Antibacterial Activity and Anti-inflammatory Effect of Methanol Extracts of Saliva miltiorrhiza Against Oral Pathogenic Bacteria

단삼 메탄올 추출물의 구강 병원성 세균에 대한 항균 및 항염증효과

Abstract

This research was conducted to investigate the antibacterial and anti-inflammatory effects of MeOH Ex. of Salvia miltiorrhiza (MESM) against oral pathogenic bacteria. Minimum inhibitory concentration (MIC), removal effect of biofilm produced by Streptococcus mutans, effect of gene expression of proinflammatory cytokines and effect of production of proinflammatory cytokine of MESM were tested. MESM showed moderated antibacterial activity against oral pathogenic bacteria. About 89±8% of biofilms produced by S. mutans were removed by MESM at a concentration of 1 mg/mL. Gene expression of IL-1β and TNF-α induced by Porphyromonas gingivalis were 8~9 folds reduced by MESM. Gene expression of IL-8 induced by Fusobacterium nucelatum were 12 folds reduced by MESM. Production of IL-1β, TNF-α and IL-8 were significantly suppressed by MESM. Conclusively, MESM showed potent antibacterial and anti-inflammatory effect against oral pathogenic bacteria.

충치 및 치주질환은 대표적인 구강 질병이며 주로 구강 병원성세균의 감염에 의해 발생하는 것으로 알려져 있다.^{1, 2)} 충치의 원인균으로 알려진 Streptococcus mutans(S. mutans)는 그람 양성, 조건적 혐기성 세균으로 치아 우식증을 유발하는 대표적인 균이다.³⁾ 치아 표면에 남아있는 탄수화물을 에너지원으로 이용하여 젖산과 개미산을 생성하며 플라크를 생성하여 치아의 법랑질을 녹이고 치아 표면을 부식시켜 치아를 손상시킨다.⁴⁾ 특히 S. mutans 균이 생성하는 생물막(biofilm)은 항생제와 면역세포의 공격 등에 강한 저항성을 가지게 하여 제균을 어렵게 한다. 치주염의 원인균으 로는 Porphyromonas gingivalis(P. gingivalis), Prevodetella intermedia, Fusopbacterium nucleatum subsp. nucleatum(F. nucleatum), Actinobacillus actinomycetemcomitans, Treponema denticola 등이 있다. F. nucleatum는 그람음성 혐기성 세균으로 부착분자(FadA adhesin)를 이용하여 플라크를 생성하고 구내염, 충치, 치은염 및 치주염 발생에 관여한다.⁵⁾ P. gingivalis는 그람 음성 혐기성 세균이며, 잇몸 염증의 원인이 되고 염증의 결과 치조골 파괴를 유도하여 치아손실을 유발한다.²⁾ P. gingivalis는 치주염의 원인이 될 뿐 아니라 심혈관질환, 뇌혈관질환, 동맥경화증, 인슐린저항성 및 알츠하이머 등 구강외에 다른 장기의 질병에도 관여하는 것으로 알려져 있다.^6-8) P. gingivalis는 뼈나 잇몸을 녹이는 강력한 단백질 분해 효소인 gingipain을 만들고, 면역세포로 침투하는 특징을 가지고 있다.²⁾ P. gingivalis의 세포벽 외막 성분인 lipopolysaccharide(LPS)는 Toll Like Receptor(TLR)에 결합해 신호전달 과정을 유도하여 proinflammatory cytokine인 IL-1β, IL-6 및 TNF-α등을 생성한다.⁹⁾ IL-1β는 치주조직 파괴를 강력하게 유도하고, 뼈 흡수 촉진 및 조직파괴 단백질 분해효소의 생성을 유도한다. TNF-α는 파골세포형성 을 자극해서 치조골의 파괴를 촉진하고, 결체조직을 분해할 수 있는 matrix metalloproteinase(MMPs)를 조절하고, 세균 감염에 대한 숙주의 면역반응을 촉진한다.¹¹⁾ IL-6는 파골세포 형성 및 뼈 흡수 촉진, T 림프구 분화를 촉진함으로써 조직 파괴 과정에 관여한다.^{12, 13}⁾ 단삼(Salvia. miltiorrhiza)은 꿀풀과(Lamiaceae) 단삼속(genus Salvia)에 속하는 약초이다. 단삼의 약리작용은 관상동맥확장, 콜레스테롤 저하, 혈압강하, 간기능 활성화, 항염 및 항균작용이 알려져 있다.^14-17) 단삼의 성분 중 하나인 Tanshinone IIA는 파골세포의 분화 억제를 하여 골다공증에 대한 효능을 보여주고 있다.¹⁸⁾ 단삼의 구강병원성 세균에 대한 항균 및 항염증 효과에 대한 일부 연구에 따르면 단삼 물추출물 또는 에탄올 추출물은 물리적으로 치주염을 유도한 동물모델에서 조직파괴 완화 효과 등이 일부 보고되었으나 구강병원성 세균으로 직접 유도한 염증반응에 대한 항염효과에 대한 연구결과는 아직 보고되어 있지 않다.^19-20) 따라서 본 연구에서는 단삼 메탄올 추출물을 시험물질로 구강 병원성 세균에 대한 항균효과, 플라크 제거능 및 사람 치주인대 섬유아 상피세포를 모델로 proinflammatory cytokine의 생성에 대한 항염효과를 보고자 하였다.

재료 및 방법

단삼시료-본 실험에 사용한 단삼시료는 경동한약재시장에서 구입하여 임동술 교수가 검증한 후 85℃, 4시간 메탄올 추출한 추출물[MeOH extracts of Salvia melitirrhioza, (MESM)]을 임동술 교수 연구실에서 지원받아 사용하였다 (수율 9.5%).

세포배양-본 실험에 사용한 충치 및 치주염 원인균은 Streptococcus mutans KCTC3065, Porphyromonas gingivalis KCTC5352, Fusobacterium nucelatun subsp. nucleatum KCTC2640, Prevodetella intermedia KCTC15693균주이며 한국생명공학연구원 생물자원센터에서 분양받아 사용하였다. S. mutans KCTC3065는 Brain Heart Infusion 배지(BHI, Difco, Franklin Lakes, NJ, USA)에 37℃, 5% CO₂ 가 공급되는 환경에서 배양하였으며, P. gingivalis KCTC 5352와 P. intermedia KCTC15693는 BHI배지에 5% 농도의 horse blood를 포함한 배지에, F. nucleatum subsp. nucleatum KCTC2640는 reinforced clostridia medium (Difco, Franklin Lakes, NJ, USA)에 배양하였으며 이 3종의 균은 혐기균이라 혐기배양장치에서 배양하였다. 치주인대 섬유아 상피세포인 YD-38(KCLB #60508)은 한국세포주은행(Korean Cell Line Bank, KCLB, Seoul, Korea)에서 분양받아 사용하였다. RPMI1640 배지(Sigma Co. St. Louis, USA)에 fetal bovine serum(FBS, Sigma Co. St. Louis, USA) 10%, glutamine (300mg/L, Sigma Co. St. Louis, USA), 25mM HEPES (Sigma Co. St. Louis, USA), 25mM NaHCO₃(Sigma Co. St. Louis, USA) 및 penicillin/ streptomycin(Sigma Co. St. Louis, USA)을 첨가하여 37℃, 5% CO₂의 환경에서 배양하였으며, 2일 간격으로 계대배양 하였다

항균력 측정-4종의 구강병원성 세균에 대한 최소저지농도측정은 CLSI(Clinical & Laboratory Standard Institute) guideline에 따라 액체배지 희석법으로 실시하였다.²¹⁾ 단삼의 메탄올 추출물을 1000~0.5µg/mL로 함유한 배지에 S. mutans는 5×10⁵cell/mL 농도로 접종하고 37℃ 24시간 배양 후 균의 성장을 확인할 수 없는 최저 농도를 최소저지농도(Minimum Inhibitory Concentration, MIC)로 결정하였으며, 혐기균 3종은 1×10⁸cells/mL 농도로 접종하고 37℃, 48 시간 혐기배양 후 균의 성장을 확인할 수 없는 최저 농도를 MIC로 결정하였다. MIC를 확인 후 해당 농도의 배양액 각 10µL을 단삼 메탄올 추출물을 함유하지 않은 배지에 접종 후 37℃, 48시간 배양 후 균의 성장을 확인할 수 없는 가장 낮은 농도를 최소살균농도(Minimum Bactericidal Concen- tration, MBC)로 결정하였다. 정도관리를 위해 S. mutans, P. gingivalis는 ampicillin, F. nucleatum, P. intermedia는 moxifloxacin을 사용하여 항균력을 측정하여 본 실험과정과 결과에 대한 정도 관리를 하였다.

S. mutans에 의한 생물막 형성 억제효과-생물막 생성능은 salts solution을 이용하는 방법을 변형하여 실시하였다.²²⁾ S. mutans KCTC 3065를 BHI 액체 배지에 5% CO₂, 37℃에서 24시간 배양 후, S.mutans의 흡광도를 측정 후 균수를 조정하여 10µL(3×10⁷cell)를 MESM을 1~0.125mg/ mL농도로 각각 함유한 190µL의 BHI배지에 접종하고 5% CO₂, 37℃에서 24h 배양하였다. 상등액을 제거한 뒤, 10% formaldehyde(Sigma Co. St. Louis, USA) 200µL를 각 well에 처리하고, 30분 후 제거하였다. 3차 증류수로 3회 세척 후 0.5% crystal violet(Sigma Co. St. Louis, USA) 200µL 을 각 well에 처리 후 30분간 biofilm을 염색하였다. 3차 증류수로 3회 세척 후 isopropyl alcohol 200µL을 각 well에 처리 후 1시간 반응하여 crystal violet이 용출되도록 한 후 용출된 crystal violet을 490nm에서 흡광도를 측정하였다. 이때 아무것도 처리하지 않은 well을 blank로, S. mutans 균만 처리한 well의 biofilm의 흡광도 값을 100%로 환산하여 비교 계산하였다.

세포독성 측정-단삼 메탄올 추출물의 세포독성을 확인하기 위하여 MTT[3-(4, 5-dimethylthiazol-2-yl)-2, 5-dipheny- ltetrazolium bromide](Sigma Co. St. Louis, USA) assay를 실시하였다. 6well plate에 YD-38 cell을 5×10⁵ cells/well 분주하고, 24시간 배양 후 단삼 메탄올 추출물을 100~25µg/ mL 농도로 배양액에 첨가하여 24시간 배양하였다. 배양액을 제거하고 MTT 시약 500µL(0.5mg/mL)를 첨가하여 4시간 동안 반응 후 상등액을 제거하고 1mL의 dimethylsulfoxide (DMSO, Sigma Co. St. Louis, USA)를 첨가하여 5분 동안 추가 반응 후 spectrophotometer(Molecular Devices, VERSA max, USA)를 이용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. 단삼메탄올 추출물을 처리하지 않은 대조군 YD-38 cell의 흡광도 값을 100%로 하여 대조군과 비교하여 90% 이상의 생존율을 보이는 농도는 독성이 없는 농도로 간주하여 세포실험에 사용할 단삼의 농도로 결정하였다.

Proinflammatory Cytokine 유전자 발현억제능-YD-38 cell을 6 well에 5×10⁵cells/well로 분주하여 24시간 배양 후 단삼 메탄올 추출물을 50µg/mL, 25µg/mL 및 10µg/mL 농도로 처리하고 30분 후 P. gingivalis LPS(Pg LPS, InvivoGen, CA, USA)는 10µg/mL 농도로, F. nucleatum subsp. nucleatum(FN)는 YD-38 세포수 대비 100배 많은 세균을 처리하여 염증반응을 유도하였다. 6시간 배양 후 Triazole법을 응용한 Hybrid-R^TM(GeneAll, Seoul, Korea) kit을 이용하여 RNA를 분리하였다. 분리한 RNA 0.1µg을 template로 하여 AccuPower CycleScript RT premix(dT20) (Bioneer, Daejeon, Korea)를 사용하여 cDNA를 합성한 후 IL-1β, IL-6, IL-8 및 TNF-α를 표적으로 Quantitative real- time PCR(qRT-PCR)을 실시하였다. 본 실험에 사용한 PCR primer는 Table I에 나타내었으며, 각각의 primer는 Genotech (Genotech, Daejeon, Korea)에서 합성하여 사용하였다. qRT- PCR 반응은 cDNA 3µL, 각 primer 10pmole 및 Power SYBR Green PCR Mastermix(Life Technologies Pty Ltd, NY, USA) 10µL를 넣고 Nuclease free water 넣어 최종 부피가 20µL가 되도록 하였다. Stepone realtime PCR System (Life Technologies Pty Ltd, NY, USA)을 사용하여 다음과 같은 조건에서 반응하였다. 95℃에서 10분간 변성 후, 95℃ 에서 15초 다시 변성, 60℃에서 60초간 합성을 40회 반복 수행 후 95℃에서 초당 온도를 0.3℃씩 낮추며 생성된 PCR 산물의 melting curve 분석을 실시하였다. 결과 분석은 β- actin을 기준으로 IL-1β, IL-6, IL-8 및 TNF-α를 상대정량분석을 하는 ddCt 분석을 실시하여 분석하였으며, 1.5배 이상의 차이를 유의적인 발현 억제로 판단하였다.

Table I. Primer sequences for qRT-PCR analysis

IL-1β, IL-8 및 TNF-α 단백질 생성량 측정-Pg LPS 및 F. nucleatum 처리한 YD-38 세포에서 proinflammatory cytokine 생성이 단삼메탄올 추출물에 의해 억제되는 것을 확인하고자 human IL-1β ELISA kit, human IL-8 ELISA kit, human TNF-α ELISA kit(Abcam, Cambridge, UK)를 이용하여 다음과 같이 분석하였다. 6 well plate에 well당 YD-38 cell 5×10⁵ 세포를 분주하여 24시간 배양 후 단삼메탄올 추출물을 50μg/mL, 25μg/mL농도로 처리하고 30분 후 Pg LPS 10µg/mL 또는 F. nuceatum을 1:100 비율로 처리하고 IL-1β 분석을 위해서는 8시간, TNF-α와 IL-8 분석을 위해서는 24시간 배양하였다. 배양 상등액을 시료로 하여 제조사에서 제공된 방법에 따라 IL-1β, IL-8 및 TNF-α의 농도를 정량하였다. 제조사에서 제공한 standard IL-1β, IL-8, TNF-α을 이용하여 작성한 검량선에 각 시료의 흡광도 값을 대입하여 IL-1β, IL-8과 TNF-α의 농도를 계산하였다.

통계분석-본 연구의 실험은 3회 반복 실험을 실시하여 평균과 표준 편차로 나타내었으며 각 군간의 통계적 유의성 검정은 Student’s t-test를 사용하면서 ANOVA검정을 하였으며, p<0.05일 때 통계적으로 유의하다고 판단하였다.

결과

항균효과-충치균인 S. mutans 에 대한 단삼 메탄올 추출물의 MIC는 500µg/mL, MBC는 500µg/mL이었고 치주염균인 P. gingivalis에 대한 MIC는 62.5µg/mL, MBC는 250µg/mL이었고 F. nucleatum에 대한 MIC와 MBC는 >1000µg/mL, P. imtermidia에 대한 MIC는 250µg/mL, MBC는 250µg/mL이었다(Table Ⅱ).

Table II. Antibacterial activity of MeOH Ex. of S. miltiorrhiza

충치균 S. mutans의 생물막 형성 억제효과-단삼 메탄올 추출물의 생물막 억제능을 측정한 결과 1mg/mL에서 약 89±8%, 0.5mg/mL에서 55±7%, 0.25mg/mL에서 33±5%의 생물막 생성을 억제하였다(Fig. 1).

Fig. 1. Biofilm removal effect of MeOH Ex. of S. miltiorrhiza (MESM). Values are presented as mean±S.D. *p<0.05, **p< 0.01 compared with control.

YD-38에 대한 단삼메탄올 추출물의 세포독성-단삼메탄올 추출물의 YD-38 세포에 대한 세포독성을 확인하기 위하여 MTT assay를 실시한 결과, 단삼메탄올 추출물은 50µg/ mL(Fig. 2)이하 농도에서 세포독성이 없는 것으로 확인하여 이후 실험은 50µg/mL 이하에서 실시하였다.

Fig. 2. Cytotoxicity of MeOH Ex. of S. miltiorrhiza (MESM) on YD-38 cells. Values are presented as mean±S.D. *p<0.05, **p<0.01 compared with control.

Proinflammatory Cytokine 유전자 발현 및 단백질 생성 억제 효과- YD-38 세포에 Pg LPS를 처리하거나, F. nucleatum을 처리 후 단삼 메탄올 추출물 50µg/mL, 25µg/ mL를 각각 처리하고 6시간 배양 후 YD-38 세포에서 발현되는 IL-1β, IL-6, IL-8 및 TNF-α의 mRNA 발현을 비교하였다. 그 결과 50µg/mL의 단삼 메탄올 추출물을 처리한 결과 Pg LPS에 의해 발현이 유도된 IL-1β는 9배, TNF-α는 8배까지 유전자 발현이 억제되었으며 농도에 의존적으로 발현이 억제되었다(Fig. 3). F. nucleatum 에 의해 발현이 유도된 IL-8은 약 12배 정도 발현이 억제되었다(Fig. 4). 또한 Pg LPS와 함께 단삼메탄올 추출물을 처리하였을 때 생성되는 IL-1β, TNF-α의 농도를 ELISA 법으로 측정한 결과 Pg LPS만 처리한 군에서 IL-1β는 265.23±23.41 pg/mL가 생성되었으나 50µg/mL농도의 단삼메탄올추출물을 처리한 결과 120.34±18.21 pg/mL농도로 약 절반가량 IL-1β의 생성이 감소하였다. 또한 Pg LPS에 의해 150.17±8.91 pg/mL 농도의 TNF-α가 생성되었으나 50µg/mL농도의 단삼메탄올 추출물을 처리한 경우 2.94±0.34pg/mL, 25µg/mL농도의 단삼메탄올 추출물을 처리한 경우 47.05±7.21pg/mL로 TNF-α생성이 효과적으로 감소됨을 확인하였다(Fig. 5). 또 다른 치주염균인 F. nucleatum을 감염 후 IL-8의 생성량을 비교한 결과 감염시 IL-8은 94.87±10.23 pg/mL이었으나 시료를 50µg/mL 처리시 1/3 농도인 35.66±4.57pg/mL, 25µg/mL 처리시 55.92±2.45 pg/mL농도로 단삼메탄올 추출물에 의해 IL-8의 생성도 감소한 것을 알 수 있었다(Fig. 5).

Fig. 3. Effect of MeOH Ex. of S. miltiorrhiza (MESM) on Pg LPS induced expression of IL-1β and TNF-α mRNA in YD38 cells. (A) Fold changes in IL-1β mRNA expression. (B) Fold changes in TNF-α mRNA expression. Values are presented as mean±S.D. *p<0.05, **p<0.01 compared with control.

Fig. 4. Effect of MeOH Ex of S. miltiorrhiza (MESM) on F. nucleatum (FN) induced expression of IL-6 and IL-8 mRNA in YD-38 cells. (A) Fold changes in IL-6 mRNA expression. (B) Fold changes in IL-8 mRNA expression. Values are presented as mean±S.D. *p<0.05, **p<0.01 compared with control.

Fig. 5. Effe ct of MeOH Ex of S. miltiorrhiza (MESM) on Pg LPS induced IL-1β and TNF-α production in YD-38 cell and F. nucleatum (FN) induced IL-8 production in YD-38 cell. (A) Concentration of IL-1β. (B) Concentration of TNF-α. (C) Concentration of IL-8. Values are presented as mean±S.D. *p<0.05, **p<0.01 compared with control.

고찰

구강미생물은 정상균총의 역할을 하는 미생물도 있으나 충치와 치주염의 원인균으로 작용하는 병원성 세균들이 많다. 특히 치주염은 지속적인 세균 감염에 의한 염증성 질환으로 치조골 및 인대를 포함한 치아를 지지하는 조직에 영향을 주어 치아손실로 이어지는 대표적인 구강질환이다.²³⁾ 치주질환은 구강에만 영향을 미치는 것이 아니고 심혈관질환, 뇌혈관질환, 동맥경화, 인지기능 등 전신적으로 다양한 영향을 미치는 질환이다.²⁴⁾ 본 연구에서는 단삼의 구강질환에 대한 효능을 보고자 메탄올 추출물을 시료로 구강병원성 세균에 대한 항균효과와 치주염 원인균 의해 유도된 proinflammatory cytokine에 대한 항염효과를 보고자 하였다. 특히 단삼의 다양한 병원성 세균에 대한 항균 및 항염 효과에 대한 연구 보고는 다양하나 구강 병원성 미생물에 대한 항균 및 치주염에 대한 항염효과에 대한 결과는 미미한 상태로 본 연구에서는 수종의 구강 병원성 세균에 대한 항균효과와 이 균에 의해 유도된 염증반응에 대한 항염효과를 확인하였다. 단삼 메탄올 추출물은 치주염균인 P. gingivalis에 대해서는 62.5µg/mL농도에서 항균효과를 나타내었고 다른 세균들에서는 비교적 높은 농도(500~1000µg/ mL)에서 항균효과를 확인할 수 있었다. 정도관리를 위해 항생제를 양성대조물질로 확인한 결과 ampicillin의 MIC는 1.6μg/mL, moxifloxacin의 MIC는 3.13μg/mL으로 확인되어 단삼 메탄올 추출물의 항균력 측정 실험법의 정당성을 확인하였다. S. mutans ATCC₂₅175(KCTC₃₀65)에 대한 항균효과를 관찰한 문헌에 따르면²⁵⁾ 메탄올 추출물의 MIC값 이 32µg/mL라고 하였으나 본 연구결과에서는 500µg/mL 으로 확인되었다. 한편 단삼의 핵산 분획물에 의한 항균력을 확인한 문헌에 따르면 P. gingivalis에 대한 MIC 값은 150µg/mL, F. nucelatim에 대한 MIC는 250µg/mL으로 보고되었으나 이는 메탄올 추출물이 아닌 결과라 직접 비교는 어렵다. 하지만 본 연구 결과 대표적인 치주염균이 P. gingivalis에 대한 MIC값이 62.5µg/mL로 확인된 것은 매우 의미있는 결과이다.²⁶⁾ S. mutans가 형성하는 생물막(Biofilim) 은 플라크의 주요 원인이 되는데 단삼 메탄올 추출물에 의한 플라크제거능은 1mg/mL에서 약 89±8%, 0.5mg/mL농도에서 약 55±7%로 확인되어 플라크 제거에 효과가 있을 것으로 판단된다. 구강 병원성 세균에 의한 염증반응에 대한 단삼의 항염 효과를 보기 위해 상업적으로 구입 가능한 Pg LPS와 F. nulceatum 균체를 치주인대 섬유아 상피세포에 처리하여 염증반응을 유도 후 단삼 메탄올 추출물의 항 염효과를 확인하였다. 문헌에 따르면 단삼의 치주염에 대한 항염효과를 확인한 연구 결과는 실험동물의 어금니에 물리적으로 실을 감아 염증을 일으키고 그에 대한 항염효과를 확인한 연구 보고는 있으나 치주염 원인균으로 직접 유도한 염증반응에 대한 단삼의 항염효과에 대한 연구보고는 없다.^{19, 20)} 치주염의 경우 원인균에 의해 유도된 proinflammatory cytokine인 IL-1β, TNF-α 및 IL-6등에 의해 염증반응이 유도되고 그 결과 치주 조직의 손상 및 치아손실을 가져오는 것으로 알려져 있다.^{27, 28)} 특히 1L-1β와 TNF-α는 치조골의 파괴에 매우 중요한 역할을 하는 싸이토카인으로 알려져 있다.²⁷⁾ 본 연구에 따르면 단삼의 메탄올 추출물은 Pg LPS에 의해 유도된 1L-1β와 TNF-α의 유전자 발현을 각각 9배, 8배 감소시켰으며(Fig. 3), ELISA 분석결과 1L-1β는 약 1/2 정도 생성이 억제되었고 TNF-α생성은 Pg LPS만 처리한 군에서는 150.17±8.91pg/mL었으나 50μg/mL농도의 단삼 메탄올 추출물을 처리한 경우 2.94±0.34 pg/mL만이 생성되 매우 효과적으로 TNF-α의 생성을 억제하는 것을 확인하였다(Fig. 5). 하지만 IL-6와 IL-8의 유전자 발현은 Pg LPS에 의해 유의미하게 증가하지 않았다(data was not shown). 이러한 결과는 Stathopoulou등의 연구 결과인²⁹⁾ 사람의 치주 상피세포에 P. gingivalis를 처리하였을 때, IL-1β는 유의적으로 증가하였으나 IL-6와 IL-8은 유의적으로 증가하지 않았다는 결과와도 일치한다. 이상의 결과를 볼 때 단삼의 메탄올 추출물은 치주염 원인균인 P. gingivalis에 의해 유도된 IL-1β, TNF-α의 생성을 효과적으로 억제함으로 항염작용 및 치조골의 손상을 보호할 수 있는 효과가 있음을 알 수 있었다. 이러한 결과는 그 원인은 다르지만 단삼이 골다 공증에 효과가 있는 연구 결과와도 일치하는 것으로 볼 수 있다.³⁰⁾ 또 다른 치주염의 원인 세균인 F. nucleatum에 의해서 유의적으로 발현이 증가된 IL-8은 단삼 메탄올 추출물에 의해 그 유전자 발현이 약 12배 가량 감소하였고, IL-6는 그 유전자 발현이 약 5배 정도 억제되었음을 알 수 있었다(Fig. 4). ELISA 분석을 통한 IL-8의 농도를 비교한 결과 균 감염 시 94.87±10.23pg/mL이었으나 단삼 메탄올 추출물을 50μg/ mL 처리시 1/3 농도인 35.66±4.57 pg/mL농도로 단삼 메탄올 추출물에 의해 IL-8의 생성도 유의미하게 감소한 것을 알 수 있었다(Fig. 5). Stathopoulou등의 연구 결과에서도²⁹⁾ F. nucleatum에 의해서는 IL-8의 발현이 유의미하게 증가한다고 기술하고 있어 본 연구 결과와 일치한다. 단삼 메탄올 추출물은 치주염균에 의해 유도되는 proinflammatory cytokine인 IL-1β, TNF-α 및 IL-8의 생성을 억제하여 항염 및 치조골 손상을 억제할 수 있는 것으로 사료된다. 이러한 결과를 종합하여 볼 때 단삼의 메탄올 추출물은 구강병원성 세균에 기인한 플라크 생성억제 효과가 있는 녹차성분이나, 항염효과가 있는 꿀에서 얻은 polyphenol 성분이 구강세정제나 치약으로 사용되고 있는 것처럼^31-33) 구강건강 기능성 제품에 적용 가능성이 있는 것으로 사료된다.

결론

단삼 메탄올 추출물이 구강 병원성 세균에 대한 항균 및 항염효과가 있음을 확인하였다. 대표적 치주염 균인 P. gingivalis에 대한 MIC는 62.5µg/mL로 유의미한 항균효과를 나타내었으며, S. mutans가 생성한 생물막은 단삼메탄올 추출물 1mg/mL농도에서 약 89±8%가량 제거됨을 확인하였다. Pg LPS로 유도한 proinflammatory cytokine인 IL-1β 및 TNF-α 유전자 발현은 각각 약 9, 8배 억제되었으며 F. nucleatum으로 유도한 proinflammatory cytokine인 IL-8의 유전자 발현은 약 12배 감소하였으며 해당 싸이토카인의 생성도 효과적으로 억제하였다. 따라서 단삼메탄올 추출물은 구강병원성 세균에 대한 항균 및 항염증효과를 보유한 천연물로 구강건강기능성을 보유한 세정제나 치약의 성분으로 사용될 가능성을 확인하였다.