Development and Utilization of KASP Markers for the Identification of Three Types of Ephedra Herbs

마황 3종 판별을 위한 KASP 마커 개발과 활용

Abstract

Ephedra herbs are defined as stem of Ephedra sinica , Ephedra intermedia and Ephedra equisetina in the Korean Pharmacopoeia. It is important to use pure herbs to derive the safety and efficacy of herbal medicine. However, the identification of these herbs by conventional taxonomic methods is difficult. Recently, many studies have applied these DNA barcoding for the identification of herbal medicinal species using standard DNA markers. In this study, we report a case study in which the identification of Ephedra species was done by DNA barcoding. For identification of Ephedra species, 17 samples were collected, and a reference DNA barcode library was developed using 6 markers (rbcL, matK, ITS2, ycf1, ycf3, and rpoC2). To develop KASP-SNP markers, we selected 4 markers (ycf1, ycf3, rpl2, and rbcL), which were able to distinguish three Ephedra species. In the result, the specific markers for each of the three Ephedra were clustered into FAM-positive section, whereas non-targeted plants were clustered either HEX-positive or negative section. Therefore, we have developed KASP assay that allow rapid and easy Ephedra species identification using three KASP markers.

대한민국 약전에서 마황은 마황과에 속하는 초마황 (Ephedra sinica Stapf), 중마황(Ephedra intermedia Schrenk et C.A.Mey.), 목적마황(Ephedra equisetina Bunge)의 초질경으로 정의한다. ¹⁾ 마황은 2019년에는 952톤이 중국, 파키스탄, 베트남, 몽골 등에서 국내로 수입되었으며 2020년에는 한약재 수입액 4위를 차지할 정도로 국내에서 사용량이 많은 한약재 중 하나이다. ²⁾ 마황속 식물은 아시아, 아메리카, 유럽, 북아프리카에 약 67종이 분포하며 중국에는 14종, 파키스탄에는 9종, 몽골에는 9종이 자생한다. ^4-6) 따라서 수입 과정에서 마황이 아닌 마황속 식물이 마황으로 국내로 유입되어 안전의 사각지대가 발생할 수 있다. 마황에는 에 페드린 알칼로이드(Ephedrine-type alkaloids)를 포함하고 있어 약리 효과를 보이는 것으로 알려져 있다. 하지만 에페드린 알칼로이드는 초마황, 중마황, 목적마황 이외에 다양한 마황속 식물에도 포함되어있으며 종에 따라서 알칼로이드의 종류와 함량, 비율이 다르다. ⁷⁾ 따라서 정확하고 안전한 마황 사용을 위해서는 마황 종을 확인할 수 있는 분석법 확립이 필요하다.

한약재의 기원을 판별하는 방법은 관능검사, ⁷⁾ 이화학적 검사, ⁸⁾ 분자생물학적 검사⁹⁾ 등이 있다. 한약재의 경우 국가별로 기원이 되는 식물을 혼재하여 사용하는 경우가 많으며 모양이나 형태가 유사하지만 다른 식물들도 많다. 또한 건조나 분쇄 등 가공과정을 거쳐 판매되는 경우도 많아 가공 이후에도 위품 판별이 가능한 분자생물학적 검사방법이 한약재 판별법으로 개발되고 있다. 분자생물학적 검사방법으로 마황의 핵유전자구간 18S ribosomal RNA(rRNA)-ITS1-ITS2^{10,11,12,13,14,15)}와 엽록체 유전자구간 trnK, ¹⁰⁾ matK, ⁶⁾ trnLtrnLF, ^12,13) psbA-trnH, ^15,16) chlB¹⁷⁾ 등 다양한 마커를 이용한 종분석 방법에 대해 보고되었다. Xinlian C. 등¹⁸⁾에 따르면 초마황, 중마황, 목적마황에 대해 전장 엽록체 유전체 (Whole chloroplast genome)를 분석하고 mVISTA를 이용해 3종의 유전자 차이가 큰 11개의 구역을 통해 분류할 수 있다고 보고하였다. 본 연구에서는 Kompetitive Allele Specific PCR(KASP) 마커를 이용해 마황속 식물에서 초마황, 중마황, 목적마황을 구별하고자 한다. KASP는 LGC Biosearch Technologies(Teddington, UK)사의 기술로 서로 다른 형광이 붙은 Forward primer를 이용해 단일염기다형성(single nucleotide polymorphism, SNP) 나 삽입-결실(insert-indel)의 유전형 분석(genotyping) 방법으로 유전자 바코드 내의 종에 따른 단일 염기의 다양성에 의해서 종 분석 방법으로 쓸수 있다. ¹⁹⁾ 가공된 한약재나 의약품, 식품의 경우 여러 원료가 혼합되어 있을 수 있다. KASP는 대상원료의 유전자형에 대해 형광을 띄기 때문에 여러 개의 유전자가 혼합된 검체에서도 분석이 가능하는 장점이 있다. 따라서 본 연구에서는 마황속 식물에서 초마황, 중마황, 목적마황에 특이적인 SNP를 찾고 이를 표적하는 KASP 마커를 개발하고자 한다.

재료 및 방법

식물재료 − 마황 3종은 식품의약품안전평가원과 동의보감소재은행에서 분양 받아 사용하였다. 그 외에 마황속 식물이거나 에페드린과 관련된 식물을 허브마을(청주), American Herbal Pharma(Soquel, CA, USA), 한국생명공학연구원 해외생물소재센터에서 구매하여 사용하였다. 식물 재료는 5.8S ribosomal RNA - internal transcribed spacer 2, maturase K(matK), ribulose 1, 5 bisphosphate carboxylase/oxygenase large subunit(rbcL), RNA polymerase beta subunit (rpoC2), YCF1, YCF3 유전자 분석을 통해 종 분석 이후 사용하였다(Table I).

Table I. Voucher specimens of plant raw materials and accession number

DNA추출 − 모든 시료는 tube mill control(IKA, staufen, Germany)를 이용하여 균질화 한 뒤, DNA 추출은 DNeasy Power Plant pro Kit(Qiagen, Hilden, Germany)의 기본 프로토콜에 따라서 진행하였다. 원물의 경우 25 mg, 샘플의 경우 50 mg을 취한 후 450 µL의 solution CD1 및 50 µL의 Solution PS을 가한다. Tissuelyser(Qiagen, Hilden, Germany)를 사용하여 30Hz에서 2분 동안 균질화 후 2분간 14,000 rpm에서 원심 분리한 뒤 상층액을 취해 새 2 mL microcentrifuge tube(eppendorf, Hanburg, German)에 옮긴다. 여기에 200 µL의 Solution CD2 가한 후 vortex mixer를 사용하여 균질화 후 2분간 14,000 rpm에서 원심 분리하여 상층액을 취해 새 2 mL microcentrifuge tube에 옮긴다. 여기에 65°C의 500 µL의 buffer APP 가한 후 vortex mixer를 사용하여 균질화하고 650 µL를 취하여 MB spin column에 넣고 1분간 14,000 rpm에서 원심 분리한다. 통과한 액은 버리고 반복한다. MB spin column에 650 µL의 Buffer AW1를 가한 후 1분간 14,000 rpm에서 원심 분리 후 통과한 액을 버린다. MB spin column에 650 µL의 buffer AW2를 가한 후 1분간 14,000 rpm에서 원심 분리 후 통과한 액을 버린다. 추가로 2분간 16,000 rpm에서 원심 분리 후 MB spin column을 새로운 2 mL microcentrifuge tube에 옮겨 꼽는다. MB spin column에 50 µL buffer EB을 가한 후 실온에서 1분 대기 후 1분간 14,000 rpm에서 원심 분리하고 통과된 DNA는 -4°C에 보관하여 사용한다.

염기서열 분석 − 염기서열분석에 필요한 primer 제작을 위해 Genbank 내식물의유전자데이터를참고하였다. 실험에 사용된 primer sequence는 Table II와 같다. PCR 반응액은 AccPower^® PCR master mix(BIONEER, Daejeon, Korea) 10 µL, 주형 DNA 8 µL, 10 pmol Forward primer 1 µL, 10 pmol Reverse primer 1 µL를 혼합하여 0.2 mL PCR Tubes(Eppendorf, German)에 분주하였다. PCR 조건은 95°C에서 5분동안 초기 변성을 수행한 뒤, 95°C에서 20초간 변성과 62°C에서 20초간 결합과 72°C에서 30초동안 신장하는 과정을 30회 반복하였다. 마지막으로 72°C에서 5분간 신장 반응을 시킨 후 QIAxcel Advaned(QIAGEN, Hilden, Germany), QIAxcel DNA High Resolution Kit, QX Alignment marker 15bp-3Kb, QX DNA Sixe Marker Fx 174/HaeIII를 사용하여 PCR 결과물을 확인하였다. 단일 밴드가 확인된 PCR 결과물은 Macrogen(Seoul, Korea)에 염기서열분석을 진행하였으며 실험결과는 NCBI에 등록하여 accession number를 부여받았다(Table I).

Table II. PCR primer used for sequencing

KASP 분석 − 마황 3종에 대해 특이적인 SNP에 대해 LGC genomics(Teddington, UK) 사에 의해 KASP by Design (KBD)로 KASP assay mix를 제작하였다. KASP 분석을 위한 반응액은 주형 DNA 5 µL, KASP V4.0 2X Master Mix/High ROX(LGC genomics, Teddington, UK) 5 µL, KASP Assay mix 0.14 µL 를 섞어 MicroAmp^TM Optical 96 Well Reaction Plate에 분주하였다. KASP 마커마다 DNA를 대신해 증류수를 넣어 음성대조군으로 사용하였으며 각 KASP 마커마다 대상 식물의 서열 일부를 합성하여 FAM 양성 올리고 뉴클레오타이드로 사용하였으며, 근연종 식물의 서열 일부를 합성하여 HEX 양성 올리고 뉴클레오타이드로 함께 실험하였다. 올리고 뉴클레오타이드는 가운데 1개의 염기서열이 다르고 나머지 앞, 뒤 50bp는 같도록 제작하였으며 제작한 올리고 뉴클레오타이드의 서열은 Table III와 같다. 제작된 올리고 뉴클레오타이드는 3차 증류수를 이용하여 1 fmol의 농도로 희석하여 주형 DNA처럼 5 µL씩 사용하였다. 유전자 증폭 및 분석은 7900 HT real-time PCR system (Applied Biosystems, Waltham, MA, USA)에서 진행하였으며 소프트웨어는 SDS software(Applied Biosystems, Waltham, MA, USA)를 사용하였다. 실험은 LGC genomics(Teddington, UK)에서 제공하는 “Guide to running KASP genotyping on the ABI 7900 instrument”와 동일하게 진행하였으며 증폭 조건은 61°C-55°C touchdown protocol 진행하였다. 실험결과에 따라서 recycling step도 추가로 진행하였다.

Table III. Oligonucleotide sequence

제품에 대한 분석법 적용 − 시중에 유통되고 있는 제품에서의 분석법 적용을 확인하기 위해서 마황이 들어있을 것으로 예상되는 다이어트 제품을 5개와 인터넷 직구를 통해 차 1종을 구매하였다. 시료의 균질화를 위해 막자사발로 갈아 시료를 취하고 분말이나 액상 제품은 일정량을 바로 취하고 캡슐 제품은 캡슐 안의 내용물만 취하여 실험을 하였다. KASP 분석에서는 균질화 된 시료 50 mg을 취하여 DNeasy Power Plant pro Kit(Qiagen, Hilden, Germany)를 사용하여 DNA를 추출하였다. 추출한 NA는 –20°C 이하 냉동실에 보관한 뒤, KASP 분석을 수행하였다.

결과 및 고찰

마황 특이 SNP분석 및 KASP 마커 제작 − 마황에 특이적인 SNP를 찾기 위해 초마황 4개, 중마황 2개, 목적마황 1개, 마황이 아닌 Ephedra 3개(E. viridis 2개, E. torreyana 1개)에 대해 11개의 유전자 구간의 염기서열 분석을 진행하였다. 염기서열 분석결과와 GenBanK에 등록된 염기서열 정보를 바탕으로 ycf3의 324번째 뉴클레오타이드에서 초마황 특이 SNP를, ycf1의 2586번째 뉴클레오타이드에서 중마황 특이SNP를, rpoC2의 2074번째 뉴클레오타이드에서 목적마황 특이 SNP를, rbcL의 103번째 뉴클레오타이드에서 마황속 특이적인 SNP를 찾았다(Table IV). 그리고 4개의 SNP를 표적으로 하는 LGC genomics (Teddington, UK)에 KASP 마커 제작을 의뢰하였다. 모든 KASP 마커는 표적하는 마황과 결합했을 때 FAM 형광 양성을 보이도록 제작되었으며 각각의 프라이머 서열은 Table V과 같다.

Table IV. SNP location and genotype

Table V. Ephedra-specific KASP marker sequence

KASP 마커의 SNP 판별력 확인 − 제작한 KASP 마커가 SNP자리의1개의 염기서열의 차이에 따라 다른 형광값을 나타내는지 확인하기 위해서 Macrogen(Seoul, Korea)에서 단일 가닥의 올리고 뉴클레오타이드를 제작하였다. 실험결과, FAM 양성 올리고 뉴클레오타이드(red triangle)와 KASP 마커가 결합하여 FAM 양성을 띠고 X축에 위치하였으며, HEX 양성 올리고 뉴클레오타이드(blue triangle)와 결합하여 HEX 양성을 띠고 Y축에 위치하였다(Fig. 1). 따라서 제작한 KASP 마커는 SNP 위치에서 서로 다른 형광이 붙여진 2개의 Forward primer가 경쟁 반응을 하며 유전자형에 따라 FAM 또는 HEX 형광을 방출하는 것을 확인하였다. 이에따라 제작한 올리고 뉴클레오타이드는 대상 식물의 DNA를 대신해서 형광값에 대한 양성대조군으로 사용 가능함을 확인하였다.

Fig. 1. KASP assay result on plant raw materials. Four KASP markers analysis 11 Ephera plants. E. sinica (orange cycle, ●) emit FAM on NEFM21ES(a) and NEFM21Ephedra(d). E.intermedia (purple cycle, ●) emit FAM on NEFM21EI(b) and NEFM21Ephedra(d). E. equisetina (green cycle, ●) emit FAM on NEFM21EE(c) and NEFM21Ephedra(d). DW(black triangle, ▲), FAM positive oligo (red triangle, ▲) and HEX positive oligo(blue triangle, ▲) are used as negative and positive controls for fluorescence values and which do not have a direct meaning.

식물 재료에서 마황 판별 − SNP에 대한 분별력을 확인한 KASP 마커를 이용해 마황 3종을 포함한 11개의 마황속 식물에 대해서 KASP 분석을 진행하였다(Table VI). Fig. 1에서는 초마황, 중마황, 목적마황에 대한 KASP 형광값 결과를 나타냈다. 초마황 판별 마커 NEFM21ES는 4개의 초마황과 초마황을대상으로하여합성한 FAM양성올리고(red triangle)에서만 FAM 양성을 보이며 그 외에 중마황, 목적마황, E. viridis, E. torreyana에서 HEX 형광 양성으로 나타났다(Fig. 1(a)). 중마황 판별마커 NEFM21EI는 2개의 중마황과 중마황을 대상으로하여 합성한 FAM양성 올리고(red triangle)에서만 FAM 양성을 보이며 그 외에 초마황, 목적마황, E. viridis, E. torreyana에서 HEX 양성을 나타냈다(Fig. 1(b)).목적마황 판별마커 NEFM21EE는 1개의 목적마황과 목적마황을 대상으로하여 합성한 FAM양성 올리고(red triangle)에서만 FAM 양성을 보이며 그 외에 초마황, 중마황, E. viridis, E. torreyana에서는 HEX 양성으로 나타났다(Fig. 1(c)). 마황속 판별마커 NEFM21EPHEDRA는 초마황, 중마황, 목적마황, E. viridis, E. torreyana과 마황속을 대상으로하여 합성한 FAM양성 올리고(red triangle) 모두에서 FAM 양성을 나타냈다(Fig. 1(d)). KASP 마커의 분석결과값과 염기서열 분석결과가 일치함으로써 마황속 판별마커가 FAM 양성을 나타내며 초마황, 중마황, 목적마황 판별마커 중 하나 이상의 FAM 양성이 확인되면 마황이라고 판단 할 수 있다. 마황속 식물이지만 마황이 아닌 E. viridis, E. torreyana는 NEFM21EPHEDRA에서는 FAM 양성을 나타냈지만 초마황, 중마황, 목적마황 마커에서는 HEX나 음성을 보였다. 따라서 마황속 표적 마커에서 FAM 양성이 나왔으나 마황 3종 표적 마커에서 FAM 음성이 나온다면 Ephedra속 식물 중 마황이 아닌 식물로 판단할 수 있다. 추가적으로 에페드린이 함유되어 있다고 보고된 식물(반하, 주목, 서양민들레, 살구씨, 회향나무)에 대해 KASP 분석을 했을 때 모두 FAM 음성을 나타냈다. 이에 따라 이 연구에서 제작한 4개의 KASP 마커를 이용하여 특이적으로 마황 중 초마황, 중마황, 목적마황 외에 다른 마황속도 감별이 가능하여 마황을 한약재로 쓸 때 마황 종의 감별에 이용이 가능 할 것으로 사료 된다. Cui JF 등¹⁰⁾에 따르면 초마황, 중마황, 목적마황의 에페드린 알칼로이드의 총 함량이 종에 따라서 최대 2배의 차이를 보이기 때문에 마황 중에서도 어떠한 마황을 쓰느냐에 따라서 에페드린 알칼로이드의 양이 차이나며 이에 따라서 약리학적 효능 차이가 나타날 것으로 보이며, Lee 등⁷⁾에서도 안전한 마황의 사용과 약효의 재현성을 위해 마황 기원 종의 감별이 중요성을 이야기하였으며 3개의 마황에 대한 외부 형태 감별 기준을 제시하였다. Plant 5는 초마황과 목적마황의 혼합물로 초마황 판별마커와 목적마황 판별마커가 모두 FAM 양성이 나옴에 따라 두개가 혼합이 되었음을 확인할 수 있었다. 이 경우 일반적인 관능 검사로는 혼입 여부를 확인하기 어렵지만, 이 연구에서 개발한 방법으로 종의 혼입을 판별할 수 있었다. 이에 이 연구에서는 분쇄나 혼합물에서도 마황 종의 판별이 가능한 분자생물학적 기술을 개발하였다 따라서 4개의 KASP 마커를 활용하여 마황의 정확한 종을 확인을 함으로서 안전하게 마황을 사용할 수 있을 것으로 사료 된다.

Table VI. KASP analysis results of raw materials

KASP 마커의 제품 적용성 검토 − 제품에서 KASP 마커의 활용을 위해 다이어트 약 5종과 차 1종을 구매하였다. 다이어트 약은모두 환제제이며 한의원 4곳에서구매하였다. 차는 인터넷 에서 마황차(Ephedra tea)로 검색하여 인터넷 직구로 구매하였다. DHM1,4,5은 초마황 표적마커와 마황속 표적마커에서 FAM 양성을 나타내어 제품 내 초마황이 사용되었다고 판단하였다(Table VII). DHM2는 중마황 표적마커와 마황속 표적마커에서 FAM 양성을 보여 제품 내 중마황이 사용되었다고 판단하였다. DHM3은 초마황 마커와 중마황 마커, 마황속 마커에서 FAM 양성을 보여 초마황과 중마황이 섞인 것으로 판단하였다. DHM 3과 DHM 4는 동일한 한의원에서 구매했지만 처방 단계에 따라서 마황 종류를 다르게 사용하는 것도 확인하였다. 마황은 1990년대부터 체중감량과 신체기능활성화를 위한 건강기능식품과 의약품에 많이 사용되었다. ²⁰⁾ 이 연구에서 구매한 5개의 체중 감량 목적의 다이어트 한약 모두에서 초마황과 중마황이 함유된 것으로 확인되어 체중감량의 목적으로 국내에서 초마황과 중마황이 사용이 되고 있음을 확인하였다.

Table VII. KASP analysis results of diet herbal medicines and food

인터넷 직구를 통해서 구매한 tea 1는 초마황 표적마커와 마황속 표적마커에서 FAM 양성을 나타내어 제품 내 초마황이 확인되었다. 대한민국 식품위생법 상 마황은 건강기능 식품 제조에 사용할 수 없는 원료로 지정되어있지만²¹⁾ 해외 직구를 통해 마황을 식품으로 쉽게 접할 수 있음을 확인하였다. 관세청 조사에 따르면 2021년 해외 직구 수입 품목 중 1위는 건강식품이며²²⁾ 2021년 5월부터 6월까지 해외 특송 및 우편화물로 반입된 식품에 대해 안전성 집중 검사를 실시한 결과, 식품에 사용할 수 없는 의약품 성분 등 부정 물질이 함유된 해외직구식품이 약 11만정을 적발되었다. ²³⁾따라서 해외직구를 통해 마황이 함유된 식품이 국내에 유입 됨으로서 안전의 사각지대가 생길 수 있기 때문에 제품에서 마황의 함유를 확인 할 수 있는 시험법이 필요하다.

본 연구를 통해서 개발된 KASP 마커 4종은 마황속 식물중에서 초마황, 중마황, 목적마황을 판별할 수 있으며 혼합이나 가공된 제품 형태에서도 마황의 함유 여부를 확인할 수 있어 한약재 감별뿐만 아니라 인터넷 직구를 통한 부정 불법 식품을 확인할 수 있는 유용한 시험법으로 활용 가능하다고 생각된다.