Korean Journal of Fisheries and Aquatic Sciences (한국수산과학회지)

The Korean Society of Fisheries and Aquatic Science (한국수산과학회)
권호 표지
DOI QR코드

DOI QR Code

Variation of Antimicrobial Peptide in the Extract of the Hard-shelled Mussel Mytilus coruscus Depending on Boiling

가열 유무에 따른 참담치(Mytilus coruscus) 추출물 내의 항균 펩타이드 변화

  • Lee, Ji-Eun (Department of Food Science and Biotechnology, Kunsan National University) ;
  • Seo, Jung-Kil (Department of Food Science and Biotechnology, Kunsan National University)
  • 이지은 (국립군산대학교 해양과학대학 식품생명공학전공) ;
  • 서정길 (국립군산대학교 해양과학대학 식품생명공학전공)
  • Received : 2022.11.09
  • Accepted : 2022.12.09
  • Published : 2022.12.31
Download PDF
⟨ Previous Next ⟩

Abstract

This study was performed to confirm the optimal extraction method for antimicrobial peptides from the Hard-shelled mussel. Extractions were performed with two processes including 1% HAc/boiling and 1% HAc/non-boiling methods and used extracts for the comparison of the antimicrobial activity, protease stability, action mechanism, AU-PAGE (acid-urea PAGE), and HPLC chromatograms. 1% HAc/boiling extract showed potent antibacterial activities both against Gram-positive and negative bacterium but 1% HAc/non-boiling extract showed antibacterial activity only against Gram-positive bacteria. Treatment of 1% HAc/boiling extract with proteases retained almost antibacterial activity against B. subtilis, but abolished significant antibacterial activity against E. coli D31. Only 1% HAc/boiling extract showed two discrete clearing antibacterial zones including slow migrating and rapid migrating zones. Both extracts showed strong DNA-binding ability but did not show bacterial membrane permeabilizing ability. In comparison of the chromatogram obtained from C18 or cation-exchange HPLC, the eluted peaks from 1% HAc/boiling extract showed high hydrophobic property or absorbance compared to 1% HAc/non-boiling extract, respectively. The concentration of the purified antimicrobial peptide was also higher in 1% HAc/boiling extract than in 1% HAc/non-boiling extract. Our results suggest that the effective extraction condition for antimicrobial peptides from marine invertebrate is boiling process in a weak acetic acid solution (1%).

Keywords

서론

해양무척추동물들은 온도, 압력, 빛 또는 병원성 미생물 등과 같은 환경변화가 빈번하게 일어나는 수생환경에서 서식하고 있으며, 이러한 열악한 서식환경에 적응하기 위한 효과적인 방어체계를 갖추고 있는 것으로 알려져 있다(Menzel et al., 2002). 특히, 굴, 참담치 및 멍게 등과 같은 부착성 해양무척추동물은 환경변화에 따른 면역력 약화에 기인한 병원성 미생물 감염성 증가에 대응하기 위해서 효과적인 1차방어 수단으로서 다양한 선천면역요소들을 함유하고 있다는 것이 보고되어 있다(Menzel et al., 2002). 해양무척추동물은 척추동물과 달리 선천면역만으로 구성된 단일면역체계를 가지고 있으며, 비특이적인 빠른 반응성을 나타내는 다양한 선천면역 구성 요소들이 밝혀지고 있으며, 이러한 요소들에 대한 연구가 활발하게 진행되고 있다(Zasloff, 2002). 해양무척추동물의 대표적인 선천면역 구성요소로는 complement, lectins, clotting factors, 각 종 enzymes, lysozyme, antimicrobial peptide 등과 같은 방어물질들과 phagocytosis 및 inflammation 등과 같은 선천면역반응 등이 알려져 있다(Miyata et al., 1989; Tincu and Taylor, 2004; Wu et al., 2021). 특히, 선천 면역관련 방어물질들 중에서 defensin 및 tachyplesin 등과 같은 항균 펩타이드들은 내성균 유발 가능성이 낮고 미생물을 포함하는 대부분의 생명체에서 1차 방어에서 중요한 역할을 담당하는 천연 항생제로서 차세대 항생제 개발을 위한 후보물질로서 주목을 받고 있는 물질 중의 하나이다(Nakamura et al., 1988; Hancock and Chapple, 1999; Hancock and Scott, 2000; van't Hof et al., 2001; Zasloff, 2002; Wu et al., 2021).

항균 펩타이드는 단백질과 비교해서 상대적으로 짧은 아미노산 길이(10–50개 아미노산)를 가지며, 항균 작용기작에 적합한 physicochemical property (구조, net charge, 양친매성도, 소수성도, pI 등)를 포함하고 있다(Elnagdy and AlKhazindar, 2022). 특히, 항균 펩타이드들은 Lys 또는 Arg을 포함하는 positive net charge를 가지는 염기성 pI를 가지며, 양친매성 α-helix나 β-sheet 구조를 취하는 경향이 높은 것으로 알려져 있다(van't Hof et al., 2001; Izadpanah and Gallo, 2005). 이러한 구조적 특징을 이용하여 항균 펩타이드는 미생물 막과의 상호작용(이온결합과 소수성 상호작용)을 통해서 항균활성을 나타내는 것으로 알려져 있다(Shai, 2002; Zasloff, 2002). 현재까지 보고된 해양무척추동물 유래 항균 펩타이드는 투구게 유래의 tachyplesins II (Miyata et al., 1989), 꽃게 유래의 callinectin (Khoo et al., 1999), 홍합 유래의 Cys-rich AMPs (Charlet et al., 1996), 굴 유래의 AOD (Seo et al., 2005), 전복 유래의 Abhisin (De Zoysa et al., 2009) 등이 있다. 육상 생물과 다르게 병원성 미생물의 감염 위험에 지속적으로 노출되어 있는 부착성 해양무척추동물들은 상대적으로 다양한 항균 펩타이드들을 포함하고 있는 것으로 알려져 있다(Ammerman et al., 1984; Menzel et al., 2002). 따라서 해양무척추동물에 존재하는 다양한 항균 펩타이드들에 대한 연구 범위와 활용 가능성을 확대하기 위해서는 기존까지 알려지지 않은 항균 펩타이드들의 효과적인 추출방법(조건)에 대한 탐색이 필요할 것으로 판단된다(Sperstad et al., 2011).

해양무척추동물에 존재하는 항균 펩타이드를 확보/연구하기 위해서 다양한 추출방법들이 시도되었으며, 추출조직의 상태와 활성물질의 용해도 및 안정성에 따라서 다양한 용매 선택과 추출 조건(온도, pH, salt 첨가 등)들이 적용되어 왔다(Sperstad et al., 2011). 특히, 해양무척추동물의 추출은 대부분 천연의 습시료 상태로 추출과정에 사용되고 있으며, 이러한 시료 상태로 부터 항균 펩타이드를 포함하는 선천면역성 물질을 추출하기 위해서 극성용매가 주로 이용되어 왔다(Haug et al., 2002; Seo et al., 2005; Sperstad et al., 2011). 해양무척추동물로부터 항균 펩타이드를 추출하기 위해서 사용되는 극성용매에는 알코올과 distilled water (D.W.)가 많이 사용되고 있으며, 추출 효율을 향상시키기 위해서 산성 pH, salt 첨가, 단백질분해효소 억제제 첨가 및 가온(heating or boiling) 등이 부가적인 조건도 적용되고 있다(Sperstad et al., 2011). 특히, 약산 조건(5–15% 초산)에서의 boiling 방법은 해양무척추동물 조직으로부터 항균 펩타이드를 추출할 수 있는 가장 간편하고 효과적인 방법으로 알려져 있다(Sperstad et al., 2011). 이전의 연구에서 미국산 굴(Crassostrea virginica)로부터 antibacterial Histone H2B의 추출 및 분리·정제 과정에서 3가지의 추출방법(1% 초산/boiling; 1% 초산/protease inhibitor cocktail, PIC; 1% 초산/PIC/boiling)에 따른 각 추출물의 항균활성, 추출물 내 단백질성 물질조성 및 역상 HPLC (high performance liquid chromatography) 등을 비교한 결과, 가장 효율적인 추출방법은 1% 초산/boiling 방법이라고 보고되었다(Seo et al., 2010). 그러나 이 연구에서는 boiling과 PIC의 영향을 확인했을 뿐 boiling만의 여부에 따른 추출물 내에 존재하는 항균 펩타이드의 변화/차이에 대한 직접적인 비교 연구결과는 보고되지 않았다.

본 연구에서는 부착성 해양무척추동물 중의 하나인 참담치의 면역조직으로부터 boiling 유무에 따른 추출과정을 수행한 후, 추출물의 항균활성 특성 탐색 및 항균 펩타이드 분리·정제과정 중의 전기영동과 크로마토그램 형태를 비교함으로써 추출물에 포함된 항균 펩타이드의 추출과 안정성 유지에 대한 약산(1% HAc) 환경에서 boiling 과정의 유효성을 확인하였다.

재료 및 방법

실험 재료 및 시약

본 실험에 사용한 참담치(Mytilus coruscus)는 전라북도 부안 격포항(Buan, Gyeokpo Port) (2019년 12월)에서 구입하였으며, 살아있는 상태로 실험실로 운반된 후에 아가미와 외투막 조직을 적출하고 추출과정에 사용하였다(Lee and Seo, 2021).

항균활성 측정을 위한 배지성분으로 사용된 tryptic soy broth (TSB) 또는 Luria-Bertani broth (LB)와 sabouraud dextrose broth (SDB) 및 agarose type I (Low EEO Agar)은 Merck사 (Merck, Darmstadt, Germany)와 Sigma사(St. Louis, MO, USA)에서 각각 구입하여 사용하였다. 1% acetic acid (HAc) 제조에 사용된 glacial acetic acid는 Samchun사(Pyeongtaek, Korea)에서 구입하여 사용하였다. 효소처리 실험을 위한 단백질분해효소인 trypsin과 chymotrypsin 및 proteinase K는 Fisher Scientific사(Fairlawn, NJ, USA)에서 각각 구입하여 사용하였다. 세균 내막 투과성 측정을 위해서 사용된 o-nitrophenyl-β-D-galacto-pyranoside (ONPG)는 Sigma사에서 구입하였다. DNA-binding ability 측정에 사용된 100 bp DNA ladder는 Bioneer사(Bioneer Corp., Daejeon, Korea)에서 구입하여 사용하였다. 정제 과정에서 사용된 HPLC용 water와 acetonitrile(CH3CN)은 Tedia사(Fairfield, OH, USA)로부터 구입하였고, 분획에 포함된 salt 제거를 위해 사용된 Sep-Pak C18 cartridge는 Waters사(Miliford, MA, USA)에서 구입하였으며, 그 외의 모든 시약들은 특급을 사용하였다.

조직추출

실험실로 운반된 참담치는 흐르는 수돗물에서 패각에 부착된 오염물을 제거한 후, 아가미(gill)와 외투막(mantle) 조직을 취하여 5 mL volume이 될 때까지 얼음 속의 냉각된 용기에 각각 모았다. 모아진 아가미와 외투막은 두 그룹으로 나눈 후 약산환경(1% acetic acid)에서 각각 두 가지 방법을 이용하여 추출과정을 수행하였다(Fig. 1) (Lee and Seo, 2021). 먼저, 약산 하에서 boiling 추출과정(1% HAc/boiling)을 수행하기 위해서 가온(heating)된 4 배량의 1% acetic acid를 각각의 조직(조직:1% HAc=1:4, v/v)에 첨가하고 100°C에서 5분 동안 끓인 후, 얼음에 보관하여 충분히 냉각시켰다. 반면에 약산 하에서 boiling 과정을 수행하지 않는 추출과정(1% HAc/non-boiling)은 4 배량의 1% acetic acid를 각각의 조직(조직:1% HAc=1:4, v/v)에 첨가하고, boiling 과정은 수행하지 않은 상태로 얼음에 보관하였다. 각각의 조직은 homogenizer (T10 basic ULTRA-TUR-RAX; IKA, Wilmington, NC, USA)를 사용하여 얼음에서 완전히 파쇄시켰다(Speed #6, 2 min, ice). 조직 파쇄액은 4°C에서 20분 동안 7,155 g로 원심분리(VS-550; Vision Scientific, Buchon, Korea)를 행한 후에 상층액을 취해서 항균활성 특성 탐색 및 활성물질의 전기영동과 HPLC chromatogram 비교를 위한 연구에 사용될 때까지 -70℃에 보관하였다(Seo et al., 2005).

KSSHBC_2022_v55n6_875_f0001.png 이미지

Fig. 1. Extraction of the proteinaceous antibiotics from the gill and mantle of the hard-shelled mussel Mytilus coruscus.

항균활성 측정 및 사용 균주

항균활성 측정에는 그람 양성균인 Bacillus subtilis KCTC1021과 그람 음성균인 Escherichia coli D31(미국 North Carolina 주립대 수의과대학 Ed. J. Noga 교수에게 제공받았음)을 사용하였으며, 진균은 Candida albicans KCTC7965를 사용하였다. 항균활성 측정은 서로 다른 배지농도(0.03%, 6%)를 포함한 두 층의 배지를 사용하는 ultrasensitive radial diffusion assay (URDA)법을 이용하였다(Lehrer at al., 1991; Seo et al., 2005). 항균활성 측정에 사용된 각각의 균주를 TSB (세균용) 또는 SDB (진균용)에 접종하고 18시간 동안 37°C에서 preculture를 수행한 후 colorimeter (Product No. 52-1210; BioMerieux, Inc., Durham, NC, USA)를 사용하여 균 농도를 84%T(≒ 1×108 CFU/mL, 세균용 또는 ≒ 1×106 CFU/mL, 진균용)가 되도록 조정하였다. 그 후, 9.5 mL의 0.03% TSB 또는 0.03% SDB, 1% Type I agarose 및 10 mM phosphate buffer(PB) (pH 6.5)를 포함하는 underlay gel에 각각의 농도로 희석된 균액 0.5 mL을 첨가하고 잘 섞은 후 plate에 편평하게 부어 굳혔다. 굳은 plate에 punch (diameter, 2.5 mm)를 사용하여 직경 2.5 mm의 well을 뚫은 후에 5 μL의 시료를 도입시켰다. 시료가 배지에 완전히 스며들면 3시간 동안 37°C에서 1차 배양한 후, 그 위에 10 mL의 6% TSB 또는 6% SDB, 1% Type I agarose 및 10 mM PB (pH 6.5)를 포함하는 overlay gel을 붓고 굳힌 후에 동일한 온도에서 18시간 동안 2차 배양하였다(Seo et al., 2005). 다음날 well 주위에 생긴 clear zone의 크기를 측정함으로써 항균활성을 확인하였다. 항균활성 측정 동안 positive control로는 미국산 잡종 농어(Morone saxatilis×Morone chrysops)에서 정제된 항균 펩타이드인 piscidin 1 (Peptron, Inc., Daejeon, Korea)을 사용하였고, negative control로는 1% acetic acid 또는 0.01% acetic acid를 사용하였다(Silphaduang and Noga, 2001).

Enzyme 처리에 의한 항균물질의 단백질성 확인

추출물에 포함된 항균물질의 단백질성을 확인하기 위해서 단백질 분해효소인 trypsin과 chymotrypsin 및 proteinase K를 처리한 후 처리 전·후의 항균활성 변화를 확인하였다. 추출물 또는 정제물 5 μL에 enzyme 용액(1,000 μg/mL in 50 mM PB, pH 7.4-trypsin, proteinase K 또는 pH 7.8-chymotrypsin) 1 μL를 첨가하고 37°C에서 60분간 반응시킨 뒤, URDA법으로 B. subtilis와 E. coli D31에 대한 항균활성 변화를 측정하였다(Lee and Seo, 2021).

Acid-Urea PAGE와 Bug-blot

추출물 내의 염기성 단백질/펩타이드들의 조성과 활성 band를 확인하기 위해서 acid-urea PAGE (AU-PAGE)와 bug-blot (gel overlay assay)을 E. coli D31에 대해서 수행하였다(Seo et al., 2005; Lee and Seo, 2021). Bug-blot에 사용될 LB plate 제조를 위해서 E. coli D31은 TSB에서 37°C로 18시간 동안 배양한 후 colorimeter (Product No. 52-1210; BioMerieux, Inc., )를 사용하여 균 농도를 84%T (≒1×108 CFU/mL)가 되게 조정하였다. 그 후, 9.5 mL의 LB, 1% TypeⅠ agarose, 10 mM PB (pH 6.7) 및 0.5% NaCl를 포함하는 gel에 희석된 균액 0.5 mL (1×108 CFU/mL)를 넣고 잘 섞은 후에 plate에 편평하게 부어 굳혔다.

AU-PAGE와 bug-blot을 수행하기 위해서 동일한 2개의 gel과 동일한 2개의 시료를 gel에 도입시켜 AU-PAGE를 수행한 후 각각의 gel을 staining/destaining 용도와 bug-blot (gel overlay) 용도로 각각 사용하였다. 먼저, AU-PAGE를 위한 gel은 urea (Cat. No.161-0731; Bio-rad, Hercules, CA, USA) 3.6 g, D.W 3.4 mL, 30% acrylamide/Bis solution (37.5:1) (Cat. NO.161-0158; Bio-rad) 5 mL, glacial HAc 0.65 mL를 비커에 넣고 stirring (10분, 실온)과 degassing (20분, 실온, desiccator)을 한 후 TEMED (Cat. NO.161-0800; Bio-rad) 0.06 mL, 10% APS (Cat. NO.161-0700; Bio-rad) 0.275 mL를 첨가한 후 stirring (1분, 실온)하고, gel액을 붓고 실온에서 16시간 동안 굳혔다. 제조된 gel을 전기영동 장치(Mini PROTEAN II Electrophoresis Cell; Bio-Rad Laboratories, Richmond, CA, USA)에 조립한 후 5% HAc를 붓고 pre-run (150 V, 50분, 실온, reversed polarity; lower chamber cathode)을 수행하였다. Well에 도입할 각 시료 20 μL는 20 μL의 2×sample buffer와 1:1 (v/v)로 혼합해서 사용하였고, human histone H1 (Cat. NO.0051322; Bio-Rad Laboratories) (21 kDa) 1 μg, human lysozyme (Cat. No.L1667-1G; SIGMA, St. Louis, MO, USA)(11 kDa) 1 μg, aprotinin (Cat. No.H-5834.0005; Bachem)(6.5 kDa) 1 μg, piscidin 1 (2.5 kDa) 1 μg을 포함하는 20 μL의 standard solution은 20 μL의 2×Sample buffer와 1:1 (v/v)로 혼합해서 사용하였다. Pre-run이 끝난 후 running buffer (5% HAc)를 교체하고 각각의 well에 시료를 도입시킨 후 전기영동을 실시하였다(150 V, 50분, 실온, reversed polarity; lower chamber cathode). 전기영동 후, 1 개의 gel은 CBB R-250으로 염색과 탈염색 과정을 수행하여 단백질성 물질들의 band 유무를 확인하였다. 나머지 1개의 gel은 rinse buffer (10 mM PB buffer, pH 7.4)로 2회 세척한 후 E. coli D31을 포함하는 LB plate에 overlay시켜서 37°C에서 3시간 동안 1차 배양하였다. 1차 배양 후, overlay시켰던 AU-PAGE gel을 제거하고 LB plate를 동일한 온도에서 18시간 동안 2차 배양하였다(Hultmart et al., 1982). 다음날 LB plate에 나타난 clear zone과 염색 및 탈색된 gel의 band를 비교하였다.

추출물들의 Cytoplasmic Membrane Permeabilization Assay

추출물들의 세균 내막 투과성을 측정하기 위해서 β-galactosidase 활성을 포함하는 E. coli ML35p와 nonmembrane-permeative chromogenic 기질인 ONPG (Cat. No. N1127-250 mg; Sigma)가 포함된 용액에 추출물을 도입시킨 후 E. coli ML35p의 세포질에서 유출된 β-galactosidase의 활성을 확인하는 실험을 수행하였다(Skerlavaj et al., 1990). 이를 위해서 배양된 midlog phase의 E. coli ML35p를 10 mM sodium phosphate buffer/100 mM NaCl (pH 7.4)로 세척을 한 후, 1.5 mM의 ONPG를 포함하는 동일 buffer에 용해시켰다. 그 후, 측정할 추출물들을 첨가한 뒤 37°C에서 60분간 배양하면서 10분 간격으로 유출된 β-galactosidase에 의한 ONPG의 가수분해물인 o-nitrophenol의 농도를 405 nm에서 측정하였다. 막 투과성 측정의 표준물질로는 강한 내막 투과성을 나타낸다고 알려진 항균 펩타이드인 piscidin 1을 사용하였다.

추출물들의 DNA Binding Assay

추출물들에 존재하는 DNA 결합성 물질의 존재유무를 확인하기 위해서 DNA binding에 의한 DNA band들의 agarose gel-electrophoresis 하에서의 이동 저해 정도를 확인하는 DNA-binding assay를 수행하였다(Hsu et al., 2005). 이를 위해서 100 bp DNA ladder (Cat. No. D-1030, 0.1 μg; Bioneer Corp.)와 추출물을 혼합해서 37°C에서 60분 동안 반응시키고, 0.5 μg/mL EtBr을 포함하는 1.8% agarose gel에서 전기영동을 수행한 후 DNA band의 유무 및 이동 정도를 확인함으로써 DNA-binding 정도를 확인하였다. DNA-binding ability의 비교물질로는 미국산 잡종 농어에서 유래한 항균 펩타이드인 piscidin 1을 사용하였다.

Solid Phage Extraction

각 추출물들의 양이온 교환 HPLC 과정을 수행한 후 각 분획의 항균활성을 확인하기 위해서 각각의 분획에 포함된 NaCl을 제거하기 위해서 Sep-Pak C18 cartridge (#WAT036925; 5 g, 20 mL; Waters)를 이용한 solid-phage extraction 과정을 수행하였다(Lee and Seo, 2021). 이를 위해서 Sep-Pak C18 cartridge는 20 mL의 acidified acetonitrile (ACN) (0.1% trifluoroacetic acid, TFA 포함)로 활성화시킨 후 20 mL의 acidified water (0.1% TFA 포함)로 세척하였다. 세척된 C18 cartridge에 각각의 분획을 도입한 후 20 mL의 acidified water (H2O), 10% acidified acetonitrile (10A), 60% acidified acetonitrile (60A) 및 100% acidified acetonitrile (100A)을 사용하여 순차적으로 용출시켰다. 각각의 용출된 분획을 농축하고 0.01% HAc에 용해시켜 항균활성 측정 및 HPLC chromatogram 비교 실험에 사용하였다.

추출물의 크로마토그램 비교를 위한 HPLC 분석

추출물들의 boiling 여부에 따른 HPLC chromatogram 비교 실험에는 외투막과 아가미추출물들의 유사한 활성도에 기인하여 아가미 추출물만을 선택해서 사용하였다. 아가미 추출물에 포함된 항균 펩타이드의 분리 및 정제과정은 HPLC (YL9100 HPLC system; Young Lin Instrument Co., Anyang, Korea)를 이용한 역상 및 이온 교환성을 갖는 2가지 특성의 HPLC column을 사용하여 순차적으로 수행되었고, 정제과정 중의 분획들에 대한 항균활성은 B. subtilis KCTC1021에 대해서 URDA 법으로 측정하였다. 첫 번째 정제과정으로 각각의 추출물들을 CapCell-Pak C18 column (4.6 mm×250 mm, 5 μm; Shiseido, Tokyo, Japan)에 적용시켜 다음과 같은 조건으로 정제과정을 수행하였다(Seo, 2016; Oh et al., 2018). A 용매는 0.1 % TFA를 포함하는 H2O (pH 2.2)이며 B 용매는 0.1% TFA를 포함하는 100% CH3CN (pH 2.2)를 사용하였다. 분리조건은 5%에서 65%까지 60분간 B 용매를 순차적으로 증가시켰으며, 유속은 1.0 mL/min, 파장은 220 nm에서 확인하였다. 두 번째 정제과정으로 각각의 추출물들을 TSK-gel SP-5PW column (7.5 mm×75 mm, 10 μm; Tosoh, Tokyo, Japan)에 도입시키고 다음과 같은 조건으로 정제과정을 수행하였다(Seo, 2016). A buffer는 10 mM phosphate buffer (PB; pH 6.0)이며, B buffer는 1.0 M NaCl을 포함하는 10 mM PB (pH 6.0)를 사용하였다. 분리조건은 0에서 1.0 M까지 100분 동안 B buffer를 순차적으로 증가시켰으며, 유속은 1.0 mL/min, 파장은 220 nm에서 분리과정을 수행하였다. 분취된 분획은 NaCl을 제거한 후 B subtilis KCTC1021에 대한 항균활성을 URDA법을 사용해서 확인하였다. 세 번째 정제과정으로 활성이 확인된 분획을 CapCell-Pak C18 column (4.6 mm×250 mm, 5 μm; Shiseido)에 적용시켜 다음과 같은 조건으로 최종 정제과정을 수행하였다. A 용매는 0.1% TFA를 포함하는 H2O (pH 2.2)이며 B 용매는 0.1% TFA를 포함하는 100% CH3CN (pH 2.2)를 사용하였다. 분리 조건은 5%에서 65%까지 60분간 B 용매를 순차적으로 증가시켰으며, 유속은 1.0 mL/min, 파장은 220 nm에서 확인하였다. 최종 정제된 항균물질의 단백질성을 확인하기 위해서 trypsin 처리 전·후의 항균활성 변화를 B. subtilis KCTC1021에 대해서 URDA법을 사용하여 측정하였다.

결과 및 고찰

추출물의 항균활성

부안산 참담치(M. coruscus)로부터 채취한 아가미(gill)와 외투막(mantle) 조직들은 1% HAc (초산) 하에서 이용한 두 가지 서로 다른 추출과정(boiling과 non-boiling)을 통해서 추출되었으며, 각 추출물의 항균활성은 B. subtilis KCTC1021, E. coli D31 및 진균인 C. albicans KCTC7965에 대해서 URDA법을 이용하여 측정하였다(Fig. 1, Fig. 2A). 측정 결과, 추출물들의 B. subtilis에 대한 항균활성에서는 boiling 유무에 관계없이 강한 항균활성을 나타낸 반면 항균 펩타이드 민감성 균주인 E. coli D31에 대해서는 boiling 추출물만이 항균활성을 나타내었다(Fig. 2B) (Chernysh, 2015). 또한, 각 추출물은 측정 세균들에 대해서는 강한 항균활성을 나타낸 반면에 진균인 C. albicans에 대해서는 항균활성을 나타내지 않았다. 이러한 결과는 추출물의 항균활성 범위는 진균보다는 세균에 한정되어 있으며, boiling 과정은 추출물에 포함된 단백질성 항균물질 등의 안정성 유지를 위해서 중요한 과정이라는 것을 의미하는 것이다(Seo, 2016).

KSSHBC_2022_v55n6_875_f0002.png 이미지

Fig. 2. Gill and mantle tissue of the hard-shelled mussel Mytilus coruscus and antimicrobial activity of the crude extract obtained from two different extraction methods; boiling and non-boiling in 1% HAc. A, Anatomical structure of gill or mantle in the hard-shelled mussel M. coruscus used for extraction; B, Antimicrobial activity of the acidified gill and mantle extract by boiling or non-boiling method against Bacillus subtilis KCTC1021, Escherichia coli D31, and Candida albicans KCTC7965. Scale bar indicates 5 mm.

추출물의 효소 안정성

각 추출물 내에 포함된 항균활성 물질의 단백질성을 확인하기 위해서 각 추출물(5 μL)에 단백질분해효소인 trypsin 및 chymotrypsin과 protease K를 처리한 후 효소 처리 전·후의 항균활성 변화를 URDA법을 이용하여 측정하였다(Fig. 3). 측정 결과, 추출물들은 boiling 유무에 관계없이 trypsin 및 chymotrypsin과 protease K 처리 후에도 B. subtilis에 대해서 항균활성을 나타내었다. 반면에 E. coli D31에 대해서는 boiling 추출물만 항균활성을 나타내었으며, 이러한 항균활성은 trypsin 및 chymotrypsin과 protease K 처리 후에는 거의 소실되는 것으로 나타났다. 이러한 결과는 추출물에 포함된 B. subtilis에 대해서 항균 활성을 나타내는 물질은 비단백질성 물질일 가능성이 있는 반면 E. coli D31에 대해서 항균활성을 나타내는 물질은 양이온성 아미노산(Lys과 Arg) 또는 방향족 아미노산(Trp, Phe, Tyr)을 포함하는 단백질성 항균물질임을 의미하는 것이다(Seo et al., 2005). 또한, boiling 과정은 추출물에 포함된 단백질성 항균물질의 안정성 유지에 중요하다는 것을 나타내는 것이다. 추출물들의 항균 활성도 비교에서는 아가미와 외투막 추출물들은 유사한 활성도를 나타내었다.

KSSHBC_2022_v55n6_875_f0003.png 이미지

Fig. 3. Proteolytic stability of the crude extract. Antimicrobial activity of the crude extract (N, not treated) and after treated with trypsin, chymotrypsin, proteinase K against Bacillus subtilis KCTC1021 (A) and Escherichia coli D31 (B). Scale bar indicates 5 mm. T, Trypsin; C, Chymotrypsin; K, Proteinase K; N, Not treated.

Acid-urea PAGE와 Bug-blot

추출물 내의 염기성 단백질/펩타이드의 구성과 항균활성 유무를 비교·확인하기 위해서 AU-PAGE와 bug-blot (gel overlay assay)을 수행하였다(Fig. 4) (Lehrer et al., 1991). 그 결과, boiling 추출물들은 non-boiling 추출물과 비교해서 상대적으로 다양한 염기성 단백질/펩타이드들을 높은 농도로 포함하고 있는 것으로 나타났다(Fig. 4A). 또한, boiling 추출물에 포함된 염기성 단백질/펩타이드들에서만 항균활성을 나타낸 반면 non-boiling 추출물에 포함된 물질들은 항균활성을 나타내지 않았다(Fig. 4B). 특히, boiling 추출물들의 주요한 항균활성은 slow migra tion zone (SMZ) (histone H1과 aprotinin 사이)과 rapid migration zone (RMZ) (Piscidin 1부위)을 포함하는 두 부위에서 나타났으며, SMZ의 항균활성이 RMZ 보다 상대적으로 강하게 나타났다(Fig. 4B) (Seo et al., 2010). 이러한 결과는 추출물에는 다양한 분자량의 단백질/펩타이드 항균물질이 존재하고 있으며, 이러한 단백질/펩타이드 항균물질의 안정성 유지를 위해서는 이전의 결과와 유사하게 boiling 과정이 효과적이라는 것을 의미하는 것이다.

KSSHBC_2022_v55n6_875_f0004.png 이미지

Fig. 4. AU-PAGE and gel overlay analysis (bug-blot) of the crude extract against Escherichia coli D31. A, AU-PAGE of the crude extract stained with coomassie brilliant blue R-250. Lane 1, molecular weight markers: 1 µg human histone H1, 1 µg lysozyme, 1 µg aprotinin, and 1 µg piscidin 1; lane 2, 20 μL gill extract using boiling; lane 3, 20 μL gill extract using non-boiling; lane 4, 20 μL mantle extract using boiling; lane 5, 20 μL mantle extract using non-boiling. B, Gel overlay analysis of the crude extract against E. coli D31.

추출물들의 Cytoplasmic Membrane Permeabilization Assay

추출물에 포함된 항균물질의 작용부위가 세균의 세포막인지를 확인하기 위해서 membrane permeabilization assay를 수행하였다(Fig. 5A). 실험결과 양성 대조군으로 사용한 piscidin 1은 강한 내막 투과성을 나타낸 반면 boiling 유무와 관계없이 추출물들은 막 투과성을 거의 나타내지 않았다. 이러한 결과는 추출물에 포함된 (비)단백질성 항균물질들은 세균의 세포질 내 물질을 유출시킬 정도로 세균 막에 대해서 강한 투과성을 나타내지 않는다는 것을 의미하는 것이다(Lee and Seo, 2021). 따라서 추출물 내에 포함된 항균물질의 예상 작용부위는 막 자체는 아닌 것으로 판단된다.

KSSHBC_2022_v55n6_875_f0005.png 이미지

Fig. 5. Cytoplasmic membrane permeabilization of Escherichia coli ML35p by the crude extract and gel retardation analysis or the binding of the crude extract to DNA. A, Cytoplasmic membrane permeabilization of the crude extract was monitored as an increase in fluorescence intensity by the hydrolysis of the impermeable, chromogenic substrate ONPG in the presence of piscidin 1 (1 μg/mL) or the crude extract (5 μL) for 60 min. The yellow color represents strong membrane permeabilizing ability (inset); B, The binding ability of the extract (5 μL) to DNA was assessed by measurement of the migration of a commercial 100 bp DNA ladder (0.2 μg) through an agarose gel (1.8%). Lane 1, 100 bp DNA ladder (0.2 μg); lane 2, 5 μL gill extract using boiling; lane 3, 5 μL gill extract using non-boiling; lane 4, 5 μL mantle extract using boiling; lane 5, 5 μL mantle extract using non-boiling; lane 6, negative control, 0.01% HAc (5 μL); lane 7, positive control, piscidin 1 (1 μg). ONPG, o-nitrophenyl-β-D-galacto-pyranoside.

추출물들의 DNA Binding Assay

추출물에 포함된 항균물질의 작용부위가 DNA인지를 확인하기 위해서 추출물들과 DNA (100 bp DNA ladder)와의 상호작용에 의한 전기장에서의 DNA migration 저해 활성을 DNA-binding assay를 통하여 확인하였다(Fig. 5B). 측정 결과, 양성 대조군으로 사용한 piscidin 1은 100 bp DNA ladder에 대해서 강한 DNA migration 저해 활성을 나타내었으며, 이와 유사하게 추출물들도 boiling 유무와 관계없이 100 bp DNA ladder에 대해서 강한 DNA migration 저해 활성을 나타내었다. 이러한 결과는 piscidin 1과 추출물에 존재하는 항균물질은 단백질성과 관계없이 DNA와 유효한 상호작용(DNA-binding)을 할 가능성이 있다는 것을 의미하는 것이다(Seo et al., 2021). 따라서 추출물에 포함된 항균물질의 작용기작은 세포막을 직접 공격하기 보다는 intracellular components (예: DNA)들과 상호작용함으로써 항균작용을 나타내는 것으로 판단된다(Huo et al., 2011).

추출물의 크로마토그램 비교를 위한 HPLC 분석

아가미 추출물에 포함된 항균물질의 boiling 유무에 따른 항균 활성 및 활성물질의 농도 변화를 확인하기 위한 크로마토그램 비교실험은 각각의 추출물을 역상(C18) 및 양이온 교환 HPLC column에 도입시킴으로써 수행되었다. 첫 번째 도입과정으로 각각의 추출물을 CapCell-Pak C18 column (4.6 mm×250 mm, 5 μm; Shiseido)에 도입한 후 각각의 크로마토그램과 활성 peak들을 확인 및 비교하였다(Fig. 6). 크로마토그램 비교 결과, boiling 추출물은 25–45%의 CH3CN (20–40분) 농도에서 주요한 용출범위를 나타내었으나, non-boiling 추출물들은 15–35%의 CH3CN (10–30분) 농도에서 주요한 용출범위의 변화를 나타내었다. 또한 각각의 용출 peak들의 항균활성을 측정한 결과, boiling 추출물에서는 용출범위에 포함된 각각의 peak들은 B. subtilis에 대해서 강한 항균활성을 나타낸 반면 non-boiling 추출물의 용출범위에 포함된 각각의 peak들은 항균활성을 나타내지 않았다. 이러한 결과는 non-boiling 추출물에 포함된 물질들의 소수성이 boiling 추출물과 비교해서 상대적으로 감소되었다는 것을 의미하는 것으로써 boiling 유무에 따라 추출물에 포함된 단백질성 항균물질의 특성(단편화, 구조 변화, 농도 등)에 변화가 있으며, 조직 추출물에 포함된 단백질성 항균물질의 특성 및 항균활성 유지에는 boiling 과정이 중요하다는 것을 나타내는 결과이다.

KSSHBC_2022_v55n6_875_f0006.png 이미지

Fig. 6. Comparison of the RP-HPLC chromatograms of the crude gill extract. Reversed-phased HPLC chromatograms obtained from the separation of the boiling extract (A) and non-boiling extract (B) with a CapCell-Pak C18 column (4.6×250 mm) using a linear gradient of 5->65% CH3CN in 0.1% TFA for 60 min at a flow rate of 1 mL/min. The eluate was monitored at 220 nm. Fraction of the absorbance peak (indicated by the arrow) showed antimicrobial activity against Bacillus subtilis KCTC1021 (inset). HPLC, High performance liquid chromatography.

두 번째 도입과정으로 아가미 추출물을 양이온 교환 column인 TSK-gel SP-5PW column (7.5 mm×75 mm, 10 μm; Tosoh)에 도입한 후 각각의 크로마토그램과 peak들의 항균활성을 비교하였다(Fig. 7). 각각의 분획들에 포함된 NaCl은 solid-phage extraction (Sep-Pak C18 cartridge) 과정을 수행하여 제거한 후, 얻어진 4 가지 분획물(H2O, 10A 60A, 100A)들의 B. subtilis에 대한 항균활성을 URDA법으로 측정하였다. 크로마토그램 비교 결과, boiling 추출물은 non-boiling 추출물과 비교해서 상대적으로 양이온 교환 column (SP-5PW column)에 결합하는 양이온성 물질의 농도가 높은 것으로 나타났다. 또한 각각의 주요 용출 peak들을 solid-phage extraction 과정을 수행한 후 항균활성을 측정한 결과, 0.9 M NaCl에서 용출된 peak들의 60A에서 유효한 항균활성을 나타내었으며, 항균활성 정도와 흡광도는 boiling 추출물이 non-boiling 추출물보다 상대적으로 높은 것으로 나타났다. 또한 0.9 M NaCl에서 용출된 각각의 항균물질은 trypsin 처리 후에는 항균활성이 완전히 소실되었다(Fig. 7 inset). 이러한 결과는 용출된 항균물질은 단백질성이며, 역상 HPLC 크로마토그램과 유사하게 boiling에 의해서 추출물에 포함된 단백질성 항균물질들의 안정성이 더 효과적으로 유지되었음을 의미하는 것이다. 이러한 결과를 바탕으로 0.9 M NaCl 농도에서 용출된 항균활성 물질의 구체적인 변화를 비교하기 위해서 각각의 0.9 M NaCl 분획물을 CapCell-Pak C18 column에 도입하였다.

KSSHBC_2022_v55n6_875_f0007.png 이미지

Fig. 7. Comparison of the cation-exchange HPLC chromatograms of the crude gill extract. Cation-exchange HPLC chromatograms obtained from the separation of the boiling extract (A) and non-boiling extract (B) with a cation-exchange HPLC column (TSK-gel SP-5PW, 7.5×75 mm) with a linear gradient of buffer A (10 mM PB, pH 6.0) and buffer B (1.0 M NaCl in 10 mM PB, pH 6.0) from 0 to 1.0 M NaCl for 100 min at a flow rate of 1 mL/min. The eluate was monitored at 220 nm. The elution point of the active fraction occurred at 0.9 M NaCl (arrow). Antimicrobial activity of the absorbance peak (indicated by the arrow) (before) and trypsin treated absorbance peak (after) against Bacillus subtilis KCTC1021 (inset). HPLC, High performance liquid chromatography.

세 번째 도입과정으로 cation-exchange chromatography에서 얻어진 0.9 M NaCl 용출액을 solid-phage extraction (Sep-Pak C18 cartridge) 과정을 수행한 후 활성 분획물(60A)을 CapCell-Pak C18 column (4.6 mm×250 mm, 5 μm; Shiseido)에 첫 번째 도입과정과 동일한 조건을 사용하여 최종적으로 순수한 항균물질을 정제하였다(Fig. 8). 최종 정제된 항균물질은 거의 동일하게 23.5분(28.5% CH3CN 농도)에서 용출되었으며, boiling 추출물이 non-boiling 추출물보다 상대적으로 높은 흡광도를 나타내었다. 또한 cation-exchange HPLC와 C18 RP-HPLC에서 각각 거의 동일한 용출시간을 나타낸 결과를 바탕으로 정제된 항균물질은 동일 물질인 것으로 추정된다. 각각의 최종 정제물질은 trypsin 처리 후에는 B. subtilis에 대한 항균활성이 완전히 소실되었다(Fig. 8 inset). 이러한 결과는 최종 정제된 항균물질은 항균 펩타이드라는 것을 의미하는 것으로서, 앞에서 언급된 두 번의 크로마토그램 비교에서와 유사하게 boiling 추출물에 포함된 항균 펩타이드는 non-boiling 추출물보다 안정성이 효과적으로 유지되었다는 것을 나타내는 것이다(Seo et al., 2010).

KSSHBC_2022_v55n6_875_f0008.png 이미지

Fig. 8. Comparison of the final purification chromatograms by reversed-phase HPLC separation. The elution point of the active peak (indicated by the arrow) was at 28.5% (23.5 min) CH3CN. Antimicrobial activity of the purified peak (before) and trypsin treated purified peak (after) against Bacillus subtilis KCTC1021 (inset). HPLC, High performance liquid chromatography.

본 연구에서는 부안산 참담치 추출물들이 포함된 선천면역성 항균 펩타이드들의 boiling 유무에 따른 안정성 변화를 확인하기 위해서 아가미와 외투막 조직을 약산조건 하에서 두 가지의 추출방법(boiling 또는 non-boiling)으로 추출한 후 항균활성과 구성성분들의 차이를 비교하였다. 항균활성 측정 결과, 추출물들은 세균에 대해서는 강한 항균활성을 나타낸 반면에 진균에는 항균활성을 나타내지 않는 것으로 확인되었다. 또한 그람 양성균에 대한 항균활성에는 추출물들의 boiling 유무는 큰 영향을 나타내지 않았으며, 비단백질성 물질이 그람 양성균에 대한 항균활성과 연관된 것으로 확인되었다(Lee and Seo, 2021). 그람 음성균에 대한 추출물들의 항균활성은 boiling 유무에 큰 영향을 받는 것으로 나타났으며, 단백질성 물질이 그람 음성균에 대한 항균활성과 연관된 것으로 확인되었다. 그리고 추출물에 포함된 항균물질은 세포막보다는 세포내 물질(예: DNA)들과 상호작용함으로써 항균기능을 나타내는 것으로 예측된다. 또한 AU-PAGE 및 bug-blot (gel overlay assay) 결과와 C18 역상 및 양이온교환 column을 이용한 HPLC 크로마토그램 비교에서도 boiling 추출은 non-boiling 추출과 비교해서 상대적으로 항균 펩타이드들의 안정성 유지에 훨씬 효과적인 것으로 나타났다.

본 연구결과는 해양무척추동물, 특히 참담치 추출물에 포함된 항균 펩타이드 연구를 위한 추출 효율의 향상을 위해서는 boiling 과정이 항균 펩타이드의 안정성 확보 및 유지를 위해서 매우 효과적으로 적용될 수 있다는 것을 의미하는 것이다.

References

  1. Ammerman JW, Fuhrman JA, Hagstrom A and Azam F. 1984. Bacterioplankton growth in seawater. 1. Growth kinetics and cellular characteristics in seawater cultures. Mar Ecol Prog Ser 18, 31-39. https://doi.org/10.3354/meps018031.
  2. Charlet M, Chernysh S, Philippe H, Hetru C, Hoffmann JA and Bulet P. 1996. Innate immunity: Isolation of several cysteine-rich antimicrobial peptides from the blood of a mollusk, Mytilus edulis. J Biol Chem 271, 21808-21813. https://doi.org/10.1074/jbc.271.36.21808.
  3. Chernysh S, Gordya N and Suborova T. 2015. Insect antimicrobial peptide complexes prevent resistance development in bacteria. PLoS One 10, e0130788. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0130788.
  4. De Zoysa M, Nikapitiya C, Whang I, Lee JS and Lee J. 2009. Abhisin: A potential antimicrobial peptide derived from histone H2A of disk abalone (Haliotis discus discus). Fish Shellfish Immunol 27, 639-646. https://doi.org/10.1016/j.fsi.2009.08.007.
  5. Elnagdy S and AlKhazindar M. 2022. Using clustered regularly interspaced short palindromic repeats for recombinant biosynthesis of antimicrobial peptides as anti-COVID-19 agent. ACS Pharmacol Trans Sci 5, 177-178. https://doi.org/10.1021/acsptsci.1c00252.
  6. Hancock RE and Chapple DS. 1999. Peptide antibiotics. Antimicrob Agents Chemother 43, 1317-1323. https://doi.org/10.1128/AAC.43.6.1317.
  7. Hancock RE and Scott MG. 2000. The role of antimicrobial peptides in animal defenses. Proc Natl Acad Sci USA 97, 8856-8861. https://doi.org/10.1073/pnas.97.16.8856.
  8. Haug T, Kjuul AK, Stensvag K, Sandsdalen E and Styrvold OB. 2002. Antibacterial activity in four marine crustacean decapods. Fish Shellfish Immunol 12, 371-85. https://doi.org/10.1006/fsim.2001.0378.
  9. Hsu CH, Chen C, Jou ML, Lee AYL, Lin YC, Yu YP, Huang WT and Wu SH. 2005. Structural and DNA-binding studies on the bovine antimicrobial peptide, indolicidin, evidence for multiple conformations involved in binding to membranes and DNA. Nucleic Acids Res 33, 4053-4064. https://doi.org/10.1093/nar/gki725.
  10. Hultmart D, Engstrom A, Bennich H, Kapur R and Boman H. 1982. Insect immunity: Isolation and structure of cecropin D and four minor antimicrobial components from Cecropia pupae. Eur J Biochem 127, 207-217. https://doi.org/10.1111/j.1432-1033.1982.tb06857.x.
  11. Huo L, Zhang K, Ling J, Peng Z, Huang X, Liu H and Gu L. 2011. Antimicrobial and DNA-binding activity of the peptide fragments of human lactoferrin and histatin 5 against Streptococcus mutans. Arch Oral Biol 56, 869-876. https://doi.org/10.1016/j.archoralbio.2011.02.004.
  12. Izadpanah A and Gallo RL. 2005. Antimicrobial peptides. J Am Acad Dermatol 52, 381-390. https://doi.org/10.1016/j.jaad.2004.08.026.
  13. Khoo L, Robinette DW and Noga EJ. 1999. Callinectin, an antibacterial peptide from blue crab, Callinectes sapidus, hemocytes. Mar Biotechnol 1, 44-51. https://doi.org/10.1007/pl00011750.
  14. Lee JE and Seo JK. 2021. Screening and purification of a novel antibacterial peptide, cgCAFLP, against skin pathogens from the extract of the Pacific oyster Crassostrea gigas from Buan in Korea. Korean J Fish Aquat Sci 54, 927-937. https://doi.org/10.5657/KFAS.2021.0927.
  15. Lehrer RI, Rosenman M, Harwig SSL, Jackson R and Eisenhaur P. 1991. Ultrasensitive assay for endogenous antimicrobial polypeptides. J Immunol Methods 137, 167-173. https://doi.org/10.1016/0022-1759(91)90021-7.
  16. Menzel LP, Lee IH, Sjostrand B and Lehrer RI. 2002. Immunolocalization of clavanins in Styela clava hemocytes. Dev Comp Immunol 26, 505-515. https://doi.org/10.1016/s0145-305x(02)00010-1.
  17. Miyata T, Tokunaga F, Yoneya T, Yoshikawa K, Iwanaga S, Niwa M, Takao T and Shimonishi Y. 1989. Antimicrobial peptides, isolated from horseshoe crab hemocytes, tachyplesin II, and polyphemusins I and II: Chemical Structures and Biological Activity. J Biochem 106, 663-668. https://doi.org/10.1093/oxfordjournals.jbchem.a122913.
  18. Nakamura T, Furunaka H, Miyata T, Tokunaga F, Muta T, Iwanaga S, Niwa M, Takao T and Shimonishi Y. 1988. Tachyplesin, a class of antimicrobial peptide from the hemocytes of the horseshoe crab (Tachypleus tridentatus). Isolation and chemical structure. J Biol Chem 263, 16709-16713. https://doi.org/10.1016/S0021-9258(18)37448-9.
  19. Oh R, Lee MJ, Kim YO, Nam BH, Kong HJ, Kim JW, Park JY, Seo JK and Kim DG. 2018. Purification and characterization of an antimicrobial peptide myitichitin-chitin binding domain from the hard-shelled mussel, Mytilus coruscus. Fish Shellfish Immunol 83, 425-435. https://doi.org/10.1016/j.fsi.2018.09.009.
  20. Seo JK. 2016. Screening and purification of an antimicrobial peptide from the gill of the Manila clam Ruditapes philippinarum. Korean J Fish Aquat Sci 49, 137-145. https://doi.org/10.5657/KFAS.2016.0137.
  21. Seo JK, Crawford JM, Stone KL and Noga EJ. 2005. Purification of a novel arthropod defensin from the American oyster, Crassostrea virginica. Biochem Biophys Res Commun 338, 1998-2004. https://doi.org/10.1016/j.bbrc.2005.11.013.
  22. Seo JK, Stephenson J, Crawford JM, Stone KL and Noga ED. 2010. American oyster, Crassostrea virginica, expresses a potent antibacterial histone H2B protein. Mar Biotechnol 12, 543-551. https://doi.org/10.1007/s10126-009-9240-z.
  23. Shai Y. 2002. Mode of action of membrane active antimicrobial peptides. Biopolymers 66, 236-248. https://doi.org/10.1002/bip.10260.
  24. Silphaduang U and Noga EJ. 2001. Peptide antibiotics in mast cell of fish. Nature 414, 268-269. https://doi.org/10.1038/35104690.
  25. Skerlavaj B, Romeo D and Gennaro R. 1990. Rapid membrane permeabilization and inhibition of vital functions of Gramnegative bacteria by bactenecins. Infect Immun 58, 3724-3730. https://doi.org/10.1128/IAI.58.11.3724-3730.1990.
  26. Sperstad SV, Haug T, Blencke HM, Styrvold OB, Li C and Stensvag K. 2011. Antimicrobial peptides from marine invertebrates: Challenges and perspectives in marine antimicrobial peptide discovery. Biotechnol Adv 29, 519-530. https://doi.org/10.1016/j.biotechadv.2011.05.021.
  27. Tincu JA and Taylor SW. 2004. Antimicrobial peptides from marine invertebrates. Antimicrob Agents Chemother 48, 3645-3654. https://doi.org/10.1128/AAC.48.10.3645-3654.2004.
  28. van't Hof W, Veerman EC, Helmerhorst EJ and Amerongen AV. 2001. Antimicrobial peptides: Properties and applicability. Biol Chem 382, 597-619. https://doi.org/10.1515/BC.2001.072.
  29. Wu R, Patocka J, Nepovimova E, Oleksak P, Valis M, Wu W and Kuca K. 2021. Marine invertebrate peptides: Antimicrobial peptides. Front Microbiol 12, 785085. https://doi.org/10.3389/fmicb.2021.785085.
  30. Zasloff M. 2002. Antimicrobial peptides of multicellular organisms. Nature 415, 389-395. https://doi.org/10.1038/415389a.