The Radioprotection Effect of Protaetia Brevitarsis Larvae Extracts on the Reproductive in Female Rats Irradiated Gamma Ray

감마선에 조사된 암컷 흰쥐의 생식기관에 대한 흰점박이꽃무지 유충 추출물의 방사선 방호효과

Abstract

The purpose of this study was to examine the radiation protection effect of protaetia brevitarsis larvae extracts known as antioxidant food. In this study 90 female rats were clssified in to 5 groups: NC Group, PBE Group, IR Group, PBE+IR Group and IR+PBE Group. In IR Group, 7 Gy of Co-60 gamma ray was irradiated to SD rat and protaetia brevitarsis larvae extracts were administered orally at 200 mg/kg once a day for 14 days. And then on the 1 day, 7 days, 21 days later after irradiation, changes in blood cell component, superoxide dismutase(SOD) activity, spleen index, histopathological evaluation of the ovary and uterus were observed. As a result, the PBE+IR Group (p<0.01, p<0.05) and IR+PBE Group (p<0.01, p<0.01) showed a significantly radiation protection than the IR Group in lymphocyte and red blood cell on the 21 days. It was also confirmed that SOD activity of PBE+IR Group (p<0.01) and IR+PBE Group (p<0.01) was significantly increased than the IR Group. In spleen index, PBE+IR Group (p<0.05) and IR+PBE Group (p<0.01) showed a significantly recovery than the IR Group. In histopathological observation, PBE+IR Group in the ovary and PBE+IR, IR+PBE Group in the uterus showed less inflammatory reactions of cystoplasm than the IR Group. Based on These results, It is judged that protaetia brevitarsis larvae Extracts have radiation protection effect against blood and reproductive. It is expected to be useful for research of radiation protection agent.

본 연구의 목적은 항산화 식품으로 알려진 흰점박이꽃무지 유충 추출물의 방사선 방호효과를 규명하는 것이다. 90 마리의 암컷 Sprague-Dawley Rat을 일반군(NC Group), 흰점박이꽃무지 유충추출물투여군 (PBE Group), 방사선조사군 (IR Group), 흰점박이꽃무지 유충 추출물 투여후 방사선조사군 (PBE+IR Group), 방사선조사 후 흰점박이꽃무지 유충 추출물 투여군 (IR+PBE Group)의 5개 군으로 분류하였다. 방사선은 7 Gy의 Co-60 감마선을 전신조사 하였고, 흰점박이꽃무지 유충 추출물은 14일 동안 1 일 1 회 200 mg/kg으로 경구투여 하였다. 방사선 조사 후 1 일, 7 일, 21 일 후의 혈구 성분변화, 항산화 (SOD) 활성변화, 비장 지수 변화, 자궁과 난소의 조직병리학적인 변화를 관찰하였다. 실험결과 혈구 성분은 21일차에 림프구, 적혈구에서 IR Group보다 PBE+IR (p<0.01, p<0.05)와 IR+PBE Group (p<0.01, p<0.01)에서 유의한 방사선 방호가 나타났다. 항산화 활성도에서는 IR Group 보다 PBE+IR (p<0.01)와 IR+PBE Group (p<0.01)에서 유의하게 증가한 활성이 나타났다. 비장 지수는 IR Group 보다 PBE+IR Group (p<0.05)과 IR+PBE Group (p<0.01)에서 유의한 방사선 회복이 나타났다. 조직병리학적인 변화에서는 IR Group과 비교하여 난소에서는 PBE+IR Group에서, 자궁에서는 PBE+IR Group과 IR+PBE Group에서 세포질의 팽창과 핵의 응축 및 세포 고사가 다소 감소된 것이 관찰되었다. 이는 흰점박이꽃무지 유충 추출물이 방사선 조사에 따른 혈구 및 생식기에 대한 방사선 방호효과가 있는 것으로 판단되고 방사선 방호제 연구에 유용하게 사용될 것으로 기대된다.

Ⅰ. INTRODUCTION

1895년 뢴트겐 (W.C Roentgen)에 의해 X-선이 발견된 이후로 방사선 및 방사성동위원소는 현재 암 치료, 핵의학, 비파괴검사, 품종개량, 하천 수질관리 등의 다양한 분야에서 광범위하게 이용되고 있다^[1,2]. 하지만 방사성동위원소를 테러에 악용한다면 공포와 공황 등의 사회적 파장이 앞선 후쿠시마 원전사고 및 브라질 고이아니아 방사성동위원소 누출사고 때보다 클 것으로 예상된다.

방사선에 피폭되면 인체는 방사선으로 인한 여러 가지 심각한 장해를 유발하게 되는데 주로 직접 손상과 간접 손상이 작용한다. 직접 손상은 고 LET의 방사선에서 작용하는데 방사선이 물질 내에 직 접 전달하고 흡수하여 조직에 장해를 일으키는 것을 말하며 간접 손상은 저 LET 방사선에서 생성된 자유라디칼 (Free radical) 및 활성산소가 인체 내 단백질의 DNA나 SH기와 반응하여 DNA 손상, 세포 사멸 및 암을 발생시키는 것을 말한다^[3,4].

이 중 간접손상에 의한 피해는 직접손상에 의한 피해에 비교해 더 높은 확률로 나타난다. 입사한 방사선은 세포의 약 70%를 구성하는 물과 상호작용을 하여 물분자를 이온화시킨다. 이온화된 물분 자는 다른 물분자와 화학작용을 하여 자유라디칼 및 활성산소가 생성된다^[5]. 이들은 매우 불안정안 상태로 주변의 DNA와 염색체 (Chromosome) 등을 산화시키고 손상을 입은 염색체는 이중절단이 일어나고 그 결과로 세포자연사 (Apoptosis) 과정을 거치며 질병을 얻게 되고 심할 경우 사망에 이른다. 이것은 인체 내에 존재하는 자유라디칼 및 활성산소 생성을 억제하거나 이미 생성된 자유라디 칼과 활성산소를 제거하여 그 피해를 최소화 할 수 있다.

방사선 방호물질 연구는 자유라디칼 및 활성산소를 억제하는 항산화에서 비롯되고 있다. 항산화 효과가 있는 물질을 이용한 방사선 방호연구는 반드시 필요하며, 부작용이 많은 화학적 물질이 아닌 천연물을 활용한 방사선 방호물질 연구 및 방호제 개발의 필요성이 부각되고 있다^[6-12].

본 연구에서 추출물로 사용한 흰점박이꽃무지 유충 (Protaetia brevitarsis larvae)은 동의보감에 간염, 간경화, 피로회복을 포함하여 월경불순, 백내장 등 성인병을 치료하는데 효과가 있다고 기록되어 있다^[13,14]. 또한 올레산 (oleic acid), 팔미트산 (palmitic acid), 팔미톨레산 (palmitoleic acid), 리놀레산 (linoleic acid), 스테아르산 (stearic acid) 등을 함유하고 있어 항암효과가 우수하며 특히 인체 대사 과정에서 생성되는 활성산소종을 중화시키는 항산화 효과에 탁월하다고 알려져 있다[15-17]. 흰점박이꽃무지 유충은 여러 약리적인 효과를 갖추고 있으나 방사선 피폭에 따른 인체 손상에 대한 방사선 방호효과에 관한 연구는 아직 전무한 실정이다.

따라서 본 연구는 흰점박이꽃무지 유충 추출물을 암컷 실험용 쥐 (Sprague-Dawley Rat)에 경구투여하고 방사선 조사에 따른 혈구 및 생식기의 손상을 관찰하여 흰점박이꽃무지 유충 추출물의 방사선 방호효과를 규명하고자 하였다.

Ⅱ. MATERIAL AND METHODS

1. 흰점박이꽃무지 유충 추출물의 준비

흰점박이꽃무지 유충은 무선산 굼벵이 농장 (경남 진주)에서 공급받아 연구의 시료로 사용하였다. 온도 26 ± 1℃, 습도 62.5 ± 2.5% 조건에서 생육한 3령 유충을 절식상태로 배변을 유도한 후 냉동 건조하여 보관하였다. 이후 분쇄하여 얻은 분말시료 50 g과 70% 에탄올 2 L를 혼합하여 3시간 동안 90℃에서 3회 반복하여 추출하였다. 그 후 여과지 (Whatman International Ltd, Maidstone, UK)로 여과하여 획득한 시료를 추출물로 사용하였다.

2. 실험동물 사육

실험동물과 관련한 모든 절차는 동물실험윤리위원회(Institutional Animal Care and Use Committee, IACUC)의 승인 (승인번호: 인제 2020-019호)하에 수행되었다. 실험동물은 생후 4주령 된 암컷 흰쥐 (SD rat) 90마리를 하나바이오(Gyeonggi-do, Korea) 로부터 구입하여 사용하였다. 실험동물은 실내온도 21 ± 2℃, 습도 55 ± 5%, 조명시간 12 h/Day cycle로 일정 조건의 Clean Room(인제대학교 동물자원 센터)에서 사육하였다. 7일간의 검역 순화를 가지며 표준사료와 탈이온수를 자의로 급식할 수 있도록 하였다. 환경 적응기간이 끝난 후 Table 1과 같이 실험군을 편성하고 흰점박이꽃무지 유충 추출물투여군 (PBE Group), 흰점박이꽃무지 유충 추출물 투여 후 방사선조사군(PBE+IR Group), 방사선 조사 후 흰점박이꽃무지 유충 추출물투여군 (IR+PBE Group)은 존대를 이용하여 2주 동안 1일 1회 흰점박이꽃무지 유충 추출물을 경구투여(200 mg/kg) 하였다.

Table 1. Experimental animal group

NC: Normal control

PBE: Protaetia brevitarsis larvae extracts

IR: Irradiation

PBE+IR: Irradiation after protaetia brevitarsis larvae extracts

IR+PBE: Protaetia brevitarsis larvae extracts after irradiation

3. 방사선 조사

실험동물의 방사선 조사는 Fig. 1과 같이 한국원자력연구원 첨단방사선연구소 (전북 정읍)에서 운용중인 저준위 감마선 조사장치인 IR-222 Dry Storage Irradiator (MDS Nordion, Canada)를 사용하였다. 방사선을 정확하게 조사하기 위해서 동물전용 종이 케이스 (60.5 × 32.5 × 23 cm³ )를 이용하여 실험동물을 넣고 선원과 192.5 cm 거리에 위치시킨 후 Co-60 선원 (2208 Ci)의 1.17 MeV, 1.33 MeV 감마선 7 Gy/h의 선량률로 1시간 전신조사하였다.

Fig. 1. IR-222 Dry Storage Irradiator used in SD Rat Irradiation.

4. 표본 채취

혈액 및 조직은 방사선 조사 후 1일, 7일, 21일에 채취하였다. 실험동물을 2% 이소플루레인(Isoflurane)을 사용하여 흡입 마취 시킨 후 복부를 절개하여 복강 대정맥에서 전혈을 채취하였다. 이를 동물용 EDTA 0.5 cc Tube에 보관하고 즉시 Coulter mixer를 이용하여 응고를 방지하였다. 조직은 비장, 자궁, 난소를 적출하여 PBS (Phosphate Buffer Saline)로 세척한 후 10% 포르말린(Formalin)으로 고정시켰다.

5. 혈액학적 분석

채취한 혈액은 혈액응고방지제(Heparin Lithium)가 처리된 EDTA 튜브에 담아 Coulter mixer를 이용하여 15분간 혼합하였다. 혈액은 동물전용혈구분석 기(mindray BC-2800VET, China)를 이용하여 림프구와 적혈구를 분석하였다. 각 군은 개체 당 3회의 혈액검사를 시행하여 총 횟수의 평균값을 이용하였다.

6. SOD(Super Oxide Dismutase) 측정

항산화(SOD) 활성변화를 관찰하기 위하여 SOD Assay kit - WST (Dojindo Inc, Rockville, MD, Japan) 를 사용하여 제공된 매뉴얼 방법에 따라 측정하였다. SD Rat의 정맥을 통해 채취한 혈액은 헤파린 1000 U 0.05mL와 혼합하여 차광 후 4℃에서 600g로 10분간 원심분리한 후 혈청을 제거하였다. 혈구시료와 식염수를 1:1 비율로 섞어 다시 4℃에서 600g로 10분간 원심분리하였다. 이러한 과정을 2회 반복한 후 증류수 4mL, 에탄올 1 mL, 클로로포름 0.6mL를 혼합하여 15분간 교반한 후 다시 4℃에서 600g로 10분간 원심분리하여 혈장을 걷어낸 시료를 사용하였다. 시료를 Dilution buffer로 1, 1/5, 1/5² , 1/5³ , 1/5⁴ , 1/5⁵ , 1/5⁶ 의 비율별로 희석한 후 각 농도별 시료를 20μL씩 넣고 96-well plate에 분주하였다. SOD activity는 ELISA reader (biotek, USA)를 이용하여 450 nm 에서 흡광도를 측정하여 계산하였다.

\(\begin{aligned} \text { SOD activity }(\%) =\frac{[(\text { Ablank1 }-\text { Ablank3 })-(\text { Asample }-\text { Ablank } 2)]}{(\text { Ablank1 }-\text { Ablank3 })} X 100 \end{aligned}\)

7. 조직학적 분석

조직학적 관찰을 위하여 채취한 자궁과 난소는 10 % 포르말린에 고정한 후 실험에 사용하였다. 고정된 조직은 70% 에탄올로 탈수하고, 자일렌 (Xylene)으로 치환하여 파라핀 블록 (Paraffin block)을 제작하였다. 박절한 시료를 염색 (H&E staining)하여 광학 현미경으로 관찰하였다. 비장 지수변화 관찰을 위한 비장은 채취하여 건조시킨 후 무게를 측정하였고, 비장 지수는 (비장무게/체중) x 100으로 계산하였다.

8. 통계학적 분석

실험결과의 통계는 SPSS(IBM SPSS statistics ver. 26) 프로그램을 이용하여 Student's t-test로 분석하였다. 결과값은 평균 ± 표준편차 (Mean±SD)로 표시하였으며 p<0.05 수준에서 각 실험군 간의 유의성을 검정하였다.

Ⅲ. RESULT

1. 혈액학적 변화

방사선 조사 후 1일차에는 Table 2와 같이 림프구의 수치가 IR Group에 비하여 PBE+IR Group (p<0.05)에서 유의하게 증가하였고, 21일차에는 IR Group에 비하여 PBE+IR Group (p<0.01)과 IR+PBE Group (p<0.01)에서 유의하게 증가하였다.

Table 2. Result of Lymphocyte(10³/μL) after 7 Gy Irradiation

^*p<0.05, ^**p<0.01 as compared with IR Group

방사선 조사 후 21일차에는 Table 3과 같이 적혈구의 수치가 IR Group에 비하여 PBE+IR Group (p<0.05)과 IR+PBE Group (p<0.01)에서 유의하게 증가하였다.

Table 3. Result of RBC(10⁶ /μL) after 7 Gy Irradiat ion

^*p<0.05, ^**p<0.01 as compared with IR Group

2. SOD 활성 변화

방사선 조사 후 7일차에는 Table 4와 같이 혈액의 SOD 활성도가 NC Group (79.51±1.68 U/ml)과 PBE Group (80.06±2.38 U/ml)과 비교하여 방사선 조사군인 IR Group (3.08±0.40 U/ml), PBE+IR Group (30.08±2.33 U/ml), IR+PBE Group (29.15±0.51 U/ml)에서 뚜렷하게 감소한 SOD 활성이 나타났다. 방사선 조사 후 21일차에는 혈액의 SOD 활성도는 IR Group (13.75±0.62 U/ml)에 비하여 PBE+IR Group (61.05±0.76 U/ml)과 IR+PBE Group (75.03±2.45 U/ml)에서 NC Group에 가까운 더 높은 SOD 활성이 나타났다.

Table 4. Result of Final SOD Activity(U/ml) of Blood 7 days after 7 Gy Irradiation

^**p<0.01 as compared with IR Group

3. 비장 지수 변화

방사선 조사 후 1일차에는 Table 5와 같이 비장 지수가 IR Group에 비하여 PBE+IR Group (p<0.05)에서 유의하게 증가하여 방사선 방어효과가 나타났고, 21일차 비장 지수는 IR Group에 비하여 PBE+IR Group (p<0.05)과 IR+PBE Group (p<0.01)에서 유의하게 증가하여 방사선 회복효과가 나타났다.

Table 5. Result of Spleen weight(g) after 7 Gy Irradiation

^*p<0.05, ^**p<0.01 as compared with IR Group

4. 자궁, 난소의 조직학적 변화

방사선 조사 후 7일차에 난소는 Fig. 2와 같은 형태로 나타났다. NC Group, PBE Group에서는 세포막이 균일한 형태를 유지하고 있었고 방사선에 조사된 IR Group, PBE+IR Group, IR+PBE Group에서는 난소 세포질의 팽창과 일부 핵의 응축 및 염증 세포가 침윤된 형태가 관찰되었다. IR Group에 비하여 PBE+IR Group에서는 세포질의 팽창과 핵의 응축 등이 다소 감소된 것이 관찰되었다.

Fig. 2. Observation of Rats’ Ovary Cells on H&E Stained by Optical Microscopy.

방사선 조사 후 21일차에 자궁은 Fig. 3과 같은 형태로 나타났다. NC Group, PBE Group에서는 자궁 내막세포의 세포막이 균일한 형태를 유지하고 있었고 방사선에 조사된 IR Group, PBE+IR Group, IR+PBE Group에서는 세포질의 팽창과 세포의 응축으로 세포고사가 일어나 세포수가 감소하는 것이 관찰되었다. IR Group에 비하여 PBE+IR Group, IR+PBE Group에서는 세포질의 팽창과 세포의 응축이 다소 감소된 것이 관찰되었다.

Fig. 3. Observation of rats’ Uterine Cells on H&E Stained by Optical Microscopy.

Ⅳ. DISCUSSION

방사선 및 방사성동위원소는 의료, 공업, 농업, 환경분야 등의 다양한 분야에서 광범위하게 이용되고 있다. 하지만 이를 테러에 악용한다면 공포와 공황 등의 사회적 파장이 클 것으로 예상되고 특히 인체의 장해 또는 부작용이 나타날 우려가 매우 크다. 이에 따라 방사능 테러에 대한 피폭으로부터 피해를 최소화 하기위해 자유라디칼 및 활성산소를 소거하는 물질을 이용한 방사선 방호 연구가 중 요하다. 특히 독성과 부작용이 있는 화학적 합성물이 아닌 천연물질을 이용한 방사선 방호제 연구의 필요성이 부각되고 있다.

본 연구에서는 흰점박이꽃무지 유충 추출물의 방사선 방호효과를 규명하였다. IR Group에서는 SD Rat에 7Gy의 Co-60 감마선을 전신조사하였다. PBE+IR Group은 흰점박이꽃무지 유충 추출물을 14일간 경구투여한 후 감마선을 조사하였으며 IR+PBE Group은 감마선을 조사하고 난 후 흰점박이꽃무지 유충 추출물을 14일간 경구투여하였다. 이후 1일차, 7일차, 21일차에 혈구 성분변화, 항산화효소(SOD) 활성, 비장 지수변화, 조직병리학적인 분석을 하였다.

혈구 성분은 방사선 조사 후 1일차에 림프구에서는 IR Group과 비교하여 PBE+IR Group (p<0.05)에서 유의하게 증가하였고, 21일차에는 IR Group과 비교하여 PBE+IR Group (p<0.01)과 IR+PBE Group (p<0.01)에서 유의하게 증가하였다. 방사선 조사 후 21일차에 적혈구에서는 IR Group과 비교하여 PBE+IR Group (p<0.05)과 IR+PBE Group (p<0.01)에서 유의하게 증가하였다. 이는 방사선 방호 선행연구의 결과와 일치하였다^[10-11]. 특히 아로니아 등의 기존 방사선 방호연구^[6-12]에서는 물질투여 후 방사선을 조사한 군에 대하여 방호효과를 확인하였지만 본 연구에서는 방사선 조사 후 물질을 투여한 군을 추가적으로 설정하였고, 21일차 림프구, 적혈구에서 PBE+IR Group 뿐 아니라 IR+PBE Group에서도 방사선 방호효과를 확인하였다. 이는 방사선에 의해 손상된 조혈면역계가 흰점박이꽃무지 유충 추출물에 의해 회복된 것으로 판단된다.

항산화효소(SOD) 활성도는 방사선 군에서 낮은 활성을 나타내는 기존 선행연구와 유사하였다. IR Group에 비하여 PBE+IR Group (p<0.01)과 IR+PBE Group (p<0.01)에서는 흰점박이꽃무지 유충 추출물이 활성을 증가시켜 방사선 방호효과를 나타낸 것으로 판단된다. 방사선 조사군인 IR Group, PBE+IR Group, IR+PBE Group의 항산화 활성도가 기존 선행연구^[7-10]의 방사선 조사군에 비하여 낮게 나타난 것은 본 연구에서 X-선이 아닌 에너지가 높은 감마선을 조사하였고 수초가 아닌 한 시간 동안 조사하였기에 방사선 조사로 인한 자유라디칼 및 활성 산소가 더 많이 생겨난 것으로 판단된다.

비장은 방사선 조사에 의한 림프구의 괴사, 염증 반응으로 인해 그 무게가 감소하는 경향이 있다^[18]. 따라서 비장지수는 증가함으로써 방사선 방어효과를 나타낸다. 방사선 조사 후 1일차에는 비장 지수가 IR Group에 비하여 PBE+IR Group (p<0.05)에서 유의하게 증가하여 방사선 방어효과가 나타났고 방사선 조사 후 21일차 비장 지수는 IR Group에 비하여 PBE+IR Group (p<0.05)과 IR+PBE Group (p<0.01)에서 유의하게 증가하여 방사선 회복효과가 나타났다. 위 결과로 PBE+IR Group에서는 흰점박이꽃무지 유충 추출물이 방사선 방어기전에 작용하여 방어효과를 나타내었고, IR+PBE Group에서는 방사선으로 손상된 비장이 회복하는데 효과를 나타낸 것으로 판단된다.

난소와 자궁은 방사선에 조사된 IR Group, PBE+IR Group, IR+PBE Group에서는 세포질의 팽창과 일부 핵의 응축 및 염증세포가 침윤된 형태가 관찰되었다. IR Group에 비하여 난소는 PBE+IR Group에서 자궁은 PBE+IR Group, IR+PBE Group에서는 세포질의 팽창과 세포의 응축이 다소 감소된 것이 관찰되었다. 흰점박이꽃무지 유충 추출물은 방사선 조사로 인한 자유라디칼 및 활성산소를 소거하여 방사선으로부터 조직을 방어하며 방사선에 의해 손상된 세포의 복구를 촉진시켜 방사선 방호 효과에 기여하는 것으로 판단된다.

Ⅴ. CONCLUSION

흰점박이꽃무지 유충 추출물의 방사선 방호효과를 확인하기 위해 7 Gy의 Co-60 감마선을 SD Rat 에 조사하여 실험하였다. 흰점박이꽃무지 유충 추출물 섭취 후 방사선 조사를 받은 군 (PBE+IR Group)과 방사선 조사 후 흰점박이꽃무지 유충 추출물을 섭취한 군 (IR+PBE Group)은 방사선 조사만 받은 군 (IR Group)에 비하여 림프구, 적혈구 성분과 비장 지수의 감소가 완화되는 것을 확인하였다. 또한 SOD 활성에서 activity의 증가로 항산화 활성을 확인하였고 자궁, 난소에서는 조직 손상이 완화되는 것을 확인하였다. 이것은 항산화 물질을 함유하고 있는 흰점박이꽃무지 유충 추출물이 방사선 조사로 생성되는 자유라디칼 및 활성산소를 제거하는 방사선 방호기전에 기여하는 것으로 판단된다.

따라서 본 연구는 흰점박이꽃무지 유충 추출물이 방사선 피폭에 따른 방사선 방호효과가 있는 것을 확인하였고 연구의 결과물은 흰점박이꽃무지 유충을 이용한 방사선방호제 연구에 유용한 기초적인 자료로 사용될 수 있을 것으로 사료된다.