행(Korean cell line bank, Korea)에서 분양 받아 사용하였다. 세포 배지는 RPMI Media 1640(Welgene, USA)에 10% fetal bovine serum(FBS, GenDepot, USA)과 1%의 penicillin/streptomycin(GenDepot, USA)을 첨가하여 제조하였다. 세포는 37℃, 5% CO₂ 조건으로 1~2 일 주기마다 신선한 배지로 교체하여 배양하였으며, 본 연구에 사용된 esculetin은 sigma aldrich에서 구매하였다. Western blotting에 사용한 모든 항체는 cell signaling technology에서 구매하였으며, 3000:1 비율로 tris buffered saline with tween 20(TBST)에 희석하여 실험하였다.

Esculetin의 피부암 세포 사멸능 평가 − Esculetin의 A431 사멸능 평가는 MTT assay로 진행하였다. A431을 96 well plate에 7 × 10³ cells/well이 되도록 분주한 뒤 37℃, 5% CO²조건에서 24 시간 동안 안정화하였다. RPMI Media 1640에 10% FBS를 첨가하고 농도별 esculetin을 세포에 처리하여 24, 48 및 72 시간 동안 배양하였다. 0% FBS는 아무것도 첨가하지 않은 RPMI Media 1640를 사용하였다. 이후 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide (Bio basic, Canada)를 처리하고 3 시간 동안 반응한 후 dimethyl sulfoxide(Bio basic, Canada)로 세포를 용해시켜 spectrophotometer를 이용하여 570 nm에서 흡광도를 측정하였다.

Quantitative real-time PCR(qPCR)을 통한 cyclin D1 mRNA 발현 측정 − Esculetin의 A431 증식 억제능을 평가하기 위해 qPCR을 진행하였다. A431을 6 well plate에 4 ×10⁶ cells/well이 되도록 분주한 뒤 37℃, 5% CO² 조건에서 24 시간 동안 안정화하였다. 24 시간 후 10% FBS 및 0% FBS에 농도별 esculetin을 세포에 처리하고 실험 조건에 따라 배양하였다. 이후 trizol reagent(Ambion, USA)를 사용하여 RNA를 추출하고 정량한 뒤 cDNA 합성 kit(revertra ACE-A-, Toyobo, Japan)를 사용하여 RNA를 cDNA로 합성하였다. 합성된 cDNA와 taqman master mix(Thermo fisher, USA) 10 μL, primer 1 μL, DEPC 4 μL를 혼합하여 qPCR을 진행하였다. qPCR은 thermo fisher 사의 quantstudio 1을 이용하였으며, 실험에 사용한 probe 및 primer sequence는 각각 Table I과 Table II에 나타내었다.

Table I. Gene name and assay ID number in real-time qPCR analysis

Table II. Primer sequences in real-time qPCR analysis

Western blotting을 이용한 항암 관련 단백질 발현 측정 − 항암과 관련된 대표적인 pathway인 MAPKs, 세포 사멸 유발 단백질 caspase-3 및 세포 주기 진행 단백질 cyclin D1의 발현량을 western blotting으로 확인하였다. A431을 6 well plate에 5 × 10⁶ cells/well이 되도록 분주한 뒤 37℃, 5% CO² 조건에서 24 시간 동안 안정화하였다. 24 시간 후 10% FBS 및 0% FBS에 농도별 esculetin을 세포에 처리하고 실험 조건에 따라 배양하였다. 상층액을 제거하고 ripa lysis and extraction buffer(Thermo fisher, USA)를 이용하여 얻은 단백질을 BCA assay(Thermo fisher, USA)를 이용하여 정량하였다. 정량한 단백질은 5X SDS-PAGE loading buffer (Biosesang, Korea)를 사용하여 전기 영동 한 후 transfer 하였다. 이후 5% skim milk(BD bio, USA)로 1 시간 동안 blocking 한 후 1차 항체 첨가 후 shaker에서 over night하였다. TBST를 사용하여 5 분 단위로 3~4 회 반복 washing 후 2차 항체를 첨가하고 2 시간 동안 shaking 해주고 TBST로 washing 후 단백질 발현을 확인하였다. 실험에 사용한 항체들은 Table III에 나타내었다.

Table III. Antibody name and assay ID number in western blotting analysis

통계 분석 − 본 연구 데이터는 3 회 반복 실험하였으며 student t-test를 이용하여 비교 분석하였다. 모든 데이터는 평균 ± 표준편차로 표시하였으며, 통계적 유의수준은 *p <0.05, **p<0.01, ***p<0.001로 검증하였다. Western blotting 시험에서 band의 intensity는 image J(Wayne rasband national institutes of health, USA)를 이용하여 분석하였다.

결과 및 고찰

A431에서 esculetin의 세포 사멸능을 알아보기 위해 MTT assay를 수행하였다. Esculetin을 A431에 10% FBS 유무에 따라 0.2, 0.4, 0.8 및 1 mM의 농도로 24, 48 및 72 시간 동안 처리하였다. 그 결과 피부암 세포의 생존율이 농도 및 시간에 따라 크게 감소하였다(Fig. 1). Esculetin을 0% FBS 조건에서 24시간 동안 처리하였을 때 IC₅₀이 0.88 mM로 나타나 추후 실험을 최고 농도 0.8 mM로 진행하였다. MTT는 노란색을 띠며, 활성 세포의 미토콘드리아에 있는 탈수소효소 효소에 의해 보라색 불용성 formazan으로 전환된다. 이 formazan crystal은 540-570 nm에서 dimethyl sulfoxide로 용해 후 spectrophotometer로 측정한다. MTT 시험법은 최근 난소암 세포 독성 효과를 평가하는 데 쓰인 바 있다. ¹⁹⁾이어 A431에서 esculetin의 cyclin D1 mRNA 억제능을 qPCR로 확인하였다. Esculetin을 serum-free RPMI에 용해하여 1, 2, 4 및 8시간 동안 A431에 처리 후 cyclin D1 mRNA 발현량을 확인한 결과, control 군과 비교하여 각각 47 ± 0.11, 92, 97 및 99% 억제능을 보였다(Fig. 2A). 또한, esculetin 농도에 따른 cyclin D1 mRNA 발현량을 확인하고자 RPMI 1640에 10% FBS 첨가 유무에 따라 esculetin을 0.2, 0.4 및 0.8 mM 농도로 1 시간 동안 처리하였다. 그 결과, 0% FBS 조건에서는 control 군과 비교하여 모든 농도에서 각각 67 ± 0.12, 65 ± 0.1 및 73%의 억제능을 보였으며, 10% FBS 조건에서는 0.4 및 0.8 mM 농도에서 각각 41 ± 0.11 및 41 ± 0.12%의 억제능을 확인하였다(Fig. 2B). Cyclin D1 mRNA 발현 감소에 따른 cyclin D1 및 caspase-3의 protein 발현을 확인하기 위하여 western blotting을 수행하였다. RPMI 1640에 esculetin을 0.8 mM 농도로 용해한 후 A431에 1, 4, 8, 20 및 24 시간 동안 처리하였다. 그 결과, cyclin D1 protein 발현량은 control 군과 비교하여 각각 66, 90, 97 및 98% 억제되었으며 이는 Fig. 2A 결과와 유사하였다. Caspase-3의 active form인 cleaved Caspase-3는 esculetin 처리 후 24 시간에 control 군과 비교하여 7배 증가하여 높은 활성화를 보였다(Fig. 3). 또한, esculetin의 농도에 따른 cyclin D1 및 cleaved Caspase-3의 protein 발현량을 보기 위하여 western blotting을 수행하였다. RPMI 1640에 10% FBS 유무에 따라 esculetin을 0.2, 0.4 및 0.8 mM 농도로 용해한 후 A431에 1 시간 및 24 시간 동안 처리하였다. 그 결과, 0% FBS 조건에서 cyclin D1 protein 발현량은 control 군과 비교하여 모든 농도에서 억제되었으며, 10% FBS 조건에서는 0.4 및 0.8 mM 농도에서 유의한 발현 억제를 보였다. 또한 caspase-3의 active form인 cleaved caspase-3는 0% FBS 및 10% FBS 조건에서 모두 유의하게 증가하였음을 확인하였다(Fig. 4). 더불어 암에서 가장 잘 알려진 pathway인 MAPKs 발현 억제 효과를 측정하기 위해 western blotting을 수행하였다. RPMI 1640에 10% FBS 유무에 따라 esculetin을 0.2, 0.4 및 0.8 mM 농도로 용해한 후 A431에 15 분 동안 처리하였다. 그 결과, 0% FBS 조건에서 ERK는 control 군과 비교하여 45, 70 및 74%, JNK는 70, 76 및 77%, p38은 47, 63 및 83%의 억제능을 보였다. 또한 10% FBS 조건에서 ERK control 군과 비교하여 27, 25 및 29%, JNK는 57, 53 및 74%, p38은 11,29 및 26%의 억제능을 보여 0% 및 10% FBS 조건 모두에서 유의한 MAPKs 발현 감소가 나타남을 확인하였다(Fig. 5).

Fig. 1. Esculetin suppresses skin cancer cell viability and growth. Cell viability was assessed for 24, 48, and 72 h in the (A) 0% FBS or (B) 10% of FBS using serum-free RPMI with increasing concentrations of esculetin (0.2, 0.4, 0.8 and 1 mM). Controls were treated with serum-free RPMI without or with 10% FBS, respectively. Indicates a significant difference from the control (*p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001).

Fig. 2. Esculetin suppresses cyclin D1 at the mRNA level in a time and concentration dependent manner. (A) Esculetin 0.8 mM was treated with serum-free RPMI to A431 cells for 1, 2, 4 and 8 hours. Control treated only the serum-free RPMI. (B) Esculetin (0.2, 0.4 and 0.8 mM) was treated with serum-free RPMI in A431 cells for 1 hour in either 0% FBS or 10% of FBS conditions. Controls were treated with serum-free RPMI without or with 10% FBS, respectively. Indicates a significant difference from the control (*p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001).

Fig. 3. Esculetin suppresses skin cancer cell cycle progression and induces apoptosis in a time dependent manner. (A) Esculetin 0.8 mM was treated with serum-free RPMI to A431 cells for 1, 4, 8, 20 and 24 hours. Control treated only the serum-free RPMI. (B) Analysis data using image J. Indicates a significant difference from the control (***p < 0.001).

Fig. 4. Esculetin suppresses skin cancer cell cycle progression and induces apoptosis in a concentration dependent manner. (A) Esculetin (0.2, 0.4 and 0.8 mM) was treated with serum-free RPMI in A431 cells for 1 hour (cyclin D1) or 24 hour (caspase-3 and cleaved caspase-3) in 0% FBS conditions. (B) Analysis data for 0% FBS condition using Image J. (C) Esculetin (0.2, 0.4 and 0.8 mM) was treated with serum-free RPMI in A431 cells for 1 hour(cyclin D1) or 24 hour(caspase-3 and cleaved caspase-3) in 10% of FBS conditions. (D) Analysis data for 10% FBS condition using Image J. Controls were treated with serum-free RPMI without or with 10% FBS, respectively. Indicates a significant difference from the control (**p < 0.01, ***p < 0.001).

Fig. 5. Esculetin consequently suppresses skin cancer through the MAPKs pathway. (A) Esculetin (0.2, 0.4 and 0.8 mM) was treated with serum-free RPMI in A431 cells for 15 minutes in 0% FBS conditions. (B) Analysis data for 0% FBS condition using Image J. (C) Esculetin (0.2, 0.4 and 0.8 mM) was treated with serum-free RPMI in A431 cells for 15 minutes in 10% FBS conditions. (D) Analysis data for 10% FBS condition using Image J. Controls were treated with serum-free RPMI without or with 10% FBS, respectively. Indicates a significant difference from the control (***p < 0.001).

포유 동물 세포는 G1기에서 S기로의 세포 주기 진행을 위해 CDK4/6의 allosteric regulators로 기능하는 3개의 cyclins D(D1, D2 및 D3)를 인코딩한다. cyclin D와 CDK가 결합하면 cyclinD-CDK4/6 복합체가 형성되며, 이 과정은 정지된 세포가 세포 주기 진입을 하기 위한 필수 단계이다. 인간 암에서 cyclin D1은 cyclin D2 및 D3에 비하여 조절 장애가 빈번하며, cyclin D1의 과발현은 주요 세포 체크포인트 우회를 통해 비정상적인 세포 조직 성장을 초래한다. ²⁰⁾ SCC에서 cyclin D1 gene은 최대 50%, protein은 최대 80% 과발현된다. 이와 관련하여 6개의 SCC 세포주에서 antisense cyclin D1 형질 도입은 세포 증식을 유의하게 억제하였으며, cyclin D1 protein의 감소와 유사하게 각 세포주에서 세포자멸사가 검출된 연구 결과가 보고되었다. 더불어 antisense cyclin D1이 처리된 종양에서도 세포자멸사가 두드러졌다. 따라서 cyclin D1의 억제는 SCC의 성장을 억제하여 세포사멸을 유도할 수 있다. ¹³⁾ 세포사멸(apoptosis)은 세포 외 요인과의 상호작용과 세포 내 요인 모두에 의해 유발될 수 있다. Apoptosis 유도제인 caspases는 구조, 기능 및 기질 특이성에 따라 염증성 및 세포자멸사 caspase로 세분화된다. 그중 세포자멸사 caspase인 initiator caspases(caspase-2, 8, 9, 10)는 다양한 세포 스트레스 신호에 자극을 받는다. 이러한 pro-apoptotic 과정은 미토콘드리아 막간 공간에서 cytochrome c와 같은 apoptogenic factors를 세포질 내로 방출한다. 그 후, apoptosome complex(cytochrome c/Apaf-1/caspase-9) 가 형성되어 effector caspase(caspase-3, 6, 7)의 활성화를 유발한다. 활성화된 caspase-3는 caspase-activated DNAse (ICAD) inhibitor를 절단하여 caspase-activated DNAse(CAD)의 활성화를 초래한다. 이러한 CAD의 활성화는 DNA를 절단함으로써 염색질 응축 및 DNA 단편화를 유도한다. 이는 apoptosis가 진행되는 세포의 일반적인 특징이다.²¹⁾

피부암 발병의 가장 큰 요인은 피부의 지속적인 UV 노출이다. UVA(320–400 nm)는 ROS(reactive oxygen species) 생성을 통해 양성 종양 및 악성 암을 유발할 수 있는 노화광선이며, UVB(280–320 nm)는 비흑색종 및 흑색종 피부암을 비롯한 다양한 피부 질환의 원인이 된다. 특히 UVB는 MAPKs의 강력한 유도제로, 그 중 ERK는 구강, 신장, 간, 전립선 및 유방 암종 등 다양한 암에서 발견되어 암 예방에서 주목받는 cascade이다.^6,7) JNK는 UVA와 UVB 모두에 의해 활성화되며, 태양 UV를 불멸화된 정상 인간 각질세포주(N/TERT-1)에 처리하였을 때 JNK와 하위 인자 c-Jun이 15분 만에 활성화되어 4 시간까지 지속될 수 있음이 보고되었다.¹²⁾ 또한, p38은 UVA 조사된 인간 피부 섬유아세포, 마우스 표피 세포(JB6) 및 여러 세포 유형에서 활성화되며, 특히 불멸화된 인간 각질세포(HaCaT)에서 UVA 조사 시 5분 이내로 p38 활성화가 진행되었다. 이 외에도 UVB로 유도한 피부 발암이 대조군 마우스와 비교하여 dominant negative p38α 형질 전환 마우스에서 유의하게 감소한 연구 결과가 보고된 바 있다.¹⁴⁾ 따라서 피부암에서 ERK, JNK 및 p38 활성화의 감소는 피부암을 예방하는 효과적인 전략이 될 수 있다.

Fig. 6. Esculetin can suppresses the growth and proliferation of skin cancer by inhibiting the MAPKs pathway.

결론

본 연구에서는 피부암 세포 A431에서 esculetin의 항암 효과를 확인하였다. Esculetin은 A431에서 FBS 유무에 상관없이 시간 및 농도 의존적으로 apoptosis를 유발하였다. 또한, cyclin D1의 mRNA 및 protein을 시간 및 농도 의존적으로 억제하였다. Apoptosis 유도제인 caspase-3의 활성화는 esculetin 처리 후 24 시간에 나타났다. 더불어 esculetin의 농도에 따른 cyclin D1의 감소와 cleaved caspase-3의 발현증가, MAPKs의 유의한 감소는 esculetin이 피부암 치료를 위한 효과적인 천연 의약품으로 사용될 가능성이 있음을 시사한다.