Comparison of the Pathogenicity of Infectious Hematopoietic Necrosis Virus Genotypes Isolated from Rainbow Trout in Gangwon Province

무지개송어에서 분리된 IHNV (감염성 조혈 괴사바이러스) 유전자형에 따른 병원성 비교

Abstract

This study investigated the pathogenicity of different genotypes of infectious hematopoietic necrosis virus (IHNV) strains isolated from infected rainbow trout in Gangwon Province. RtPc0314c and RtPc0314g strains belonging to the JRt-Shizuoka lineage and RtPc0816g strain belonging to the JRt-Nagano lineage showed 100% cumulative mortality when inoculated at a high titer. In addition, more rapid necrosis was observed in rainbow trout infected with RtPc0314c and RtPc0314g mutations. When inoculated at a low titer, 100% mortality was not observed until the end of the experiment, but the mortality was higher in rainbow trout infected with a mutant strain belonging to the JRt-Shizuoka linage than a mutant strain belonging to the JRt-Nagano lineage. A histopathological analysis showed a clear signature of infection in kidney and spleen tissues upon infection with RtPc0314c and RtPc0314g but no signature of infection associated with the Rt03186 strain. Based on the results in this study, it seems that strains belonging to the JRt-Shizuoka lineage in Gangwon Province IHNV are more pathogenic.

본 연구는 강원도지역에서 분리된 전염성조혈기괴사증 바이러스(Infectious Hematopoietic Necrosis Virus: IHNV) 변이주들의 유전자형에 따른 병원성의 분석에 대한 연구이다. JRt-Shizuoka linage와 JRt-Nagano lineage에 속하는 IHNV 변이주들을 무지개송어 치어에 실험적으로 감염시켜 각 변이주들에 감염된 무지개송어의 폐사율을 비교하고, 병리조직을 관찰하며, 혈청형을 분석하였다. 그 분석의 결과, 고역가로 접종하였을 때 Sizuoka linage에 속하는 RtPc0314c와 RtPc0314g 변이주와 JRt-Nagano lineage에 속하는 RtPc0816g 변이주 모두 100% 누적 폐사율을 보였고, JRt-Shizuoka linage에 속하는 RtPc0314c와 RtPc0314g 변이주에 감염된 무지개송어에서 더 빠른 폐사가 관찰되었다. 저역가로 접종하였을 때에는 실험종료시까지 100% 폐사율을 보이지 않았지만, JRt-Nagano lineage에 속하는 변이주 보다 JRt-Shizuoka linage에 속하는 변이주에 감염된 무지개송어에서 더 높은 폐사율을 보였다. 또한 병리조직 분석 결과 RtPc0314c와 RtPc0314g 변이주에 감염된 무지개 송어의 신장과 비장 조직에서는 감염 증상이 확인되었지만, RtPc0816g 변이주에 감염된 무지개송어에서는 감염 증상이 확인되지 않았다. 하지만 이들 변이주들간의 구조 단백질, 혈청형에서는 차이가 없었다. 이러한 결과로 볼 때 강원도 지역에서 분리된 IHNV는 비록 구조 단백질과 혈청형의 차이는 나타나지 않았지만, JRt-Shizuoka lineage에 속하는 변이주들의 병원성이 더 높음을 확인할 수 있었다.

서론

전염성조혈기괴사증(Infectious Hematopoietic Necrosis: IHN)은 연어, 무지개송어를 비롯한 연어과 어류의 치어에 감염이 되면 큰 피해를 주는 바이러스성 질병이다[1,20]. IHN 바이러스(IHNV)는 Rhabdoviridae novirhabdo- virus 에 속하며 대략 11Kb의 염기서열을 가지고 있는 negative-sense RNA 바이러스이다[13]. IHNV는 L (RNA polymerase, 150-225 kDa) 외에 G (glycoprotein, 63~80 kDa), N (nucleoprotein, 38~47 kDa), P (phosphoprotein, 22~26 kDa), M (matrix pro- tein, 17~22 kDa)의 4개의 구조 단백질과 novirhabdo- virus 속에 속하는 바이러스들이 가지고 있는 특징적인 NV (non-vi- rion protein) 유전자로 구성된 것으로 알려져 있다[9,19].

미국의 홍연어(Sockeye salmon)와 왕연어(Chinook sal- mon)의 치어에서 발견되는 토속 바이러스 IHNV는 북아메리카 전역으로 확산되면서 IHNV의 G와 NV 유전자들의 계통학적 분석을 바탕으로 IHNV 변이들과 지역적 발생이 상응되는 것이 밝혀졌으며[15], 북미의 북부, 중부, 남부 지역에서 분리한 바이러스의 genogroup은 점차 세분화 되었다[5,10]. IHNV 에 감염된 감염어와 오염된 난의 국가간 이동으로 인하여 유럽과 아시아의 여러 국가들로 확산이 되어 5개의 genogroup 이 보고되었고 지역적 감염에 따라 점차 더 세분화 되고 있다 [4, 8, 16, 17].

국내에서는 1990년대 일본으로부터 IHNV에 오염된 무지개송어의 난이 수입되어 국내에 IHNV가 확산된 것으로 추정하며[8, 16, 18], JRt-그룹에는 지리적으로 상응하는 2개의 계통 Shizuoka와 Nagano lineage가 있는 것으로 알려져 있다[2, 6, 7, 14, 16, 17].

강원도 지역은 연중 15℃ 이하의 수온을 유지할 수 있어 국내에서는 연어과 어류 양식의 적지로 평가되며, 무지개송어를 비롯해 산천어와 은연어 양식장이 집중되어 있다. 그러나 종자 생산 단계에서부터 IHNV에 의한 폐사가 보고되고 있다. Kim 등은(2016), 2013년부터 2015년까지 강원도 지역에서 발생된 IHNV 변이들의 glycoprotein (G) gene의 계통 발생 학적 분석과 주요 아미노산들의(아미노산 잔기 270, 274-777, 286) 변이에 따른 병원성을 보고하였다. JRt-Nagano lineage 에서는 VGAKTK, VGAKTN, EGAKEE, GGAKET, GGSKTE와 같은 아미노산 변이가 나타났고 JRt-Shizuoka lineage에서는 EGAEIK, VGAEIK, VGAVTK, VGSVTK, VGSVTM, AESATK 와 같은 아미노산 변이가 나타났다. 특히, JRt-Shizuoka line- age에서 AESATK 아미노산 변이는 병원성이 가장 높은 특성을 보였다고 보고되었다[7, 14, 17].

이전 연구들에 의하면, IHNV는 환경 및 유전형에 따라 연어과 어류에서도 병원성의 차이가 나타나며 감염어에 특이적인 반응을 하는 것으로 보고되었다[11, 12, 21]. 그러나 국내에서는 IHNV의 유전형에 따른 특이성 및 병원성에 대한 연구는 미흡한 실정이며 백신의 개발은 지속적으로 필요로 하고 있으나 RNA 바이러스 특성상 빠른 변이로 인해 백신 개발에 어려움이 따르고 있다.

본 연구에서는 강원도 지역에서 보고된 변이주 중 JRt- Shizuoka lineage에 속하는 RtPc0314c와 RtPc0314g 그리고 JRt-Nagano lineage에 속하는 RtPc0816g를 대상으로 유전형에 따른 병원성을 무지개송어의 치어에서 실험적으로 평가하였다. 또한 아직까지 공식적으로 인정되는 표준 혈청형은 정해진 바 없지만 이들 변이주의 혈청형을 비교하였다.

더 많은 변이주들에 따른 특성 및 병원성에 대한 연구가 필요하지만 본 연구는 앞으로 국내 IHNV 변이주들의 특성을 이해하고, 감염에 대응하기 위한 기초 자료로 기여할 것으로 기대한다.

재료 및 방법

바이러스 및 세포 배양

Epithelioma papulosum cyprini (EPC) 세포(ECACC, 9312 0820)는 25T flask에서 (SPL) 1×10⁹ cell/ml 농도로 Leibovitz-15 medium과 함께 10% fetal bovine serum (FBS; Welgene, S101-01), 1% antibiotic-antimycotic (Gibco, 15240-062)를 처리하였으며 15℃에서 24시간 동안 단층형성 후 0.1 MOI (multi- plicity of infection)로 IHNV 변이들을 접종하였다. 실험에 사용된 IHNV 변이주들은 동해수산연구소로부터 제공받았으며, 바이러스 감염가를 plaque assay법으로 측정하였다. IHNV 변이주는 JRt-Shizuoka lineage인 RtPc0314c, RtPc0314g와 JRt- Nagano lineage에 속하는 RtPc0618g를 선택하였다.

Fig. 1. Cytopathic effect (CPE) on EPC cell. IHNV isolates (B) RtPc0314c, (C) RtPc0314g, (D) RtPc0816g in Gangwon-province showed CPE on EPC cell 3days after inoculation.

실험적 감염

실험에 사용된 무지개송어는 경상북도 상주의 양어장에서 체중 10 g 이하, 전장 10~15 cm 사이의 치어를 구입하였다. 각 탱크 당 20 마리의 무지개송어 치어는 100 l의 유수식 원형 탱크에서 14.5±0.5℃의 수온을 유지하며 2주간 순치시킨 후 실험하였다. 대조군으로 HBSS 완충액을 0.1 ml 복강 주사하였고 IHNV 변이 RtPC0314c, RtPc0314g, RtPc0816g를 저역가 7×10⁵ PFU/ml와 고역가 7×10⁷ PFU/ml 로 0.1 ml로 복강 주사하였다. 모든 동물 실험 절차는 기관 지침에 따라 부산 대학교 IACUC를 준수했습니다(PNU-2017-1562).

병리조직학적 분석

각 시험구에서 시험어의 신장과 비장을 10% 중성포르말린에 고정하여 5~6 μm 두께의 파라핀 박편을 제작한 후(Hema- toxylin & eosin) H&E 염색을 실시하여 광학현미경으로 관찰하였다.

Fig. 2. Cumulative mortality (%) according to experimental infection. (A) Cumulative mortality (%) for 2 weeks after injection 7×10⁶ PFU isolates into abdominal cavity of rainbow trout. (B) Cumulative mortality (%) for 2 weeks after injection 7×10⁴ PFU isolates into abdominal cavity of Rainbow trout. IHNV isolates: RtPc0314c (◆), RtPc0314g (O) and RtPc0816g (▲), as a control of HBSS buffer (□).

Fig. 3. Symptoms of rainbow trout after experimental infection of IHNV isolates. Rainbow trout infected with IHNV revealed symptoms such as (A) pale gills, (B) dark skin or eyes, abdominal swelling, (C) hernia, (D) fin bleeding and (E) swollen intestine.

폴리클로날 항체 제작

혈청형 분석을 위해 0.3% formaldehyde로 불활화 시킨 1 μg/μl의 IHNV 변이주MsYy0613b, RtPc0314g 100 μl를 Freund’s adjuvant (Promega, USA)와 함께 1주일 간격으로 4회 주사하여 폴리클로날 항체를 생산하였다. 생산된 항체는 면역 학적 분석에 이용되었다.

SDS-PAGE와 Western blot

EPC 세포에서 배양된 RtPc0314c, RtPc0314g, RtPc0618g IHNV 변이주들은 10% SDS-PAGE와 Western blot법을 이용하여 구조단백질을 확인하였으며 분리주들의 혈청형 분석을 위해 감염어에서 채취한 혈장을 Western blot으로 확인하였다. 전기영동한 단백질들은 45 mm Immobilon-NC transfer membranes (Millipore, USA)에 옮긴 후 3% BSA로 2시간 동안 blocking하고 1차 항체로는 불활화한 MsYy0613b와 RtPc0314g를 마우스에 주사하여 제작한 폴리클로날 항체를 4℃에서 overnight 처리한 후 Horseradish peroxidase (HRP) 가 붙어 있는 goat anti-mouse IgG (Sigma, USA)로 반응시켜 WesternBrght^TM ECL solution (Advansta, USA)를 사용하여 발색 후 SRX-101A (Konica Minolta, Japan)를 사용해서 현상하였다.

Fig. 4. H&E staining from kidney and spleen of randomly selected rainbow trout 7days after infection with IHNV.

Fig. 5. Analysis of Structural protein and serotype from IHNV isolates. (A) Structural protein of IHNV isolates (10% SDS-PAGE). (B) Structural protein of IHNV isolates by western blotting (C-D) Analysis of serotype from rainbow trout plasma after experimental infection. Primary antibody: Anti-MsYy0613 (C), Anti-RtPc0314d (D)

결과 및 고찰

세포변성 효과 결과

본 연구에서는 무지개송어 양식장에서 빈번히 발생하는 IHNV 변이들에 대해 강원도 지역에서 보고된 두 유전형 JRt- shizuoka lineage와 JRt-Nagano lineage의 병원성에 대한 실험적 검증을 하였다. JRt-shizuoka lineage인 RtPc0314c, RtPc0314g와 JRt-Nagano lineage인 RtPc0618g IHNV 변이주들을 EPC 세포에 0.1 MOI로 접종하였을 때, 바이러스 접종 후 3일째부터 세포변성 효과가 나타나기 시작하였으며 세포 수준에서 이들 IHNV 변이주들의 역가 차이는 나타나지 않았다(Fig. 1).

누적폐사율 비교 결과

무지개송어 치어를 저역가(7×10⁴ PFU)와 고역가(7×10⁶ PFU)로 각각 접종하였으며 바이러스 접종 후 2주간 누적 폐사율을 나타내었다(Fig. 2). 고역가로 접종된 무지개송어는 RtPc0314c 변이주에서 가장 먼저 폐사 개체가 나타났으며 감염 6일 후 100% 누적폐사율을 보였다. RtPc0314g 변이주 또한 감염 7일 후 100% 누적폐사율이 나타났다. 반면에 RtPc0816g 변이주에 감염된 시험구는 감염 12일 후에 100% 누적 폐사율을 보였다(Fig. 2A). 한편, 저역가에 감염된 무지개송어 시험 구의 누적폐사율은 실험 종료 시에 RtPc0314c 변이주는 62.5%, RtPc0314g 변이주는 75%, RtPc0816g 변이는 20%의 누적 폐사율을 나타냈으며 HBSS 완충액을 주사한 대조구에서는 폐사 개체가 나타나지 않았다(Fig. 2B).

병리조직학적 분석 결과

IHNV 변이주들에 감염된 무지개송어는 아가미가 창백해지거나 검은 피부 및 눈, 탈장, 아가미 출혈, 부풀어 오른 장, 복부 팽창 등의 증상들이 나타났다(Fig 3). 고역가 IHNV 변이주들에 감염된 무지개송어에서 감염 6일째에 신장과 비장 조직을 추출하여 조직분석 하였다(Fig. 4). JRt-Shizuoka lineage 인 RtPc0314c (Fig. 4B, Fig. 4F)와 RtPc0314g (Fig. 4C, Fig. 4G) 변이주에 감염된 무지개송어의 신장과 비장에서는 바이러스감염을 보였으나, JRt-Nagano lineage 인 RtPc0816g (Fig. 4D, Fig. 4H) 변이주에 감염된 무지개송어의 신장과 비장에서는 바이러스의 감염이 나타나지 않았다. 비록 세포레벨에서 변이에 따른 두드러진 병원성의 차이가 발견되지는 않았지만, 각 변이 주들을 무지개송어에 감염시켰을 때, 누적폐사율과 병리 조직학적 분석 결과, JRt-Shizuoka lineage와 JRt-Nagano line- age의 병원성은 차이가 나타났으며 JRt-Shizuoka lineage에 속하는 변이주들에서 더 높은 병원성이 나타났다. 이러한 결과는 이전 연구들에서 보고된 JRt-Shizuoka lineage가 JRt-Nagano lineage보다 병원성이 높다는 연구 결과에 상응하였다[7,14].

IHNV 구조 단백질 및 혈청형 분석 결과

IHNV 변이주들의 구조단백질을 SDS-PAGE와 Western blot을 이용해 확인해본 결과 L-G-N-P-M의 분자량에 해당하는 단백질을 확인하였다(Fig. 5A, Fig. 5B). 실험에 사용된 JRt-Shizuoka lineage에 속하는 RtPc0314c와 RtPc0314g 변이주들과 JRt-Nagano lineage에 속하는 RtPc0816g 변이 주에서 구조 단백질의 분자량 차이는 관찰되지 않았다. 또한, 각 IHNV 변이주들에 감염된 무지개송어의 혈액에서 혈청만을 취해 혈청형을 분석한 결과 RtPc0314c, RtPc0314g와 RtPc0816g 변이주들 사이에 혈청학적 차이는 나타나지 않았다(Fig. 5C, Fig. 5D). 이전 연구들에 의하면 항 G 단백질 항체가 바이러스의 중화능력을 가진다는 보고가 있지만[1,3], 본 연구에서 JRt-Shizuoka lineage와 JRt-Nagano lineage 사이에서 혈청형에 따른 병원성의 차이를 분석하기는 어려웠으며 IHNV는 유전형에 따른 병원성을 고려하여 질병 예방에 접근하는 것이 바람직할 것으로 여겨진다.

감사의 글

본 연구는 부산대학교 기본연구지원사업(2019-2020)으로 진행되었습니다.

The Conflict of Interest Statement

The authors declare that they have no conflicts of interest with the contents of this article.