The Effect of Carex dispalata Extract on the Activation of Anagen Pathway

삿갓사초 추출물의 모발 성장 기전 활성화 효과

Abstract

Dermal papilla cells (DPCs) are present throughout the hair cycle and play an essential role in hair cycle and hair growth. In this study, we investigated the effect of Carex dispalata on the activation of anagen pathway in DPCs. C. dispalata extract increased the proliferation of DPCs and induced changes in the levels of cell cycle-related proteins. To elucidate the mechanism by which C. dispalata extract stimulates the anagen pathway related to the proliferation of DPCs, we evaluated the effect of C. dispalata extract on the activation of Akt signaling. The increase in the level of phospho-Akt by C. dispalata extract was inhibited by PI3K inhibitor (wortmannin). Wortmannin reduced the effects of C. dispalata extract on the levels of cell cycle-related proteins and proliferation of DPCs. C. dispalata extract increased the levels of Wnt/β-catenin proteins. Wnt/β-catenin inhibitor (XAV939) inhibited changes in cell cycle, cell cycle-related proteins, Wnt/β-catenin proteins, and proliferation induced by C. dispalata extract. C. dispalata extract increased the level of autophagy protein (LC3I/II), and this change was inhibited by XAV939. These results suggest that C. dispalata extract can activate PI3K/Akt, Wnt/β-catenin, and autophagy pathways in DPCs to induce cell proliferation, and thereby promote hair growth phase.

탈모는 머리부위를 포함한 신체의 모발이 가늘어지며 감소하는 증상으로, ^{1, 2)} 남성호르몬 불균형, ³⁾ 스트레스, ⁴⁾ 항암제⁵⁾ 및 모유두세포의 기능 저하 등^{1, 6)}의 다양한 원인들로 인해 발생됨이 알려져 있다. 수십년간의 연구에도 불구하고 미국식품의약국(Food and Drug Administration, FDA) 승인을 받아 사용되는 약물로는 finasteride(Propecia^®) 및 minoxidil (Rogain^®)가 있다. Finasteride는 type II 5α-reductase의 활성을 억제하여 testosterone(T)에서 dihydrotestosterone(DHT)로의 전환을 저해한다. 최초에 전립선 비대증 치료제로 개발되었으나 안드로겐성 탈모를 개선함이 알려져 있다.⁷⁾ Minoxidil은 고혈압치료제로 개발되었고, 모발성장을 증가하는 요인은 불분명하지만 ATP-sensitive potassium channel(K_ATP 채널) 개방효과^{8, 9)} 모유두세포의 apoptosis 저해 및 증식 증가, ^{10, 11)} Wnt/β-catenin 경로의 활성화¹²⁾ 등의 다양한 작용을 통해 육모 효과를 나타내는 것으로 여겨지고 있다.

성장기, 퇴행기 및 휴지기의 모발주기 조절은 모발 성장촉진 및 억제와 관련되며, 모발내의 다른 세포들과 달리 모발 주기 동안 지속적으로 유지되는 모유두세포는 모발내의 matrix cells, hair germ cells 및 stem cells과 상호작용하여 모발 주기의 진행에 관여함이 알려져 있다.^{13, 14)} 세포증식은 세포주기의 조절과 관련되며, G0/G1, S 및 G2/M 기로 구분되는 세포주기의 진행은 세포주기 조절 단백질들(cyclin D1, Cdc2 p34 및 p27^kip1)의 변화를 동반함이 알려져 있다.^{15, 16)} 탈모치료제인 minoxidil은 모유두세포에서 Wnt/β-catenin 신호전달의 활성화를 통해 모발주기의 퇴행기로 진행을 저해하며, ¹²⁾ Akt 신호전달의 활성화를 통해 모유두세포의 apoptosis 저해 효과를 나타냄이 알려져 있다.¹⁰⁾ 세포주기 단백질인 cyclin D1은 Wnt/β-catenin 신호전달의 target 유전자로, G0/ G1기에서 S기로 진행될 때 증가됨이 보고되었다.¹⁶⁾ 최근 autophagy가 모발주기 조절에 관련됨이 알려져 있다. 모낭배양 모델에서 autophagy의 억제가 모발주기의 퇴행기를 유도하며, ¹⁷⁾ 모유두세포의 증식에 autophagy의 활성화가 연관됨이 알려져 모발성장 조절에 필요함이 보고되었다.¹¹⁾

삿갓사초(Carex dispalata)는 사초과(Cyperaceae) 사초속(Carex)에 속하는 습지주변에 자라는 여러해살이풀로, 우리나라(경기도, 전라남도, 경상남도, 제주도), 일본, 중국 및 러시아 등에 분포한다. 사초속 식물중 좀보리사초(Carex pumila) 추출물의 알레르기 반응 억제 효과 및 가는잎그늘사초(Carex humilis)로부터 분리된 (+)-alpha-viniferin의 cyclooxygenase 억제 및 관절염 억제 효과가 보고되어 있다. 하지만 삿갓사초에 대한 연구는 하수정화 효과에 대한 연구외에²⁰⁾ 삿갓사초로부터 분리된 성분 등의 과학적인 근거가 부족한 실정이며, 특히 삿갓사초의 육모 효능에 대한 연구는 전무한 상태이다.

본 연구에서는 모발의 성장에서 중요한 역할을 하는 모유두세포에서 삿갓사포의 효능 및 작용기전을 조사하여 이를탈모방지제 및 치료제로 이용할 수 있는 근거를 제시하고자 하였다.

재료 및 방법

삿갓사초 추출물의 제조 − 실험재료인 삿갓사초(Carex dispalata)는 경상북도 안동시 풍천면 부근에서 채취 후 국립낙동강생물자원관 김선유 연구원이 동정하였고, 증거 표본(NNIBRVP70279)은 국립낙동강생물자원관에 보관되어있다.

삿갓사초 추출물을 다음과 같이 제조하였다. 삿갓사초 지상부 건조 분말(30 g)에 20배 중량의 99.9% ethanol로 실온에서 24 시간 동안 3회 추출하였다. 여과한 여액을 rotary vacuum evaporator(EYELA, Japan)로 농축 후 동결건조하여 얻은 추출물(2.8g)을 실험 때까지 –20℃에 보관하여 사용하였다. 삿갓사초 추출물은 dimethyl sulfoxide(DMSO, Sigma-Aldrich, MO, USA)로 녹여 실험에 사용하였으며, DMSO의 최종 농도는 0.2%를 초과하지 않도록 하였다.

세포배양 − 흰쥐 수염에서 분리된 모유두세포를 불멸화한 세포(Rat vibrissa immortalized dermal papilla cell)를 10% heat-inactivated fetal bovine serum(FBS; Gibco Inc, NY, USA)와 1% penicillin-streptomycin(Gibco Inc, NY, USA)이 함유된 DMEM(Hyclone Inc, UT, USA) 배지를 사용하여 37℃, 5% CO₂ 항온기에서 배양하였다.

세포증식 효능 − 96 well plate에 모유두세포(2.0×10³ cells/ well)를 1% FBS-DMEM 배지에 혼탁하여 넣어 24 시간 전 배양 후 삿갓사초 추출물(0.1, 1 및 10 μg/mL)을 처리하였다. Inhibitors(wortmannin 또는 XAV939) 처리 실험에서는, 10 nM의 Wortmannin(Invitrogen, CA, USA) 또는 5 μM의 XAV939(Tocris Bioscience, Bristol, UK)을 2 시간 전처리후 삿갓사초 추출물(0.1 μg/mL)을 처리하였다. 양성 대조군으로 minoxidil(Sigma, MO, USA)을 10 μM의 농도로 처리하였다. 모유두세포의 증식은 water-soluble tetrazolium (WST) assay kit(Daeil Lab Service, Seoul, Korea)를 이용하여 측정하였다. 72시간 동안 배양한 후 각 well 당 10 μL의 WST soution를 넣고 Vermamax microplate reader(Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)를 사용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하였다. 각군에 대한 평균 흡광도 값을 구하였으며, 대조군의 흡광도 값과 비교하여 증식 정도를 조사하였다.

Cell cycle analysis − 모유두세포(5.0×10⁵ cells/60 mm dish)를 1% FBS-DMEM 배지로 24 시간 동안 전 배양하였다. 그후 XAV939(5 μM)을 2 시간 전처리하고 삿갓사초 추출물(0.1μg/mL)을 24 시간 동안 처리하여 배양하였다. 세포를 PBS로 2회 세척한 후 2 시간 동안 70% Ethanol로 고정되었다. 세포를 PBS로 2회 세척하였고, RNase A(50 μg/mL) 반응 후 PI(10 μg/mL)로 37℃에서 30분 동안 염색되었다. 세포는 Cell Quest Software를 이용하여 FACSCalibur (Becton-Dickinson, CA, USA)로 분석되었다.

Western blot analysis − 모유두세포(5.0×10⁵ cells/60 mm dish)를 1% FBS-DMEM 배지로 24 시간 동안 배양 후, 삿갓사초 추출물(0.1 μg/mL) 및 minoxidil(10 μM)을 24 시간 동안 처리하여 배양하거나, 삿갓사초 추출물(0.1 μ g/mL)을시간별(0, 0.25, 0.5 및 1 시간 또는 0, 0.5, 1 및 2 시간) 로처리하여 배양하였다. Inhibitors 처리 경우, wortmannin(10 nM) 또는 XAV939(5 μM)을 2 시간 전처리하고 삿갓사초 추출물(0.1 μg/mL)을 1 또는24 시간 동안 처리하여 배양하였다. 세포를 수확하여 PBS로 2회 세척후, 100 μL의 PRO- PREP protein extraction buffer(iNtRON biotechnology, Seoul, Korea)를 넣어 4℃에서 1 시간 동안 lysis 시켰다. Cell lysate 는 원심분리(15, 000 rpm, 15분)하여 상층액을 얻어 -20℃에 보관하였다. 단백질 농도는 bovine serum albumin를 표준물질로 사용하여 Bradford method에 의하여 정량하였다. 15- 20μg의 lysate를 8-12% Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis(SDS-PAGE)로 변성 분리한 후 polyvinylidene fluoride membranes(Bio-Rad, Hercules, CA, USA)으로 transfer하였다. Membrane의 5% non-fat dried milk가 함유된 Tween-20-TBS(T-TBS)(0.1% Tween-20, 50mM Tris, pH 7.6, 150mM NaCl) 용액에서 90분 동안 blocking되었다. 단백질의 발현을 조사하기 위해 membrane은 cyclin D1(1:1000), phospho-pRB(1:1000), cdc2 p34(1:2000), p27^kip1(1:1000), phospho(ser473)-Akt(1:1000), Akt(1:1000), phospho(ser9)- GSK3β(1:1000), GSK3β(1:1000), phospho(ser552)-β-catenin (1:1000), phospho(ser675)-β-catenin(1:1000), β-catenin(1:1000), Axin(1:1000), LC₃I/II(1:1000), β-actin(1:5000) 및 α-tubulin (1:500)에 대한 primary antibody로 4℃에서 overnight 반응되었다. Horse Radish Peroxidase가 결합된 secondary antibody (anti-rabbit IgG, anti-mouse IgG)를 1:10000으로 희석하여 90분 동안 상온에서 반응되었다. Westar Nova 2.0 ECL solution(Cyanagen, Bologna, Italy)을 이용하여 암실에서 Xray film(AGFA, Mortsel, Belgium)에 감광 후 단백질 발현을 확인하였다.

통계분석 − 모든 실험결과는 평균 ± 표준편차로 나타내었고, 통계처리는 Sigma Stat software(Jandel Scientific Software, USA)를 사용하였다. 통계학적 유의성 검정은 unpaired student’s t-test를 사용하여 유의성(p-value<0.05)을 인정하였다.

결과 및 고찰

본 연구에서는 삿갓사초 추출물이 모발주기의 조절자인 모유두세포에서 모발성장 기전을 활성화하는지 조사하여, 탈모완화 소재로서 삿갓사초 추출물의 사용가능성을 알아보고자 하였다.

모발성장을 조절하는 작용기전이 불분명함에도 불구하고, 모낭내부의 모유두세포는 중배엽 유래의 세포로써 모기질 세포(matrix cells) 및 stem cells와 상호작용을 통해 성장기, 퇴행기 및 휴지기의 모발주기의 진행을 조절하여 모발 성장을 촉진함이 알려져 있다.^{13, 14)} 삿갓사초 추출물이 모발성장 효과와 관련된 모유두세포의 증식 효능을 나타내는지 알아보고자 삿갓사초 추출물(0.1, 1 및 10 μg/mL)을 3일동안 처리하여 모유두세포 증식 효능을 조사하였다. 그 결과, 0.1 μg/mL 의 농도에서 대조군(100±5.5%)에 비하여 각각 18.9±9.8% (P<0.001) 정도 모유두세포의 증식을 증가시켜 양성대조군인 minoxidil(10 μM)의 10.0±5.9%(P<0.01) 보다 다소 높은 모유두세포 증식 증가 효과를 나타내었다(Fig. 1A). 하지만, 1 및 10 μg/mL 의 농도에서는 모유두세포의 증식에 영향을 나타내지 않음이 관찰되었다(Fig. 1A). 또한 효과를 나타낸 농도보다 낮은 농도인 0.01 μg/mL의 농도에서는 3.8±5.6% 정도로 세포증식 효과를 나타내지 않았으며, 고농도인 100 μg/mL의 농도에서는 세포 독성을 나타냄을 확인하였음(data not shown). 세포증식 및 세포사멸은 세포주기의 진행 및 세포주기 관련 단백질의 발현 변화를 동반하며, ^{15, 16)} 모유두세포에서 minoxidil은 세포주기 단백질들(cyclin D1, cdc2 p34 등)의 발현 변화를 통해 세포증식을 증가함이 알려져 있다.¹⁹⁾ 삿갓사초 추출물에 의한 모유두세포의 증식 증가가 세포주기 조절 단백질의 발현 조절을 통해 일어나는지 조사하였다. 삿갓사초 추출물(0.1 μg/mL) 및 minoxidil(10 μM)을 모유두세포에 24시간 처리하였을 때, 삿갓사초 추출물과 minoxidil에 의한 cyclin D1 및 cdc2 p34의 발현 증가가 관찰되었다(Fig. 1B). 또한 삿갓사초 추출물은 p27^kip1의 발현을 감소시킴을 확인할 수 있었다(Fig. 1B). 이러한 결과들은 삿갓사초 추출물이 세포주기 단백질의 발현 조절을 통해 모유두세포의 증식 증가 효능을 나타냄을 보여준다. 이전 연구에서 우리는 밀기울의 성분인 vanillic acid가 세포증식의 주요 조절자인 Akt의 인산화 증가를 통해 모발성장기 유도와 관련된 모유두세포의 증식을 유도함을 보고하였다.²¹⁾ Fig. 2A에서 보는 바와 같이, 삿갓사초 추출물은 Akt의 인산화 증가를 유도하였다. PI3K/Akt inhibitor인 wortmannin(10 nM)을 전처리 후, 삿갓사초 추출물(0.1μg/mL)을 처리하여 확인한 결과 삿갓사초 추출물 처리에 의한 모유두세포의 증식 증가, phospho(Ser473)-Akt level의 증가, cyclin D1 및 cdc2 p34 level 증가 모두 wortmannin 처리에 의해 저해되었다(Fig. 2B-D). 이러한 결과들은 삿갓사초 추출물이 모유두 세포에서 모발성장기 기전인 PI3K/Akt 신호전달을 활성화하여 모발성장에 기여함을 시사한다.

Fig.1.Carex dispalata extract increases the proliferation of dermal papilla cells. (A) The proliferation of dermal papilla cells (DPCs) exposed to C. dispalata extract (0.1, 1 and 10 μg/mL) or minoxidil (10 μM) are shown at 72 h. Data are presented as the mean ± SD from three independent experiments. ***p<0.001 vs. vehicle-treated control. (B) Immunoblot analysis of cell cycle-associated proteins on DPCs stimulated with C. dispalata extract (0.1 μg/mL) or minoxidil (10 μM) for 24 h. NT, not treated; DMSO, dimethyl sulfoxide.

Fig. 2. C. dispalata extract promotes the proliferation of DPCs by altering cell cycle-associated proteins through activation of PI3K/Akt pathway. (A) The time course change of phospho (Ser473)-Akt level by C. dispalata extract in DPCs at 0-2 h. (B) The proliferation of the DPCs exposed to C. dispalata extract (0.1 μg/mL) in the presence or absence of wortmannin (10 nM) for 72 h was determined by WST assay. **p<0.01 vs. vehicle-treated control; ^†††p<0.001 vs. C. dispalata extract alone. (C) The level of phospho (Ser473)-Akt induced by C. dispalata extract (0.1 μg/mL) with or without wortmannin(10 nM) at the indicated time. (D) Immunoblot analysis of cell cycle-associated proteins on DPCs stimulated with C. dispalata extract (0.1 μg/mL) in the presence or absence of wortmannin (10nM) for 24h.

Wnt/β-catenin 신호전달 경로는 세포증식, 모발재생 및 모발 성장을 포함하는 다양한 기능과 관련됨이 알려져 있다.^{12, 22)} 특히 인간 모유두세포에서 minoxidil은 PKA 및 Akt의 인산화를 유도할 뿐만 아니라Wnt/β-catenin 신호전달에 관련된 glycogen synthase kinase3β(GSK3β)의 인산화를 통한 β- catenin 발현 증가를 통해 모발주기의 성장기를 연장함이 보고되었다.¹²⁾ 삿갓사초 추출물(0.1 μg/mL)을 모유두세포에 0~2시간 동안 처리하였을 때, 0.5 시간 이후부터 phospho (Ser9)-GSK3β, phospho(Ser552)-β-catenin 및 phospho (Ser675)-β-catenin의 levels이 증가됨을 관찰하였다(Fig. 3A). Wnt/β-catenin inhibitor인 XAV939(5 μM)을 전처리 후, 삿갓사초 추출물(0.1 μg/mL)을 처리하여 확인한 결과 삿갓사초 추출물에 의한 모유두세포 증식 증가뿐만 아니라 S기 및 G2/M기 세포수 증가 같은 세포주기의 변화들 모두 XAV939 처리에 의해 저해됨을 관찰하였다(Fig. 3B-C). Wnt/β-catenin 신호전달의 주요 단백질인 β-catenin은 adenomatous polyposis coli(APC), Axin 및 GSK3β로 구성되는 destruction complex 에 의해 분해되며, Wnt 단백질의 수용체 결합 등에 의해 β- catenin의 안정화를 통해 target 유전자의 발현을 조절한다.^{12, 23)} XAV939는 Axin의 안정화를 통해 β-catenin의 분해를 촉진하고 결국 Wnt/β-catenin 신호전달을 저해함이 알려져있다.²³⁾ Fig. 3D에서 보는 바와 같이, 삿갓사초 추출물에 의한 β-catenin의 level 증가는 XAV939에 의해 저해되었으며, 이는 XAV939에 의한 Axin의 level 증가로 발생됨을 확인하였다. 이러한 결과들은 이전의 minoxidil에 대한 연구결과와 유사하게, ¹²⁾ 삿갓사초 추출물이 모유두 세포에서 모발성장기 기전인 Wnt/β-catenin 신호전달을 활성화하여 모유 두세 포의 증식 효능을 나타냄으로써 모발성장에 기여함을 시사한다.

Fig. 3. C. dispalata extract promotes the proliferation of DPCs by activation of the Wnt/β-catenin pathway. (A) The time course change of Wnt/β-catenin proteins levels by C. dispalata extract in DPCs at 0-2 h. (B) The proliferation of the DPCs exposed to C. dispalata extract (0.1 μg/mL) in the presence or absence of XAV939 (5 μM) for 72 h was determined by WST assay. **p<0.01 vs. vehicle-treated control; ^†††p<0.001 vs. C. dispalata extract alone. (C) Quantitative comparison of cell cycle distribution induced by C. dispalata extract (0.1μg/mL) in the presence or absence of XAV939 (5 μM) for 24 h. (D) Immunoblot analysis of Wnt/β-catenin proteins and cell cycle-associated proteins on DPCs stimulated with C. dispalata extract (0.1 μg/mL) in the presence or absence of XAV939 (5μM) for 24 h.

Autophagy는 다양한 스트레스에 대한 항상성을 유지하는 과정이며, 초기에 LC₃I에서 LC₃I/II로의 전환이 일어나는 autophagosome 형성과정 이후 autolysome이 형성되어 내부물질을 분해한다.²⁴⁾ 최근 배양된 모낭을 이용한 연구에서 autophagy가 모발주기의 성장기에 필수적인 역할을 함이 알려졌다.^{11, 17)} 삿갓사초 추출물의 효능이 autophagy 신호전달을 조절하는지 확인하기 위해 삿갓사초 추출물(0.1 μg/mL)을 모유두세포에 0~2시간 동안 처리한 결과, 1 시간 이후부터 LC₃I/II level이 증가됨을 관찰되었다(Fig. 4A). 한편 Wnt/β- catenin 신호전달과 autophagy와의 관련성은 아직까지 불분명하며 몇몇 상반된 연구결과들 만이 알려져 있다. 다발성골수종에서 β-catenin의 억제는 autophagy를 유도한 반면, ²⁵⁾간암세포에서 autophagy의 유도는 Wnt/β-catenin 신호전달을 활성화함이 알려져 있다.²⁶⁾ 따라서 우리는 삿갓사초에 의한 autophagy 유도가 Wnt/β-catenin 신호전달 경로와 관련이 있는지 조사하였다. Wnt/β-catenin inhibitor인 XAV939(5 μ M)을전처리 후, 삿갓사초 추출물(0.1 μg/mL)을 24 시간 동안 처리하여 확인한 결과 삿갓사초 추출물에 의한 LC₃I/II level 증가는 XAV939 처리에 의해 저해되었다(Fig. 4B). 하지만 삿갓사초 추출물의 어떤 활성성분이 모유두세포의 증식을 유도하며 모발주기의 조절에 관련된 다양한 신호전달경로에 대한 조절 여부는 추후 연구를 통해 규명해야 할 필요가 있으리라 여겨진다. 이러한 결과들은 삿갓사초 추출물이 Wnt/β-catenin 신호전달을 경유하여 autophagy를 활성화함으로써 모발성장에 기여함을 시사한다.

Fig. 4. C. dispalata extract induces autophagy in DPCs. (A) The time course change of autophagy protein (LC3I/II) level by C. dispalata extract in DPCs at 0-2 h. (B) Immunoblot analysis of LC3I/II on DPCs stimulated with C. dispalata extract (0.1μg/mL) in the presence or absence of XAV939 (5μM) for 24h. NT, not treated; DMSO, dimethyl sulfoxide.

결론

삿갓사초 추출물이 모유두 세포에서 모발성장기 기전인 PI3K/Akt, Wnt/β-catenin, autophagy 신호전달 경로를 활성화하여 모발성장의 주요 조절자인 모유두세포의 증식 효능을 나타내었다. 이러한 결과들은 삿갓사초 추출물이 탈모증 상의개선 및 예방에 이용될 수 있다는 근거를 제시하는 것이다.