Optimal pH and Immersion Time for the Organic Acid-activating Treatment of Pyropia yezoensis and Ulva linza

방사무늬김(Pyropia yezoensis)과 잎파래(Ulva linza)의 유기산활성처리에 대한 최적 pH와 침지시간

Abstract

Herein, two experiments were performed to determine the appropriate pH range and immersion time for organic acid-activating treatment (OAT) in a Pyropia farm. The effects of pH (0.50, 0.75, 1.00, 1.25, 1.50, 1.75, and 2.00) on the cell mortality of Pyropia yezoensis and Ulva linza thalli were tested after 20 sec of immersion under OAT. In addition, the cell mortality of the two species was estimated under various combinations of immersion time (30, 60, and 120 sec) and pH (1.00, 1.50, and 2.00). Upon 20 sec of immersion under OAT conditions, the cell mortality of P. yezoensis did not differ at any pH but that of U. linza exceeded 90% at a pH range of 0.50-1.00. P. yezoensis showed little cell mortality upon 30 sec of immersion, but its mortality exceeded 55% upon 120 sec of immersion at a pH range of 1.00-1.50. U. linza showed 67.9-100% mortality at a pH of 1.50 and 100% mortality at a pH of 1.00, regardless of the immersion time (30-120 sec). These results indicate that for the effective removal of U. linza, the optimal pH range is 1.00-1.50 and the optimal immersion time is 20-30 sec.

서론

우리나라에서 김류(Pyropia spp.)의 인공채묘 기술이 개발되기 전에는 주로 참김(Pyropia tenera)이 양식되었으나, 점차 육종기술이 개발됨에 따라 방사무늬김(P. yezoensis), 잇바디돌김(P. dentate)과 모무늬돌김(P. seriata)이 주요한 양식 종이 되었다. 방사무늬김은 현재 국내 김 생산량의 대부분을 차지하며, 2018년 이후에는 연간 40만톤이상의 생산량을 보였다 (MFAFF, 2018). 국내 양식 김의 생산량 증대는 1980년대 부류식 양식기술개발과 1990년대 활성처리제 사용이 중요한 전환점이 되었다(NIFS, 2018). 부류식 양식법은 김 엽체가 대기에 노출되지 않음으로써 지주식 양식방법에 비해 규조류, 그리고 파래류와 같은 다른 해조류가 번무하여 김의 품질을 저하시키는 단점을 보였다(Song et al., 1993; Park and Kim, 2013). 활성처리제는 부류식 양식방법에서 김 엽체와 김발에 착생된다른 생물(규조류, 잡조류, 동물)을 제거하고, 갯병을 억제하여 김의 품질향상 및 생산성 증대를 목적으로 사용된다(Akizuki et al., 2009; Kim, 2010). 활성처리법은 적정한 pH로 조절된 해수에 김발을 일정시간 침지시켜 산성에 대한 생리적 차이로 짧은 시간에 유해한 다른 생물을 제거하여 양식 김의 활성을 증가시키는 것이다(Fuseya et al., 1980). 국내에서는 1994년에 김 양식장에서 활성처리제 사용 기준이 고시된 이후 유기산, 전해수, 고염수와 영양물질 활성처리제가 고시(제2017-131호 2017. 9.22)되어 시판되고 있으며, 유기산활성처리제가 가장 많이 사용되고 있다. 김 양식장에서는 어업인들이 시판되는 활성처리제 중에서 한 개의 제품을 선택하고 경험적으로 활성처리제 사용 시기, 희석 비율(pH), 침지 시간을 결정한다(Park and Kim, 2013). 어업인들은 활성처리선이라 불리는 선박에 활성 처리제를 첨가하여 적정한 pH를 가진 해수용액에 김발을 담근 후 20 초 정도의 침지 시간이 되도록 처리한다. 침지 시간은 김발이 선상의 활성처리제 희석액에 처음 침지된 시간부터 김발이 이동하여 현장 해수에 다시 잠길 때까지 시간을 말한다. 또한, 김이 부착된 김발은 해수를 함유하고 있어 활성처리제 희석액의 농도는 처리 시간의 경과에 따라 pH가 지속적으로 변화하게 되므로 어업인은 작업 중간에 활성처리제를 추가하여 적절한 pH 를 유지시키고 있다. 더구나, 최근에는 김의 가격상승으로 인하여 어업인들은 김 생산량 증대를 위하여 밀식하거나 불법으로 김 양식장을 시설하고 있다. 이로 인하여 갯병 발생 빈도와 잡조류 생물량 증가를 초래하였으며, 활성처리제를 갯병 억제와잡조류 구제를 위해 남용하는 악순환으로 연결되어 김 양식장을 포함한 연안의 환경문제는 날로 심각해지고 있는 실정이다 (Lee et al., 2019).

따라서, 김 양식장에서 양식장 환경을 보호하며, 어업인의 경제적 비용 절감을 위하여 유기산활성처리제의 적절한 pH 범위 및 침지 시간에 대한 기준이 마련되어야 할 것이다. 본 연구는 양식 대상종인 방사무늬김 엽체의 피해를 최소화하면서 잡조류인 잎파래(Ulva linza)를 구제할 수 있는 유기산 활성처리제의 최적 pH와 침지 시간을 파악할 목적으로 수행되었다. 최종적으로, 현장에서 양식 김에 대한 활성처리제의 적정 사용 기준을 마련하고자 하였다.

재료 및 방법

유기산활성처리제의 pH 농도와 침지 시간이 양식종 방사무늬김과 잡조류 잎파래의 엽체에 미치는 영향을 파악하기 위하여, 방사무늬김은 전남 고흥군 도화면 구암리의 김 양식장(34^o 46' 84" N, 127^o 29' 06" E)에서, 그리고 잎파래는 전남 해남군 통호리의 파래 양식장(34^o 31' 55" N, 126^o 56' 31" E)에서 2020 년 2월에 채집되었다. 실험에 사용된 방사무늬김은 엽장이 10- 20 cm였고, 잎파래는 5-10 cm였다.

방사무늬김과 잎파래의 활성처리 효과는 해양수산부고시( 제2017-131호, 2017. 9.22)의 유기산을 주성분으로 하는 활성 처리제를 이용하여 엽체 세포의 사망율을 측정하였다(Saga, 1989). 유기산활성처리제는 염산(HCl) 9.5%와 구연산(C₆H₈O₇ 수화물) 10%로 구성하여 제조하였다. 수소이온농도(pH)는 제조된 유기산활성처리제에 해수(32-34 psu, pH 8.12-8.13)를 넣어 희석하는 방법으로 제조하였으며, 실험용 pH 농도는 실온 (20°C)에서 유리전극(Orion 3 Star; Thermo Science, Waltham, MA, USA)을 이용하여 확인하였다.

김 양식장에서 김발의 침지 시간을 20초로 기준하였을 때, 유기산 활성처리제의 적절한 pH농도를 파악하기 위하여 다양한 pH (0.50, 0.75, 1.00, 1.25, 1.50, 1.75, 2.00)로 실험을 실시하였다. 또한, 유기산활성처리제 pH 농도와 침지 시간의 최적 조합을 확인하기 위하여, 3개의 pH (1.00, 1.50, 2.00)와 침지시간 (30초, 60초, 120초)이 조합된 실험조건에서 방사무늬김과 잎파래의 활성처리 효과를 엽체의 세포 사망율로 검정하였다. 모든 실험에서 대조구는 유기산활성처리제가 혼합되지 않은 해수 (pH 8.12-8.13)를 사용하였으며, 침지 시간은 동일하였다.

방사무늬김과 잎파래의 사망률은 대조구(현장 해수)와 각 실험구에서 유기산활성처리제에 침지된 엽체를 0.1% erythrosin 용액에 5분간 침지하여 염색시킨 후 해수로 3회 세척하였다. 염색된 2종의 엽체는 대조구와 실험구별로 10개체를 무작위로 선택하여 건조 표본을 만들었다. 엽체의 사망률 측정을 위해 디지털카메라로 전엽체를 사진 촬영하였다. 방사무늬김과 잎파래의 대조구 엽체와 세포는 고유의 색상을 보였으며, 유기산 활성처리제에 의해 사망한 엽체와 세포는 붉은색으로 염색되었다(Fig. 1). 방사무늬김과 잎파래의 엽체에서 염색된 사세포는 현미경(BX51; Olympus, Tokyo, Japan)과 영상장치(DP73; Olympus, Tokyo, Japan)로 촬영하였다(Fig. 1). 엽체의 세포 사망률은 Image J 영상처리분석(NIH, Bethesda, MD, USA) 프로그램을 이용하여 엽체의 전체 면적에 대한 사세포를 가진 엽 체 면적을 측정하여 백분율(%)로 표시하였다.

Fig. 1. Photographs of thalli and cells of Pyropia yezoensis and Ulva linza. Colors of P. yezoensis thalli treated in ordinary seawater (A) and in organic acid activating treatment (B). Colors of U. linza thalli treated in ordinary seawater (C) and in organic acid activating treatment (D). All thalli of the two species were stained using 0.1% erythrosin solution. Bar=20 μm.

유기산활성처리제에 대한 침지 시간을 20초로 하고 pH별 실험에서 방사무늬김과 잎파래 세포의 사망률에 대한 유의차 검 정은 일차분산분석(one-way ANOVA)을 이용하였으며, 유의한 차가 확인되면 사후 검정은 Tukey's HSD test로 확인하였다. 방사무늬김과 잎파래의 사망률에 유기산활성처리제의 pH 와 침지 시간의 조합이 미치는 영향은 이차분산분석(two-way ANOVA)으로 유의차를 검정하였다. 실험 데이터의 통계처리는 STATISTICA 프로그램(version 5.0)을 사용하였다.

결과

pH별 방사무늬김과 잎파래 사망율

방사무늬김과 잎파래의 엽체는 대조구(현장 해수)에서는 침시간과 상관없이 종별로 엽체의 고유한 색상을 보였으며, 유기산활성처리제에 침지하여 사망한 세포와 엽체는 붉은색 으로 염색되었다(Fig. 1). 양식 대상종인 방사무늬김은 유기산 활성처리제의 침지 시간이 20초 이내면 pH가 0.50-2.00까지도 세포의 사망률이 1% 이하(0.2-1.0%)로 대조구에서의 사망률 (0.1%)과 유의한 차이를 보이지 않았다(Fig. 2A).

Fig. 2. Average cell mortality (%) of Pyropia yezoensis (A) and Ulva linza thalli (B) after 20 seconds from immersing in organic acid activating treatment agent having different pH. Please note the different scales. Bars indicate mean±SE (n=10 replicates). Different letters present significant difference.

잡조류인 잎파래 세포의 사망률은 유기산활성처리제 침지 시간이 20초일 때, pH농도별로 매우 유의한 차이를 보였다 (P<0.001). 대조구 해수에서 사망률은 0.4%로 최소였고, pH 2.00 농도의 실험구에서는 사망률은 4.2%로서 유의한 차이를 보이지 않았다(Fig. 2B). 하지만, 잎파래 세포의 사망률은 pH 0.50 실험구에서 100%로 최대였으며, pH 1.25-1.75 범위에서 는 23-38%의 세포 사망률을 보였다(Fig. 2B). 유기산활성처리 제의 pH1.00이하의 실험구(pH 0.50-1.00)에서 잎파래 세포는 90%이상이 사멸하였다.

유기산활성처리제에 대한 침지 시간을 20초로 일정하게 유지 하고 다양한 pH(0.50-2.00) 조건에서 실험한 결과, 방사무늬김은 모든 농도에서 1.0% 이하의 사망률을 보였다.

방사무늬김 세포의 사망률은 침지 시간과 pH에 따라 유의한 차이를 보였으며, 이들의 상호작용도 확인되었다(Table 1). 유기산 활성처리제의 pH 2.00에서 방사무늬김 세포의 사망률은침지시간별로 유의한 차이를 보이지 않았으나(P=0.07), pH 1.50에서는 침지 시간에 따라 사망률이 0.1-55%까지 나타남으로써 유의한 차이를 보였다(P<0.001). 하지만, pH 1.50의 유기산 활성 처리제에서는 침지 시간 60초와 120초의 실험 구에서는 김 세포의 사망률이 51%와 55%로서 유의한 차이를 보이지 않았다(Tukey HSD test, Fig. 3A). 활성처리제의 pH 1.00 실험 구에서는 침지 시간별로 김 세포 사망률에 유의한 차이를 보였으며(P<0.001), 사후 검정에서도 사망률은 0.8% (30초), 79.2% (60초)와 100% (120초)로 침지시간별로 유의한 차이를 나타냈다(Fig. 3A).

Table 1. Results of two-way ANOVA tests for mortality (%) of Pyropia yezoensis and Ulva linza thalli after immersion in organic acid activating treatment agent having different pH and immersion time

Fig. 3. Average cell mortality (%) of Pyropia yezoensis (A) and Ulva linza thalli (B) after immersion for 30, 60, and 120 seconds in organic acid activating treatment agent having different pH. Bars indicate mean±SE (n=10 replicates).

잎파래 세포의 사망률은 침지 시간과 pH 농도에 따라 유의한 차이를 보였으며, 이들의 상호작용도 확인되었다(Table 1). 유기산 활성처리제의 pH 2.00에서 잎파래 세포의 사망률은 4.8- 83.1%로 침지 시간에 비례하여 증가하였으며(Fig. 3B), 침지 시간별로 모두 통계적으로 유의한 차이를 보였다(P<0.001). 잎파래 세포의 사망률은 pH 1.50에서 67.9% (30초), 89.8% (60 초)와 100% (120초)로 침지시간별로 유의한 차이를 보였다 (Tukey HSD test; Fig. 3B). 활성처리제의 pH 1.00 실험 구에서는 침지 시간에 상관없이 잎파래 세포의 사망률은 100%로서 침지시간에 비해 pH의 영향이 많다는 것을 확인할 수 있었다(Fig. 3B).

방사무늬김과 잎파래 엽체에 대한 유기산활성처리제의 pH 농도와 침지 시간의 조합조건에서 세포의 사망률을 확인한 결과, 잎파래가 방사무늬김에 비해 pH감소에 따라서 사망률이 높게 나타남을 확인하였다. 특히, 유기산활성처리제의 pH 1.00과 pH 1.50에서는 30초의 침지 시간을 줄 때 방사무늬김에는 피해를 최소화하면서 잎파래의 세포 사망률은 67.9-100%로 증가 시켜 구제 효과가 나타났다.

유기산활성처리제 침지 시간과 pH에 따른 방사무늬김과 잎파래의 사망률

방사무늬김 세포의 사망률은 침지 시간과 pH에 따라 유의한 차이를 보였으며, 이들의 상호작용도 확인되었다(Table 1). 유기산활성처리제의 pH 2.00에서 방사무늬김 세포의 사망률은 침지시간별로 유의한 차이를 보이지 않았으나(P=0.07), pH 1.50에서는 침지 시간에 따라 사망률이 0.1-55%까지 나타남으로써 유의한 차이를 보였다(P<0.001). 하지만, pH 1.50의 유기 산활성처리제에서는 침지 시간 60초와 120초의 실험구에서는 김 세포의 사망률이 51%와 55%로서 유의한 차이를 보이지 않 았다(Tukey HSD test, Fig. 3A). 활성처리제의 pH 1.00 실험구 에서는 침지 시간별로 김 세포 사망률에 유의한 차이를 보였으 며(P<0.001), 사후 검정에서도 사망률은 0.8% (30초), 79.2% (60초)와 100% (120초)로 침지시간별로 유의한 차이를 나타 냈다(Fig. 3A).

잎파래 세포의 사망률은 침지 시간과 pH 농도에 따라 유의한 차이를 보였으며, 이들의 상호작용도 확인되었다(Table 1). 유기산활성처리제의 pH 2.00에서 잎파래 세포의 사망률은 4.8- 83.1%로 침지 시간에 비례하여 증가하였으며(Fig. 3B), 침지 시간별로 모두 통계적으로 유의한 차이를 보였다(P<0.001). 잎 파래 세포의 사망률은 pH 1.50에서 67.9% (30초), 89.8% (60초)와 100% (120초)로 침지시간별로 유의한 차이를 보였다 (Tukey HSD test; Fig. 3B). 활성처리제의 pH 1.00 실험구에 서는 침지 시간에 상관없이 잎파래 세포의 사망률은 100%로 서 침지시간에 비해 pH의 영향이 많다는 것을 확인할 수 있었다(Fig. 3B).

방사무늬김과 잎파래 엽체에 대한 유기산활성처리제의 pH 농도와 침지 시간의 조합조건에서 세포의 사망률을 확인한 결 과, 잎파래가 방사무늬김에 비해 pH감소에 따라서 사망률이 높 게 나타남을 확인하였다. 특히, 유기산활성처리제의 pH 1.00과 pH 1.50에서는 30초의 침지 시간을 줄 때 방사무늬김에는 피해 를 최소화하면서 잎파래의 세포 사망률은 67.9-100%로 증가시켜 구제 효과가 나타났다.

고찰

김 양식에서 활성처리는 김발과 김엽체에 부착하는 파래와 규조류를 제거하기 위하여 생리적 활성 차이를 이용한 물리적 인대기 노출 방법과 김에 비해 내산성이 약한 경쟁 생물의 특성을 이용한 산처리 방법이 개발되었다(Fuseya et al., 1980; Kang and Shin, 2002). 김 양식장에서 활성처리제를 사용할 때 가장 중요한 것은 김 엽체에 주는 피해를 최소화하면서 파래류와 규조류를 제거할 수 있는 적정 농도에서 적당한 침지 시간을 처리하는 것이다. 일본에서는 식품첨가물로서 승인된 유기산과인산이 혼합된 활성처리제를 pH 2.00 정도로 희석하여 김발을 6-10분간 침지시키는 방법을 사용한다(Fuseya et al., 1980; Takayama et al., 1983; Kotani, 2006; Akizuki et al., 2009).

Park and Kim (2013)은 2010년 활성처리제 고시 기준(유기산 15%과 무기산 8.0-9.5%)에 따라 시판되는 유기산 활성 처리제를 해수로 100배(pH 1.40)와 150배(pH 1.70)로 희석하여 현장에서 3분 침지한 결과 방사무늬김 세포의 사망률(사세포율) 은 대조구와 유의한 차이를 보이지 않았으나, 참홑파래(Mono- stroma nitidum)의 사망률은 99-100%로 유의한 차이를 나타냈다. 또한 방사무늬김의 유엽에 비해 성엽에서 세포의 사망률은 높게 나타나며, 유기산활성처리제의 40배 희석액(pH 1.00) 에 1분 이상 침지 시킨 성엽의 세포 사망률은 100%로 기록하였다(Park and Kim, 2013). 본 연구에서 pH 1.00인 유기산활성처리제 희석 용액에 1-2분 동안 침지시킨 방사무늬김의 세포 사망률은 79.2-100%로 확인됨으로써 pH 1.00이하에서 1분 이상 침지는 김 엽체에 심각한 피해를 주는 것으로 나타났다. Park and Kim (2013)은 참홑파래가 활성처리제에 1분 침지하면 40 배(pH 1.00)부터 200배(pH 1.90) 희석용액에서 90% 이상 사멸하였다고 보고하였다.

본 연구 결과, 잎파래는 20초 침지의 pH 0.50-1.00 실험 구에서 90.0% 이상의 사망률을 보임으로써 잎파래의 구제를 위해서는 유기산활성처리제 농도를 pH 0.50-1.00 범위로 처리하는 것이 효과적인 것으로 확인되었다. 한편, 양식대상종인 방사무늬김은 pH 0.50-2.00 범위의 유기산활성처리제 용액에서 20초침지는 엽체 세포에 피해를 주지 않았으나, pH 1.50 이하 용액에서 1분이상 침지는 세포의 사망률을 증가시켜 엽체에 피해를 초래하는 것으로 판단된다. 따라서, 방사무늬김 양식장에서 유기산활성처리제 처리시 용액의 pH를 기준으로 침지 시간을 다르게 하고 향후에는 김의 생장 단계(초기, 중기, 후기), 잡조류의부착 밀도와 생물량 등을 고려한 실험 디자인을 통한 실내 실험과 현장 적용 결과가 요구된다.