Histopathological Examination of Myxosporean-Infected Olive Flounders Paralichthys olivaceus, Cultured in Jeju Island, South Korea

제주지역 양식 넙치(Paralichthys olivaceus)의 점액포자충 감염조직에 대한 병리조직학적 관찰

Abstract

In recent years, myxosporean infection from the cultured olive flounders Paralichthys olivaceus, have been frequently observed in Jeju island, South Korea. This study aimed to compare histopathological and molecular-biological methods of examining myxosporean infection from these flounders. Samples were obtained from affected individuals exhibiting emaciation or abdominal distention and a polymerase chain reaction (PCR) indicative of Parvicapsular anisocaudata, Enteromyxum leei and Kudoa septempunctata were initiated. Histopathological examination were conducted with H&E stained tissue sections, and then in-situ hybridization (ISH) reaction were processed with selected sections using P. anisocaudata, E. leei, K. septempunctata and Scuticociliate probes. Renal and intestinal tissue degeneration were common symptoms associated with all samples. Sever glomerular and renal tubular degeneration were evident, as were intestinal epithelial desquamation and spore formation in the epithelial cells. The results of conventional PCR analysis and ISH reactions revealed differences, and we suspect that various microparasites may have been associated with the symptoms manifested.

서론

해산어류에서 나타나는 점액포자충류는 크게 6개의 분류군(clade)으로 나누고 있는데, Myxidium clade, Kudoa clade, Enteromyxum clade, Ceratomyxa clade, Zschokkella subclade 그리고 Parvicapsula subclade가 그것이다(Dyková et al., 2013). 최근 양식넙치에서도 다양한 점액포자충 감염 발생이 보고되고 있고 이들의 지속적인 발병과 생산에 미치는 영향을 우려한 목소리가 높아짐에 따라 다양한 연구가 진행되고 있다. Kudoa clade에 속하는 Kudoa septempunctata(Myxosporea: Multivalvulida)는 넙치의 근육 내 기생하는 것으로 잘 알려져 있으며 6-7개의 극낭을 가지는 점액포자충으로, 감염 초기에 현미경적으로도 명확하게 관찰되지 않고, 감염이 진행되면 근섬유 다발 내에 pseudocyst를 형성하지만 육안적으로 관찰되는 시스트 혹은 근육 궤양 같은 병변이 뚜렷하게 나타나지 않아 양식어민들의 양식어 관리에 어려움을 주는 기생체이다(Matsukane et al., 2010; Yoshiko et al., 2015; Takeuchi et al., 2016). Enteromyxum clade에 속하는 Enteromyxum leei의경우, 1990년대 중∙후반부터 복어 여윔증의 원인체로 보고된 점액 포자충 가운데 하나이다. 소화관 내에서 포자의 증식과 장 상피 괴사 또는 탈락으로 어체의 대사작용에 영향을 미치는 것으로 알려졌고(Tun et al., 2002; Yasuda et al., 2005; Yanagida, 2017), 국내 양식넙치에서는 여윔증과 관련하여 지속적으로 연구되어왔다(Kim et al., 2011, 2015, 2018). Sekiya et al. (2016) 은 양식 터봇과 함께 넙치 여윔병의 원인으로 E. leei를 지칭하였다. Zschokkella subclade와 Parvicapsula subclade는 Marine urinary clade로 해산어의 방광에서 검출되는 점액 포자충류로 어류를 포함한 다수의 해양생물에서 이들 점액 포자충의 감염이 확인되고 있다(Fiala, 2006; Kodadkova et al., 2014). 국내 양식넙치에서는 Parvicapsula subclade에 속하는 점액 포자충으로 Parvicapsular anisocaudata의 감염이 신장의 세뇨 관내에서 보고되었다(Cho and Kim, 2004; Cho et al., 2005). 방광과 소화관에서도 몇몇 유사종이 검출되었고 이 또한 넙치에 유해한 점액포자충으로 인지되어 유전학적 분석 등 다양한 방법을 통한 연구가 이루어지고 있다. 최근에는 Zschokkella sub-clade의 Sinuolinea capsularis가 방광에서 분리된 내용이 발표되기도 하였다(Shin et al., 2019a).

K. septempunctata가 근육에 한정되어 감염되고 넙치의 폐사에 직접적인 영향을 미치지는 못하는 반면(Matsukane et al., 2010; Yoshiko et al., 2015; Takeuchi et al., 2016), E. leei와 Parvicapsular sp.의 감염은 소화관, 신장 또는 방광에서 다량 검출되고 어체의 대사에 영향을 미치는 것으로 보이며(Kim et al., 2011, 2015, 2018; Shin et al., 2018a, 2018b), 감염어가 폐사에 이르는 경우도 관찰되어 점액포자충의 감염은 양식 넙치에서는 간과할 수 없는 병원체가 되었다.

이러한 점액포자충에 의한 다양한 감염 증상이 단일 감염에 의한 증상인지에 대한 의문이 생기던 중, 여윔증 증상을 나타내는 넙치 병어의 병리조직학적 검사에서 점액포자충의 감염과 함께 다량의 섬모충이 관련조직 내에서 관찰되었다. 이러한 소견은 점액포자충(myxozoa)의 감염으로 의심되는 증상들에 대하여 원생생물(protozoa)과 같은 다른 미세기생체(micropara-sites)의 복합적인 관여가 의심되어 병리조직학적 관찰과 함께 분자 조직학적 분석을 실시하였으며, 그 내용과 지금까지의 결과를 정리하였다.

재료 및 방법

실험어

제주 연안의 넙치 양어장 가운데 어류 질병의 원인 세균 혹은 바이러스는 검출되지 않았으나 외관상 마르거나 복부가 팽창되는 개체가 나타나는 양어장 8(A-H)곳에서 각 한 수조를 선택하여(단, D와 E는 2개 수조)에서 3-5마리씩 채취하여 총 40마리의 넙치를 대상으로 체장, 체중을 계측하고, 육안적 소견과 부검소견을 기록하였다. Table 1에 그 내용을 정리하였다.

Table 1. Information about sampled fish in the present study

TL, total length; TW, total weight; AD, abdominal distention; LE, light emaciation; SE, severe emaciation.

분자생물학적 검사(conventional PCR)

양어장 혹은 수조별 검출 유무 판별을 위해 샘플 대상 개체의 신장과 소화관을 개체 별로 구분하여 채취한 후 수조 별로 3-5마리의 신장과 소화관의 조직을 각각 pooling하고 DNA extraction kit(QIAmp^® DNA mini kit; QIAZEN, Hilden, Germany) 를 이용하여 DNA를 추출하였다. Table 2에 나타낸 primer sets 을 사용하여 점액포자충의 18S rRNA의 일부를 합성하는 PCR(polymerase chain reaction)검사를 통하여 밴드를 확인하고 염기서열 분석을 통하여 종을 확인하였다.

Table 2. Primer sets information for conventional PCR in the present study

PCR, polymerase chain reaction.

병리조직학적 검사(H&E stain)

부검 시 병리조직학적 검사를 위한 조직슬라이드표본 제작을 위해, 중성완충포르말린에 각 개체의 신장(후신)과 소화관(후장)을 고정하고 표본 제작을 위한 수세, 탈수, 투명화, 파라핀 침투의 일련의 과정을 거쳐 파라핀 블럭을 만들고, Rotary 형 마이크로톰(HistoCore MULTICUT; Leica, Nussloch, Germany)을 사용하여 조직을 박절하였다. 슬라이드글라스에 부착 시켜 건조시킨 후 Hematoxylin and Eosin 염색을 실시하였다. 제작된 표본은 광학현미경(Axio A1; Carl ZEISS, Goettingen, Germany)으로 관찰하고 당사 소프트웨어로 이미지를 얻어 정리하였다(ZEN 2.3 blue edition; Carl ZEISS, Goettingen, Germany).

ISH (in-situ hybridization)

H&E(Hematoxylin and Eosin)염색하여 관찰한 슬라이드 표본과 같은 조직에 해당하는 슬라이드 절편에 P. anisocaudata, E. leei, Scuticociliate 그리고 K. septempunctata에 특이적으로 결합 반응하도록 Dig DNA labeling mix(Roche)를 사용하여 Dig이 부착된 PCR product를 200bp내외의 크기로 합성하였고, 이 합성물을 probe로 하여 조직 절편과 hybridization 반응 시켜 광학현미경으로 발색 반응 여부를 확인하였다. ISH(insitu hybridization)반응시켜 관찰하는 전반의 제작과정은 Lee et al. (2009)을 참고하였다. Probe 합성에 사용된 Primer sets의 정보는 Table 3에 나타내었다.

Table 3. Primer pairs used for ISH (in-situ hybridization) probe synthesis in the present study

결과

분자생물학적 검사(conventional PCR)

통상적으로 실시하는 PCR을 통한 분자생물학적 검사 결과, P. anisocaudata는 8개소 10개 모든 신장조직 시료에서 검출되었으며, 소화관 조직에서는 검출되지 않았다. E. leei는 7개소 8개소 화관 시료에서 검출되었으며 신장에서는 1개소 1개 시료에서 검출되었고, K. septempuctata는 1개소 1개 시료의 소화관조직에서만 검출되었다(Table 4).

Table 4. The results of PCR analysis about Parvicapsular aniso-caudata, Enteromyxum leei and Kudoa septempunctata for tissue samples at 8 farms

K, kidney; I, intestine.

병리조직학적 검사(H&E stain)

개체 별 신장(후신)과 소화관(후장)의 H&E 염색표본 관찰 결과, 공통적으로 나타나는 소견으로 신장의 세뇨관과 사구체의 조직 변성(degeneration of glomerulus and renal tubules, DeGR; Fig. 1A), 세뇨관 내강에 포자충의 원형질체(plasmodium) (plasmodium in renal tubules, Prt; Fig. 1B)가 채워져 있는 형태가 양어장에 따라 그 정도가 다르게 관찰되었다. 소화관은 내강의 상피세포의 변성과 박리 현상(desquamation of epithelial cells, Dep; Fig. 1C)이 공통적으로 나타나며, E. leei 감염 개체의 경우 소화관 내 상피세포에 구형의 포자형성이 관찰되었다(myxospore in epithelial layer, Mep; Fig. 1D). 이 같은 소견은 A, C, D와 G양어장에서 뚜렷하게 관찰되었으며 개체에 따라 세뇨관 내 칼슘 성분의 침착물로 인해 호염성 염색 물질이 진하게 관찰되는 calcinosis 증상도 관찰되었다. 특히 D1 의 경우 신장 조직의 말단과 함께 적출되어 조직표본이 제작된 생식소(정소) 조직 내강에 섬모충으로 보이는 원생생물이 군집을 이루어 다수 관찰되었으며(Fig. 2A), 요관 내에서도 유사한 형태의 미동정 충체가 소수 관찰되었다(Fig. 2B). 소화관(후장) 내피세포에서 포자가 관찰되지 않는 경우에도 장상피 변성과 박리는 개체에 따라 정도를 달리하며 관찰되었다. 각 양어장의 신장과 소화관의 증상은 그 정도를 나타내어 Table 5에 정리하였다. H 양어장의 경우 세포변성의 정도로 자가융해(autolysis) 가 진행되었을 가능성이 의심되었다.

Fig. 1. Common finding about kidney and intestine sections of olive flounder have pathognomonic symptoms. G, glomerulus; Rt, renal tubule; white arrow, plasmodium; white circle, degenerate of glomerulus; black arrow, myxospore; black circle, desquamation of epithelial cells (H&E stain); A&B, kidney of C farm (bar, 50 µm); C&D, intestine of C farm (bar, 100 µm).

Fig. 2. Protozoan cells in uro-genetic tissue of D1 farm sample (bar, 100 µm). A, mass of protozoan cells in intratesticular coelome; B, ciliates in coelome adjacent to urinary bladder; C, testis tissue after ISH reaction with scuticociliate probe. Arrows, protozoan cells (=ciliates); ISH, in-situ hybridization.

Table 5. Histopathological observations on H&E stained kidney and intestine tissue

DeGR, degeneration of glomerulus and renal tubules; Prt, plasmodium in renal tubules; Dep, desquamation of epithelial cells; Mep, microspore in epithelial layer; BI, bacterial infection; *, gonad removed with the end of kidney tissue; **, this tissue was doubtful of autolysis.

ISH 반응

H&E염색에서 세포변성이 명확히 관찰된 A, C, D1, D2 그리고 G 조직표본에 대하여 P. anisocaudata, E. leei, Scuticociliata 그리고 K. septempunctata에 대한 ISH반응을 실시하였으며 그 결과, 신장조직 내에서는 P. anisocaudata에 대한 ISH반응이 뚜렷하게 관찰되었으나 E. leei에 대한 반응은 대부분 나타나지 않았고, A, C, D 그리고 G의 경우 신장에서도 E. leei에 대한 반응이 관찰되었지만 반응세포수는 현저히 적은 것을 알 수 있었다(Fig. 3A, 3B, 3C).

Fig. 3. Kidney and intestine tissue after ISH. A, kidney of A farm after ISH with Parvicapsular anisocaudata probe (bar=100 µm); B, kdney of D1 farm after ISH with Enteromyxum leei probe (bar=50 µm); C, intestine of D2 farm after ISH with E.leei probe (bar=100 µm); D, intestine of D2 farm after ISH with P. anisocaudata probe (bar=100 µm); Arrows, positive reacted cells; ISH, in-situ hybridization.

반면 소화관에서는 E. leei의 반응이 우세하게 관찰되었다. 장 상피 내에 포자 형성이 명확하게 관찰되는 조직표본에서 E. leei 에 대한 ISH반응 또한 명확하게 관찰된다(Fig. 3A, 3B, 3C). 소화관 조직에서 P. anisocaudata에 대한 양성반응을 나타낸 세포가 관찰된 개체는 없었지만 D2의 한 개체에서 장상피 점액세포 내에서 양성반응이 관찰되었다(Fig. 3D).

D1의 생식소 조직에서 관찰된 다량의 원생생물은 Scuticociliate에 대하여 ISH반응을 나타내었다(Fig. 2C). K. septempuctata에 대한 ISH반응은 모두 음성으로 확인되었다.

고찰

양식 넙치에서 다양한 점액포자충 감염이 나타나는 가운데 이들에 대한 형태학적 또는 분자학적인 다양한 방법을 통한 연구가 지속되고 있다. 2004년과 2005년에 국내 양식넙치의 비뇨 계조 직에서 Parvicapsular anisocaudata를 비롯한 다른 미동정 점액 포자충의 감염이 보고되었으며(Cho and Kim, 2004; Cho et al., 2005), 같은 시기에 일본 미야자키현 양식넙치에서 점액 포자충에 의한 여윔병의 원인을 Enteromyxum leei로 설명하였다(Yasuda et al., 2005). 초기에는 질병의 발생과 형태학적 연구에 치우쳤으나 최근에는 원인체의 분자학적 분석에 집중하고 있다(Kim et al., 2015; Sekiya et al., 2016). 지금까지의 연구에서는 양식 넙치에서 나타나는 여윔병의 원인을 E. leei로 설명하는 보고들과 함께, 이와 별개로 P. anisocaudata의 비뇨계 조직 내에서 관찰된 내용을 주로 보고하고 있었지만, 이들 점액 포자충의 복합감염에 관한 내용은 찾아보기 힘들다. 이러한 가운데 최근 Metagenomic analysis 또는 Multiplex PCR과 같은 분자진단기법을 활용하여 여윔 증상이 있는 넙치에서 검출되는 기생체를 구분하고 점액포자충감염과 관련요소들과의 상관관계에 관하여 연구한 연구에서는 여윔 증상이 심한 개체일수록 소화관에서 E. leei가 검출되는 비율이 높았지만 방광에서는 여윔 증상과 관계없이 P. anisocaudata가 많은 비율 검출되었다(Shin et al., 2018b). 물론 여윔 증상이 심한 개체에서는 방광에서도 E. leei가 비교적 높은 비율 검출되어 여윔 증상과 E. leei와의 상관관계는 설명되었지만 E. leei만의 감염으로 여윔증이 나타나는 것인지에 관한 의문이 남는다

최근 양식넙치에서 여윔 증상이 나타나는 경우뿐 아니라 복강 내 복수가 저류되는 증상을 보이며 폐사하는 예가 빈번하여 원인분석을 실시한 결과, 부검시 육안적으로 방광과 요관 및 생식관에 심한 염증과 체액고임 현상, 복강 내 복수고임도 동반되어 복부팽만 증상이 나타나고 신장의 조직변성도 함께 나타났다. 현미경으로 방광 내 고인 액체를 관찰하였을 때, 종을 구분하지 못한 Parvicalpsular sp. 와 다양한 형태로 관찰되는 점액 포자충류의 plasmodium이 관찰되었다. 최근 한국의 양식 넙치 방광 내에서 관찰된 점액포자충과 관련한 보고에서 Parvicapsular 종은 포자의 형태와 위치, 숙주 특이성과 분자학적 특징을 바탕으로 P. curvatura로 설명하고 있지만 다른 점액포자충(P. anisocaudata, Sinuolinea sp., Myxodavisia sp., 그리고 Ortholinea sp.)의 co-infection에 관하여 언급하고 있으며, 최근에는 Myxodavisia jejuensis라는 새로운 종의 동정 결과를 보고하였다(Shin et al., 2018a, 2019b).

본 연구의 병리조직학적 검사에서 신장에서의 조직변성이 심한 개체는 장상피 변성 혹은 장상피에서 E. leei의 포자증식 상이 관찰되었다. PCR검사에서는 신장에서만 P. anisocaudata 가 검출되었지만, ISH 반응검사에서는 D2를 제외하고 신장에서 P. anisocaudata와 함께 E. leei가 반응세포수는 적었지만 모두 검출되었다. 또한 모든 소화관에서 P. anisocaudata가 검출되지 않은 가운데 D2의 소화관 점액세포 내에서 반응 양성이 확인되어 이후 추가적인 조사가 필요할 것으로 보인다(Table 4, Table 5, Table 6). 최근에 양식 넙치에서 보고된 Parvicapsular 종 가운데 P. curvature에 대한 추가 실험과 염기서열 분석으로 신장조직에서는 2개소 3개 시료에서 검출되었으나 소화관에서는 역시 검출되지 않았다(data not shown). PCR검사에서 K. septempunctata가 D1수조의 소화관 조직에서 검출되었지만 ISH 반응에서는 K. septempunctata에 대한 반응은 모든 샘플에서 음성으로 나타나 앞으로 더 많은 감염 개체를 대상으로 분석이 필요할 것으로 생각된다.

Table 6. The result of ISH (in-situ hybridization) reaction against 4 kinds of probe

K, kidney; I, intestine.

이처럼 지금까지의 보고에서는 물론 본 연구에서도 다양한 점액 포자충이 신장, 소화관에서 검출되고 있음이 확인되었다. K. septempunctata는 근육조직에서, E. leei는 장상피조직에서 포자가 명확히 관찰되고, P. anisocaudata는 방광액에서 유주형의 포자충이 다량 관찰된다. 그러나 본 연구에서 관찰한 결과, plasmodium의 경우 신장조직 내에 P. anisocaudata가 우세하지만 E. leei도 검출되었으며, PCR검사에서 소화관 조직에서 K. septempunctata가 검출된 예도 있다. H&E 염색을 통한 신장조직의 관찰에서는 다양한 형태의 영양체(trophic stage)가 관찰되어 본 연구에서 동정되지 않은 점액포자충의 감염도 의심되었다. 또한 plasmodium보다 그 크기가 큰 원생생물이 생식소에서 관찰되어 ISH로 확인한 결과 Scuticociliate인 것으로 확인되어 점액포자충 만이 아니라 섬모충도 복합감염 되어 있었다.

Scuticociliate는 지금까지 넙치의 체표와 아가미에서 감염증상을 주로 관찰할 수 있으며 증상이 진행되면 근육과 신경조직인 뇌로 이동하여 나타나는 것으로 알려져 있지만(Moustafa et al., 2010), 최근 분자학적 검사에서 장과 신장에서도 검출되는 것이 보고되었다(Kim et al., 2019). 본 연구 결과에서 주목할만한 점은 스쿠티카충의 감염이 확인된 D1수조는 다른 수조들에 비해 신장 병변이 약하고 소화관 상피내 포자형성이 나타나는 개체가 없어 본문의 넙치에서 나타나는 병적 증상과 관련한 직접적 연관성을 설명하기 어렵다. 따라서, 생식소의 scuticociliate 감염에 관해서는 더 많은 관찰과 고찰이 필요할 것으로 생각된다.

넙치의 비뇨생식관이 체외부로 연결되는 말단에서 합류하는 특성상 요관과 생식관을 통해 신장조직 또는 생식소에 포자충류의 감염이 이루어질 수 있다. 신장의 세뇨관 혹은 요관 내 포자충의 증식과 사구체의 변성은 신장기능의 이상을 가져올 수 있으며, 요관 말단의 확장부인 방광에서의 염증 발생과 방광 내 염증성 체액이 고이는 증상은 신장의 조직변성과 괴사로 이어져 어체의 체액 발란스를 무너뜨리는 결정적인 요인이 될 수 있고, 이것은 어체의 폐사로 이어 질 수 있을 것으로 보인다.

연어과 어류에서는 Parvicapsular sp.의 신장 감염이 신장 부종은 물론 사구체(glomeruli)와 세뇨관(renal tubule)상피에 영양체(trophozoites)가 잔류하며 조직에 영향을 미치는 예를 보고하였으며(Jones et al., 2004a, 2004b), PKD(prolifeative kidney diseae)는 Tetracapsuloides bryosalmonae가 원인이지만 어종과 연령에 따라 증상의 정도도 달라지며 발생 시기 도정해져 있는 것으로 설명하고 있다(Stephen and Matt, 2006).

양식 넙치에서 최근 여윔 증상을 비롯한 복부 팽창 등 그 증상에 대한 원인을 한가지의 병원체로 단정짓기 어려운 질병의 발생이 매년 지속되고 있는 상황에서 점액포자충이 가장 유력한 원인으로 지목되고 있다. 그러나 아직 원인으로 크게 거론되지 않는 Scuticociliate와 같은 섬모충의 생식소 내 감염과 동정 되지 않은 점액포자충류의 검출은 의외의 다양한 미세기생충이 복합적으로 관여하여 발병할 가능성을 고려해 보아야 하는 것은 아닐까 생각된다. 관련 병증의 발생 조건에 대한 정확한 데이터베이스를 기반으로 예방할 수 있는 방법에 대한 연구도 집중적으로 이루어져야 할 것이며, 또한 이후 유사 병증이 나타나는 경우에 비뇨생식계의 분자생물학적, 병리조직학적인 계획적인 검토는 물론 혈액 성분의 분석도 추가적으로 실시해 볼 필요가 있을 것으로 생각된다. 본 연구를 통하여 넙치양식장의 연안에서 발생하는 해양미생물이 양식 환경에 미치는 영향에 대하여 조금 더 고민해 보아야 할 것으로 여겨진다.